Az Angelica Sinensis Cistanche rostvegyület hatékonysága és mechanizmusai a székrekedés enyhítésére

Absztrakt:Székrekedésegy elterjedt betegség, amely jelentősen befolyásolhatja az emberek életminőségét, és növelheti a kapcsolódó betegségek kockázatát. Ebben a vizsgálatban a krónikus székrekedés egérmodelljét loperamid-hidrokloriddal hozták létre. Az egereknek egy Angelica sinensis Cistanche Fiber Compoundot szondáztak, amely Dang Gui-ból [Angelica sinensis (Oliv.) Diels],Rou Cong Rong (Cistanche deserticolaY.C.Ma), búzarost és kis molekulatömegű xilán nagy dózisban (3,6 g·kg-1, 30szerese az ajánlott humán dózisnak) és alacsony dózisban (0,6 g·kg{{8}) }, az ajánlott humán dózis 5-szöröse) 14 napig. A vizsgálat során a vegyület terápiás hatékonyságát a széklet morfológiájának megfigyelésével, víztartalom mérésével és vékonybél-motilitási kísérletekkel értékelték. Ezenkívül enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatokat (ELISA) végeztek a gyomor-bélrendszeri hormonok, köztük a motilin (MTL), a gasztrin (GAS), az interleukin-1 (IL-1) gyulladásos faktorok és a tumornekrózis faktor szérumszintjének értékelésére. - (TNF-). H&E festéssel végzett hisztopatológiai vizsgálatot alkalmaztak a vastagbél szöveti károsodásának értékelésére. Ezenkívül Western blot és immunhisztokémiai kísérleteket végeztek az akvaporin -3 (AQP3) és c-Kit expressziós szintjének vizsgálatára a vastagbélben. Az eredmények azt mutatták, hogy az Angelica sinensis Cistanche Fiber Compound javíthatja a széklet morfológiáját, növelheti a széklet víztartalmát és fokozhatja a vékonybél áthaladási sebességét egereknél. Ezenkívül a gasztrointesztinális hormonok szérumszintje jelentősen megemelkedett, és a gyulladásos faktorok szintje jelentősen csökkent. A vastagbél kórszövettani károsodásának javulását a vastagbél vízcsatorna fehérje AQP3 expressziójának jelentős csökkenése és a c-Kit expresszió jelentős növekedése kísérte. Ezek az eredmények együttesen a dózis-válasz összefüggés jelenlétére utaltak. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az Angelicasinensis Cistanche Fiber Compound hatékonyan enyhíti az egerek székrekedését. Hatása összefügg a vastagbél vízcsatorna fehérje AQP3 és c-Kit expressziójának szabályozásával, valamint a szérum gyulladásos faktorok és a gyomor-bélrendszeri hormonok modulációjával. Ezt a kísérletet a Jinan Egyetem ÁllatkísérletekEtikai Bizottsága hagyta jóvá.

Kulcsszavak:székrekedés; bélkenés és székrekedés enyhítése; funkcionális élelmiszerek; kettőspont; hagyományos kínai orvoslás

MENNYI IDEIG TELJES, HOGY MŰKÖDIK A CISTANCHE?

Székrekedésegygyakori gyomor-bélrendszeri betegség. The global prevalence of constipation in the elderly (>60 évesek) 18,9%[1], és a prevalencia gyakran magasabb a nőknél[2]. Nehéz székletürítés és gyakori székrekedés jellemzi. a széklet csökkenése és megkeményedése stb., ami fizikai kényelmetlenséghez és gyomor-bélrendszeri diszfunkcióhoz vezet, sőt az életminőséget súlyosan befolyásoló gyomor-bélrendszeri betegségeket, szív- és érrendszeri betegségeket [3] stb. A hagyományos kínai orvoslás receptjeit széles körben alkalmazzák a székrekedés enyhítésére, és jó és határozott klinikai hatást fejtenek ki [4,5]. A tanulmányban használt Angelica és Cistanche deserticola rostvegyületet Cistanche deserticola, Angelica sinensis, búza rostból és xylooligoszacharidokból állítják elő. A Cistanche deserticola és az Angelica sinensis két általánosan használt hagyományos kínai gyógyszer hashajtókban, amelyek szabályozzák a bélműködést és javítják a székrekedést. [6-9], két hagyományos kínai gyógyszer eredete ugyanaz, mint a gyógyszer és az élelmiszer az én országomban. Kombinált használatukkal a qi-t és a vért pótló, valamint a yin és a yang harmonizáló hatását érhetjük el. A búzarost oldhatatlan és oldható élelmi rostokban gazdag, amelyek elősegíthetik a bélperisztaltikát és a székletürítést, és gyakran használják segédszerként a székrekedés kezelésére; A xilo-oligoszacharid egy funkcionális oligoszacharid, amely képes szabályozni a bélflórát, ezáltal serkenti a bélperisztaltikát. , növeli a széklet nedvességét [10], kombinálja a négy ízt, és kezeli a betegség kiváltó okát. Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy értékelje ennek az angelica és cistanche deserticola rostvegyületnek a hatékonyságát székrekedéses egereken, és feltárja lehetséges hatásmechanizmusát.

Anyagok és metódusok

Kísérleti állatok: 40 specifikus patogénmentes (SPF) minőségű hím Kunming egeret, 4-5 hetesek, a Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.-től vásároltak, engedélyszáma: SCXK (Guangdong) 2021-0011. a környezeti hőmérséklet 22 ± 2 fok, a páratartalom 50% ± 10%, a nappali és éjszakai ciklus 12 óra/12 óra. A kísérleti protokollok és eljárások megfeleltek az állathasználat és -gondozás etikai elveinek, és a Jinan Egyetem Állatkísérletek Etikai Bizottsága jóváhagyta.

A vizsgált anyag: Angelica sinensis és Cistanche deserticola rostvegyület készítményt Angelica Sinensis és Cistanche deserticola készítményből állítják elő, amelyeket vízzel extrahálnak, betöményítenek, szárítanak, és száraz pasztaport kapnak (a paszta kitermelése 52,95%). A száraz pasztaport későbbi felhasználás céljából búzarosttal és xilo-oligoszachariddal keverjük össze. Az Angelica sinensis (230404CP108-as tételszám) és a Cistanche deserticola (230303CP109-es tételszám) a Hebei Wanxiu Pharmaceutical Co., Ltd.-től vásárolt, és tesztelték, hogy megfeleljenek a Kínai Gyógyszerkönyv 2020-as kiadásának. A xilo-oligoszacharidokat a Shandong Bailong Chuangyuan Biotechnology Co., Ltd.-től vásárolták. A tételszám 20210829026, és az ellenőrzés megfelel a GB/T35545 előírásnak; a búzarost a J. Rettenmaier & Söhne GmbH + Co KG cégtől származik, a tételszám pedig 07501230126. Egy 60 kg-os felnőttre vonatkoztatva az angyalgyökér- és cisztánrost-vegyület ajánlott adagja ember számára 7,118 g·d-1 , amelyből a búzarost adagja 3,5g·d-1. Ennek a vegyületnek a kompatibilitása angyalgyökér: cisztanche: búzarost: xilo-oligoszacharidok=2:2:3:2 (a főzetdarabok adagolása a nyers drogon alapul). Vegye be az ajánlott humán adag 30-szorosát a nagy dózisú csoportként és az ajánlott humán adag ötszörösét az alacsony dózisú csoportként, 3,6 és 0,6 g·kg-1·d-1. Készítsen szuszpenziót tiszta vízzel, jól keverje össze, és tegye félre.

Gyógyszerek és reagensek Loperamid-hidroklorid (loperamid, LOP), jellemzők: Minden tabletta loperamid-hidrokloridot tartalmaz

Amin 2 mg, 12 kapszula/doboz, termék tételszám: MIJ3102, a Xi'an Janssen Pharmaceutical Co., Ltd.-től vásárolva; Mosapride-citrát tabletta (Quali), műszaki adatok: Minden tabletta 5 mg mosaprid-citrátot tartalmaz, 24 tabletta/doboz, termék tételszám: 25220603, a Lunan Beite Pharmaceutical Co., Ltd.-től vásárolva; aktív szénpor, specifikáció: 200 mesh barna por, A805337 tételszám, a Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.-től vásárolva; gumiarábik, specifikáció: por, A108975 tételszám, a Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.-től vásárolva.

Abszolút etanol (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, 64-17-5); Ammónium-perszulfát (Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., A6295-500g); Tris-Base (FD2010), 5× betöltő puffer (FD002), -aktin antitest (FD0060), kecske anti-nyúl másodlagos antitest (FDR007), kecske anti-egér másodlagos antitest (FDM007) és ECL színfejlesztő készlet (FD8020) mindegyiket a Hangzhou Fude Biotechnology Co., Ltd.-től vásárolták; RIPA lízispuffer (Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd., P0013B); 4% paraformaldehid (Biosharp Company, BL539A); immunhisztokémiai készlet (Jiangsu KGI Biotechnology Co., Ltd., KGOS60); bicinkoninsav (BCA) fehérje mennyiségi meghatározási készlet (Thermo Fisher Scientific, SLZ60212); motilin (MTL), gasztrin (GAS) és gyulladásos faktorok interleukin-1 (IL-1), tumor nekrózis faktor (tumornekrózis faktor-, TNF-) ELISA kit (Shanghai Enzyme Biotechnology Co., Ltd.) ., YJ201829, YJ037432, YJ002095, YJ301814); aquaporin 3 (aquaporin 3, AQP3) antitest (Affinity Company, AF5222); c -Kit antitest (Cell Signaling Technology, 3074S).

Műszer: Szuper tiszta vízmérő (Millipore Company, USA, Milli Q); Elektronikus mérleg (Sartorius, Németország)

A cég, BS224S); Elektronikus analitikai mérleg (Shanghai Benpu Instrument Technology Co., Ltd., FA2204N); Nagy sebességű hűtött centrifuga (Sigma Company, Németország, 3K15); Mikrolemez olvasó (Thermo Company, USA, Multiskan Mk 3); Paraffin mikrotom (Leica, Németország) Company, RM2255; Állandó hőmérsékletű fémfürdő (Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd., TU-100C); Teljesen automatikus minta gyorsdaráló (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd., JXFSTPRP-24); Elektroforézis műszer (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., DYY-6C); pásztázó mikroszkóp (Precipoint Company, Precipoint M8); kemilumineszcens képalkotó rendszer (Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd., Tanon 5200).

Csoportosítás és modell létrehozása: 40 egeret adaptív módon neveltünk 5 napig, majd véletlenszerűen negatív kontrollcsoportokra osztottunk.

(kontroll), modellcsoport (LOP), összetett nagy és alacsony dózisú csoportok (LOP+PF-H, OP+PF-L), pozitív kontrollcsoport (mozaprid-citrát, LOP+MOS). Minden nap reggel 9 és 1 óra között a negatív kontrollcsoport kivételével minden csoport 10 mg·kg-1 loperamid-hidrokloridot kapott szondán keresztül, hogy létrehozzák az egér székrekedési modelljét, a negatív kontrollcsoport pedig azonos mennyiségű tiszta víz szondán keresztül. 14-15 óra között a nagy dózisú és az alacsony dózisú csoport 3,6 és 0,6 g·kg-1 vegyületet, a pozitív kontrollcsoport pedig 5 mg·kg{{ mozaprid-citrátot (MOS) kapott. 19}}.

, a negatív kontrollcsoport és a modell kontrollcsoport egyenlő mennyiségű tiszta vizet kapott szondán keresztül 14 egymást követő napon.

Az egerek állapotának és székletének jellemzőit megfigyeltük és rögzítettük a gyógyszeres beavatkozási időszak alatt. Minden csoportban rögzítettük az egerek alapállapotát és ürülékét.

Karakterek, mérjük meg hetente 3-szor, és állítsuk be az adagolást. A beadást követő 3., 7., 10. és 14. napon minden egérből 3-4 pellet friss ürüléket gyűjtöttünk, azonnal lemértük, és nedves tömegként feljegyeztük, szárítószekrényben szárítottuk, majd száraz tömegként, valamint a széklet nedvességtartalmát feljegyeztük. tartalom kiszámításra került. Számítsa ki a széklet nedvességtartalmát (%)=(nedves tömeg − száraz tömeg)/nedves tömeg × 100%.

A vékonybél propulziós funkciójának meghatározását a referencia irodalom [11] és az "Egészséges élelmiszerek funkcionális funkcióinak vizsgálati és értékelési módszerei (2023. kiadás)" által előírt kísérleti módszerek szerint végeztük. Az utolsó adag beadása után az egereket mindegyik csoportban 16 órán át éheztetettük és vízmentesen tartottuk. Modellcsoport, vegyület képlete A nagy és kis dózisú csoportok, valamint a pozitív kontrollcsoport szondán keresztül loperamid-hidroklorid szuszpenziót (10 mg·kg-1), a negatív kontroll csoport pedig azonos mennyiségű tiszta víz szondán keresztül. 0,5 órával később az összetett nagy és alacsony dózisú csoportok, valamint a pozitív kontrollcsoport tintát (5%-ot tartalmaz), amely a megfelelő tesztminta adagokat (3,6 g·kg-1) tartalmazta, 0,6 g·kg-1, 5 mg·kg-1). (aktív szénpor, 10% gumiarábikum), és azonos mennyiségű tintát adtunk be a negatív és a modellcsoportnak. Az állatokat 0,5 óra elteltével közvetlenül megölték nyaki diszlokációval, és megmértük a "vékonybél teljes hosszát" és a "tinta előrehaladási hosszát". Számítsa ki a tinta előrehaladási sebességét=tintatovábbítási hossz (cm)/a vékonybél teljes hossza (cm) × 100%.

A szérumban az MTL, GAS, TNF- és IL-1 szintjének kimutatására vért vettünk az egér szemgolyóiból, és 4 fokon centrifugáltuk, 3 500 r·perc-1 10 perc elteltével a felső szérumot vettük, és az MTL-t és a GAS-t az egérszérumban ELISA kittel határoztuk meg. és TNF- , IL-1 szintek.

A H&E a vastagbélszövet kóros elváltozásait észleli. Az egerek vastagbelét normál sóoldattal mossuk, és 4%-os paraformaldehidben inkubáljuk.

Aldehidben fixáltuk, 24 óra elteltével rutinszerűen beágyaztuk, metszették, sütötték, H&E festették, és fénymikroszkóppal megfigyelték a vastagbélszövet kóros elváltozásait.

Az immunhisztokémiai módszert alkalmaztuk az AQP3 és a c-Kit expressziójának kimutatására vastagbélszövetben. Mindegyik csoportból összegyűjtöttük az egerek vastagbélszöveteit.

Paraffin metszetek, viaszmentesítés, hidratálás, antigén visszanyerés, endogén kataláz blokkolása, 2%-os kecskeszérum blokkolása, AQP3 és c-Kit antitestek hozzáadása, és éjszakán át 4 fokon, foszfáttal pufferolt sóoldatban, PBS) 5 percig tartó hematoxilin ellenfestés etanol dehidratáció, xilol átlátszóság, semleges gumitömítés, pásztázó mikroszkóp alatti szkennelés és az Image J szoftver használata az eredmények elemzéséhez.

Western blot módszert alkalmaztunk az AQP3 és a c-Kit expressziójának kimutatására vastagbélszövetben. Vegyünk 10 mg fagyasztott egér vastagbélszövetet, és helyezzük egy centrifugacsőbe 150 μl RIPA lízispufferrel, amely 1% proteázgátlót tartalmaz. Használjon gyorsdarálót a szövet homogenizálásához. , centrifugálja a homogenizátumot alacsony hőmérsékletű centrifugával 10 000 fordulat/perc-1 sebességgel 10 percig, vegye ki a felülúszót, határozza meg a fehérje koncentrációt BCA fehérje kvantifikációs módszerrel, keverje össze a töltőpufferrel, denaturálja a fehérjét, és elemezze az eredményeket az egyes minták szerint. 30 ug fehérjét betöltöttünk, SDS-PAGE elektroforézisnek vetettük alá, nedvesen átvittük a membránra, majd 5%-os sovány tejporral blokkoltuk szobahőmérsékleten 1,5 órán keresztül, háromszor mostuk TBST-vel, az elsődleges antitestet rázógépre helyeztük és egy éjszakán át inkubáltuk. 4 fokos, majd eltávolítjuk, és TBST pufferrel mossuk. Háromszor mossuk oldattal, inkubáljuk másodlagos antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten, majd 3-szor mossuk TBST-vel. A színfejlesztéshez ECL kemilumineszcens munkaoldatot, a fejlesztéshez pedig egy teljesen automatikus kemilumineszcens képalkotó rendszert használnak. Az Image J szoftvert az eredmények elemzésére használják.

Statisztikai módszerek A kísérletben szereplő összes adatot átlag ± szórás formájában fejezzük ki. GraphPad Prism-et használtunk a kísérleti adatok ábrázolására, és a csoportok közötti összehasonlítást egyutas ANOVA vagy kétirányú ANOVA segítségével végeztük; amikor a csoportok közötti különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak, a legkisebb szignifikáns különbség (LSD) módszerét alkalmaztuk. ) Végezzen páronkénti összehasonlítást a csoportok között, és P < 0,05 statisztikailag szignifikáns különbségnek tekinthető.