Virágkivonatok, mint többfunkciós színezékek a kozmetikai iparban 2. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

A hagyományos orvosi rendszerekben számos természetes terméket használnak a fájdalom és gyulladás tüneteinek enyhítésére, [61] Ezért az elemzett kivonatok lipoxigenáz és proteináz aktivitás gátlására gyakorolt ​​hatását vizsgálták. Az elemzett koncentrációk tartományában (100-500 ug/ml) a CTE vizes kivonat mutatta a legerősebb proteináz gátlási képességet (4. ábra) (500 ug/ml koncentráció esetén 57 százalék). Ezt az aktivitást a jól ismert proteináz inhibitor diklofenakhoz hasonlították, amelyet kontrollként használtak (körülbelül 89 százalékos gátlás a legmagasabb vizsgált koncentrációnál). Hasonló eredményeket kaptunk azonban a GGE és a KTE kivonat esetében (körülbelül 56%, illetve 53% a legmagasabb koncentrációk esetén). Alacsonyabb proteináz gátlást figyeltek meg a PRE és PGE kivonatoknál. Egy további, a lipoxigenáz gátlási képességet mérő tesztben a KTE és CTE vizes kivonatai mutatták a legmagasabb értékeket (500 ug/ml koncentrációnál kb. 67 százalékos, illetve 64 százalékos gátlást). Kontrollként diklofenakot is használtunk. A GGE, PGE és PRE kivonatok szintén jelentősen magas értékeket mutatnak (60%, 57%, illetve 54%). Azt is megjegyezték, hogy a LOX és proteináz enzimek gátlásának képessége az extraktum koncentrációjától függ (5. ábra).

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy számos polifenolos vegyület jelentősen hozzájárult számos növényi kivonat gyulladáscsökkentő hatásához[62]. Tanulmányok kimutatták a ROS szerepét a gyulladásos folyamatban, és a fenolos vegyületek, mint például a gallusz és a kininsav blokkolhatják az arachidonsav metabolizmusát a lipoxigenáz aktivitásának gátlásával, vagy megkötőként szolgálhatnak reaktív szabad gyökökként, amelyek az arachidonsav során keletkeznek. [63]. A BenSaad et al. azt jelzik, hogy a P. granatumból izolált ellagsav, galluszsav és punikalagin A&B gátolta a nitrogén-monoxid (NO), a prosztaglandin E2 (PGE2) és az interleukin 6 (IL-6) termelődését lipopoliszacharid (LPS) által indukált anyagban RAW 267.4 makrofág. Továbbra is kérdés, hogy ezek a vegyületek egyedüli szerekként működnek-e, vagy van-e szinergikus hatásuk [64]. Mivel sok flavonoid gyulladáscsökkentő tulajdonságokkal rendelkezik, belső antioxidáns viselkedésük miatt különböző gyulladásos betegségekben szerepet játszanak.flavonoid extrakciós módszer pdf,Különösen a kvercetin a legérdekesebb molekula, mert megzavarja a specifikus biológiai utakat. Ezenkívül a tanulmányok azt sugallják, hogy különböző mechanizmusokon keresztül csökkentheti a gyulladásos folyamatokat, amelyek több modellben is szerepet játszanak[65]. Különösen az AMP-aktivált protein kináz és a hiszton/fehérje dezacetiláz (AMPK/SIRT1) útvonal érdekesebb gyulladáskezelést eredményez. Így az AMPK aktivátorok csökkenthetik a makrofág gyulladást. A kvercetin és más flavonoidok, mint az AMPK és a SIRT1 aktivátorai, csökkenthetik a gyulladást azáltal, hogy megzavarják ezt az utat [66]. Azt is kimutatták, hogy a kvercetin és a kvercetin monoglükozidok nagyobb LOX-gátló potenciált fejtenek ki [67] Nair et al. kimutatták a KTE kivonat gyulladáscsökkentő tulajdonságait a kvercetin molekularészben található flavonolok, például a manghaslin Qu 3-[2G] ramnozilrutinozid, a Qu 3-O-dirhamnosid és a rutin jelenlétének értékelésével. Ezek a molekulák erősen gátolják a COX{11}} aktivitást és részlegesen elnyomják a ROS-t. Általánosságban elmondható, hogy a CTE-ben jelenlévő polifenolok gyulladáscsökkentő tulajdonságokat mutattak az LPS által kiváltott gyulladásban a RAW 264.7 makrofág sejtekben[68].

További információért kattintson ide

2.5. Citotoxicitás értékelése

Az új kozmetikai alapanyagok létrehozásánál az egyik legfontosabb tulajdonság a felhasználás biztonsága. A kozmetikai felhasználásra szánt anyagoknak nem mérgezőnek kell lenniük, különösen a bőrsejtek, például a keratinociták és a fibroblasztok tekintetében. Kétféle tesztet alkalmaztak az elemzett kivonatok HaCaT és BJ sejteken mért toxicitásának meghatározására.flavonoidokAz első, a semleges vörös felvételi vizsgálatot alkalmazó vizsgálat lehetővé teszi az elemzett kivonatokkal kezelt sejtek életképességének felmérését. Ez a festék belép az élő sejt lizoszómáiba, és felszabadul az elhalt sejtek citoplazmájába. Megfigyelték (6. ábra), hogy a CTE-kivonat képes a legnagyobb mértékben fokozni mind a HaCaT, mind a BJ sejtek proliferációját. A kontrollhoz képest ez a kivonat 250 μL/mL (HaCaT és B】), illetve 500 μL/mL (BJ sejtek) koncentrációnál körülbelül 20%-kal, illetve 40%-kal magasabb értékeket ért el, mint a vizsgált paraméter. A 100 és 250 μL/mL koncentrációjú GGE kivonatot és az 500 μL/ml koncentrációjú KTE kivonatot a BJ sejtekre gyakorolt ​​csekély toxikus hatás jellemezte. Más kivonatok pozitív hatással voltak e sejtek életképességére. A 100 μL/ml koncentrációjú PRE és PGE kivonatok nem különböztek szignifikánsan a kontrolltól, és a 250 és 500 μl/koncentrációjú kontrollhoz képest kb 10-15 százalékkal növelték a BJ sejtek proliferációját. ml. A keratinociták esetében a sejtek életképességének csökkenése nem volt megfigyelhető. A PGE, PRE és CTE kivonatok esetében a proliferáció növekedését figyelték meg a koncentráció növekedésével, míg a sejtek életképességének csökkenését a KTE és GGE kivonatok növekvő koncentrációjával.

A második teszt, amelyet a vizsgált kivonatok citotoxicitásának meghatározására végeztek, a resazurin teszt (Alamar Blue) volt. Kimutatták (7. ábra), hogy a sejtek életképessége a kivonat koncentrációjától függ, amellyel a sejteket inkubáltuk. A fibroblasztok esetében a PRE, PGE és CTE kivonatok koncentrációjuk növekedésével nagyobb sejtproliferációt okoznak. A legmagasabb elemzett koncentrációnál (500 μL/ml) körülbelül 20 százalékkal nagyobb proliferációt figyeltek meg a kontrollhoz képest.heszperidint használA KTE és GGE kivonatok esetében a sejtek életképességének csökkenése volt megfigyelhető a kivonatok koncentrációjának növekedésével. Ezek a kivonatok enyhén toxikus hatást mutattak a BJ-re 250 és 500 μl/ml koncentrációban. A keratinociták esetében a vizsgált kivonatok bőrsejtekre gyakorolt ​​hasonló hatása volt megfigyelhető, de szaporodási képességük nem volt olyan erős, mint a fibroblasztoké. A keratinocita proliferációt fokozó legnagyobb képességet a CTE-kivonat esetében figyeltük meg az elemzett koncentrációk teljes tartományában. Hasonló értékeket kaptunk a PRE kivonatnál 250 μL/ml koncentrációnál és a PGE kivonatnál 500 μL/ml koncentrációnál. A KTE kivonat szignifikánsan nagyobb toxikus hatást mutatott a HaCa sejtekre, mint a GGE kivonat.

Az elemzett kivonatokat korábban nem vizsgálták alaposan a bőrsejtekre gyakorolt ​​toxicitásuk szempontjából. Csak néhány citotoxicitási vizsgálat létezik a kivonatokról vagy azok fő hatóanyagairól, különösen a rákos sejtekről. Korábbi tanulmányok szerzői kimutatták, hogy ezek a kivonatok általában nem fejtenek ki toxikus hatást a bőrsejtekre, és sejtproliferációt fokozó képességüket leggyakrabban a magas polifenol-, antocianin- és flavonoidtartalomnak tulajdonítják [45,69-73 ]. Egyes szerzők azt is jelezték, hogy a kivonatokban található egyes komponensek toxikus hatást fejthetnek ki a bőrsejtekre, míg a kivonat egésze nem. Ali Hijazi et al. [69] kimutatta, hogy a Punica granatumból kivont alkaloidok mérgezőek a normál és a rákos sejtvonalakra, míg a teljes kivonat kevésbé mérgező. Nasiri et al. [70] azt jelzi, hogy a Punica granatum virágkivonat hasznos lehet a sebgyógyulási folyamat felgyorsításában, mivel képes fokozni a bőrsejtek szaporodását. Korábbi kutatásunkban [45] kimutattuk, hogy a vizsgált növényekből nyert víz-etanolos kivonatokat a BJ sejtek nagyobb proliferációját fokozó képessége jellemezte, a KTE és GGE kivonatok pedig kisebb toxikus hatást mutattak ezekre a sejtekre. .elveszett birodalom cistancheA vizes-etanolos kivonatok HaCaT sejtekre gyakorolt ​​hatása hasonló volt a tiszta vizes kivonatokéhoz, de az etanollal nyert kivonatok esetében valamivel kedvezőbb proliferációs tulajdonságokat tapasztaltunk, mint a vizes kivonatok esetében. A két vizsgált kivonat összetétele közötti különbségek eltéréseket okozhatnak azok toxicitásában. Mint látható, a vizes kivonatok nem olyan gazdagok bioaktív összetevőkben, mint a víz-etanolos kivonatok. A legnagyobb különbségek a rutin és az izokvercitrin tartalomban figyelhetők meg.

A Cistanche öregedésgátló hatású

2.6.Fényvédő faktor meghatározása

Az UV-sugárzás bőrre gyakorolt ​​kedvezőtlen hatásai mind röviddel az expozíció után, mind akár évekkel később is megmutatkozhatnak. A napsugárzás immunszuppresszív hatást fejt ki, amely felgyorsítja a bőr öregedési folyamatát a vele járó összes következménnyel együtt, beleértve a fokozott karcinogenezist[74]. A jelenleg megfigyelhető tendenciák azt jelzik, hogy egyre nagyobb igény mutatkozik olyan termékek fejlesztésére, amelyekre nemcsak a rendkívül magas használati biztonság, hanem a multifunkcionalitás is jellemző abban az értelemben, hogy a termékek az eddigieknél szélesebb körű hatást fejtenek ki a bőr sugárzás elleni védelmével. Ebben a szempontból felbecsülhetetlen szerepet töltenek be egyes növényi anyagok, amelyek nemcsak fényvédelmet nyújtanak, hanem a napsugárzás már meglévő negatív hatásait semlegesítik a bőrön [75-77]. Az elvégzett kutatás kimutatta, hogy a vizsgált PRE, PGE, KTE, CTE és GGE növényi kivonatokat magas SPF koefficiens jellemzi.

A koefficiensek (SPF) analízisét a fent említett növényekből nyert vizes kivonatokra végeztük 10 és 50 mg/ml koncentrációban. Minden vizsgált növény esetében a kivonat magasabb koncentrációja szignifikánsan magasabb SPF-értéket eredményezett.mikronizált tisztított flavonoid frakció 1000 mg felhasználásokA kivonatok összehasonlítása azt mutatja, hogy a legmagasabb SPF értéket a KTE kivonatnál figyelték meg, ami mindkét vizsgált koncentrációra igaz. Egy másik érdekes megfigyelés, hogy a KTE-kivonat még a vizsgált alacsonyabb koncentrációknál is magas SPF-értéket mutatott, míg a többi kivonat értékei észrevehetően csökkentek. Ez világos, ha elemezzük, hogy a KTE eredménye mennyivel volt magasabb, mint más kivonatok. Az 50 mg/ml koncentrációnál az SPF 1,2-szeres faktorral (a PGE-vel, CTE-vel összehasonlítva) közel 1,9-szeresére (PRE, GE-vel összehasonlítva) volt magasabb. Ugyanez a számítás a 10 mg/ml-es koncentrációra 1,4-től (a PGE-hez képest) a 2-3 tartomány faktoráig (CTE, GGE összehasonlítva), akár 10-ig terjedő tényezőket ad, ha összehasonlítjuk ELŐ. Ha a KTE-kivonatra fókuszálunk, észrevehető, hogy a kivonat koncentrációjának 5-ös csökkenése (50 mg/ml értékről 10 ml/ml értékre) az SPF érték 3,4-es faktoros csökkenését eredményezi. , ami azt jelenti, hogy az SPF lassabban csökken, mint a koncentráció. A fentiek azt mutatják, hogy a KTE-kivonat alacsony koncentrációban is hatékony lehet (8. ábra).

2.7. Transzepidermális vízveszteség (TEWL) és a bőr hidratáltságának mérése

A növényi alapanyagok széles biológiai és farmakológiai aktivitása miatt a kivonatokban található növényi anyagok jelentős hatással vannak a bőr állapotára. Itt különösen a másodlagos metabolitok bőrünk állapotára gyakorolt ​​hatásáról beszélünk [78,79].

A kutatás következő szakaszában a hidratáltság és a TEWL elemzésére került sor. A vizsgált kivonatok bőrre gyakorolt ​​hatását értékelték. A méréseket kétszer 60 és 360 percenként végeztük a 10 mg/ml kivonatkoncentrációnál. A TEWL mérésnél a legnagyobb százalékos csökkenést a PGE kivonat mutatta, ahol a 13,9-es kontrollérték 8,71-re esett, ami 37 százalékos százalékos csökkenést eredményezett. Ebből a szempontból is érdemes a KTE-kivonatot elemezni, mivel ez volt a legmagasabb SPF-értékkel rendelkező. A KTE kivonat esetében a TEWL kontrollérték 10,22-es értékre csökkent, ami 26 százalékos csökkenést jelent (9A. ábra).

A második műszeres mérésnél azonban kimutatták, hogy a vizsgált kivonatok nedvességnövekedést okoznak a kontroll mintához képest, mind 60, mind 360 perc után.

Az elemzések eredményeként kiderült, hogy a vizsgált PRE, PGE, KTE, CTE és GGE kivonatok fokozzák a bőr hidratáltságát (9B. ábra). A hidratáló tulajdonságok növekedését és a kivonat koncentrációjának növekedését figyelték meg a készítményekben. A legerősebb hidratáló tulajdonságokat a PRE és PGE kivonatoknál figyelték meg, amelyek 60 perc után 32 és 29 százalék, 360 perc után pedig 21 százalék és 22 százalék. A bőr hidratáltságának legalacsonyabb szintjét azonban a KTE-kivonat esetében találták, amely 60 perc után 18 százalék, 360 perc után pedig közel 3 százalék.

2.8. Alkalmazáselemzés

2.8.1. A kivonatok színparamétereinek meghatározása

A növényi virágok hatóanyagai természetes színüknek köszönhetően természetes színezékként felhasználhatók számos kereskedelmi termékben, például kozmetikumokban, élelmiszerekben. A kapott kivonatokra színanalízist végeztünk (5. táblázat).

A PRE, a KTE és a CTE kivonatokat a legnagyobb potenciállal rendelkező természetes kozmetikai pigmenteknek találták. A legmagasabb színértékeket (C*) azonban a CTE esetében figyelték meg. A h fok paraméter értéke alapján kiderült, hogy ennek a kivonatnak a sárga színe az, ami szabad szemmel is megfigyelhető és látható. A KTE és PRE kivonatok esetében az alacsony C* érték (2,8) ellenére ezeknek a kivonatoknak a színe szabad szemmel is jól látható, és a PRE-nél vörös-lilára, a KTE-kivonatnál kék-lilára adtuk meg. A PGE és GGE vizes kivonatai vöröses és enyhén narancssárga színűek voltak, a kapott kromaértékek 1,3-as szinten voltak. Ennél a színnél ezek az értékek szabad szemmel nem voltak jelentős mértékben észrevehetők.

2.8.2. Kozmetikai termékek színparamétereinek meghatározása a kivonatok alapján

Az elmúlt években nagy szükség volt új természetes eredetű festékek kifejlesztésére, különösen az élelmiszer- és kozmetikai iparban. A szintetikusan előállított festékekhez képest kisebb negatív hatásuk lehet az emberi egészségre és a környezetre [80]. A kapott kivonatokat egy modell micellás sminklemosó folyadék elkészítéséhez használtuk fel. Mindegyik készítményben 1 százalékos koncentrációban használták őket. A modellkozmetikumok színparamétereinek eredményeit a 6. táblázat tartalmazza.

Megfigyelték, hogy a PRE, PGE, CTE és GGE 1 százalékos vizes kivonatának hozzáadása jelentősen befolyásolta a sminklemosó színét. Mindegyik minta színében szabad szemmel jól látható volt. A PRE kivonat narancssárgára, a PGE, CTE és GGE kivonat sárgára változtatta a kozmetikum színét.

Az elemzett kivonatok potenciális színezékként való felhasználásának lehetőségét igazolja a △Sminklemosó kivonattal/alapsminklemosóval viszonylag magas értékei, ami a modellkozmetikumok színének jelentős változását jelzi az összehasonlított kivonat hozzáadásával. az alapmintához (kivonatok hozzáadása nélkül). Irodalmi adatok [73] azt mutatják, hogy ha az AE-értékek magasabbak, mint 5, akkor a színt a meztelen előeste érzékeli, és színeffektusként érzékeli. A PRE, KTE és CTE kivonatokat tartalmazó sminklemosók esetében 8,83, 9,17 és 8,14 AE értékeket kaptunk. A PGE és GGE kivonatokat tartalmazó termékek esetében a kivonat nem befolyásolja jelentős mértékben a készítmény színét. Az AE értéke a 2 tartományba esik.{12}}.82. Ez azt jelenti, hogy a színkülönbség csak tapasztalt szemlélő számára észlelhető [80,81].

3. Anyagok és módszerek

3.1. A növényi anyagok és a kivonási eljárás

A kutatásban felhasznált növényi anyag a P. rhoeas L., P.granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. és G.globosa L. száraz virágai voltak, amelyeket a helyi gyógynövényboltból szereztek be. . Az extrakciós eljárást ultrahangos fürdőben (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berlin, Németország) végeztük, amelyet Yang és munkatársai [82] által leírt módszerrel végeztek. A vizsgált növényekből 10 gramm száraz virágot és 100 g vizet használtunk a vizes kivonatok elkészítéséhez. Az eljárást 20 percig szobahőmérsékleten végezzük. A kapott kivonatokat ezután összegyűjtjük és Whatman No. 1 szűrőpapíron háromszor szűrjük. Szűrés után az extraktumokat csökkentett nyomáson 40 °C-on bepároljuk. A szárított extraktumokból 100 mg/ml koncentrációjú törzsoldatot készítettem, és további elemzésig sötétben, 4 fokon tároltuk. A következő rövidítéseket használjuk: PRE – Papaver rhoeas kivonat, PGE – Punica granatum kivonat, GGE – Gomphrena globosa kivonat, CTE – Carthamus tinctorius kivonat, KTE – Clitoria ternatea kivonat.

3.2. Bioaktív vegyületek meghatározása HPLC-UV-ESI-MS módszerrel

A kapott kivonatokat HPLC-vel (DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA) elemeztük a fő bioaktív vegyületeik meghatározására. tömegspektrométerrel (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Kanada), elektropermet ionizációs forrással (ESI) és hármas kvadrupólion-csapda tömeggel elemző. A kromatográfiás elválasztást fordított fázisú gradiens rendszerrel végeztük. Továbbá a Phenomenextől vásároltunk egy 100×4,6 mm-es Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A kromatográfiás oszlopot, izobutil oldalláncokkal és TMS végzáró állófázissal, hasonló összetételű védőoszloppal együtt, és 30 fokon tartottuk. . Egy bináris oldószerrendszert, amely A oldószerként 0,1 % (o/v) vizes hangyasavat és B oldószerként metanolt tartalmaz, gradiens módban alkalmaztunk a futtatási idő 19,1 perce alatt. Az alkalmazott elúciós körülmények a következők voltak: 0.0-15,0 perc 25-100 százalék B,15.0-17,0 perc 100 százalék B,17.0-17,1 perc 100-25 százalék B,17.1-19,1 perc 25 százalék B. A mozgófázis áramlási sebessége 0,6 ml/perc, az injekció térfogata 10 μL volt. Az eluenst elektrospray ion tömegspektrométerrel (ESI-MS) követtük negatív ion üzemmódban, és m/z 20 és 1000 Da között pásztáztuk. A kvantifikációs elemzéshez a hármas kvadrupól MS detektor többszörös reakciófigyelő (MRM) pásztázási módban működött. Kísérletileg meghatároztuk az optimális tömegelemző körülményeket és az egyes vegyületek termékionjainak kiválasztását. Ebből a célból a vizsgált vegyületek standard oldatait (1 ng/ml) mozgófázisú összetételben vezettük be állandó mintaszállítással működő infúziós pumpával. Miután meggyőződtünk arról, hogy a megfelelő prekurzor iont választották ki, a deklaszterezési potenciált (DP), a belépési potenciált (EP), az ütközési cella kilépési potenciálját (CXP) és az ütközési energiát (CE) optimalizáltuk minden MRM-átmenethez (S1 táblázat). Két MRM-átmenetet figyeltünk meg, egyet a számszerűsítéshez, egyet pedig a megerősítéshez. Az MS paramétereket a következőképpen állítottuk be: kapilláris hőmérséklet 600 C, függönygáz 35 psi, porlasztógáz 60 psi és szárítógáz 50 psi. A bioaktív vegyületek meghatározásához negatív ionizációs módú forrásfeszültséget -4500 V alkalmaztunk. A nitrogént függönyként és ütközési gázként használták. Az adatok elemzése Analyst 1.5.1 szoftverrel történt. A kiválasztott vegyületek azonosítását az egyes vegyületek molekulatömegével és anionbelépéseinek fragmensével végeztük, és MS2 fragmentációval igazoltuk. Kilenc vegyület azonosságát határoztuk meg a kémiai képletükkel, a deprotonált molekulaionokkal és az egyes csúcsokra jellemző fragmensionokkal együtt. Hat vegyületet számszerűsítettünk az analitikai standardok legintenzívebb MRM-átmeneteinek csúcsterületeinek felhasználásával generált kalibrációs görbe alapján. A számszerűsített vegyületek detektorválaszának linearitását kalibrációs standardok befecskendezésével igazoltuk nyolc koncentrációszinten, amelyek 0,01 ug/ml és 2 ug/ml között változtak. A kalibrációs görbék lineárisak, a korrelációs együttható (R) nagyobb, mint 0,99. Ha a minták nem esnek a CMS detektor lineáris tartományába, a mintákat hígítottuk.

A kinsav, galluszsav, kávésav, koffeoil-kinsavak (CQA, két izomer: 3- és 5-CQA) és kvercetin analitikai standardjait a Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA-tól vásároltuk. ). Minden használt standard analitikai minőségű volt (2 99%-os vagy annál nagyobb tisztaság).

A standard törzsoldatokat úgy állítottuk elő, hogy mindegyik standardból 20 mg-ot pontosan lemértünk és feloldottunk 10 ml LC-MS minőségű metanolban, így 2 mg/ml koncentrációt kaptunk. Sorozathígítások 2.{{10}} ug/mL, 1,5 ug/mL, 1.0 ug/mL, 0.5 ug/mL,0 Ezután 0,1 ug/ml, 0,05 ug/ml, 0,02 ug/ml és 0,01 ug/ml koncentrációt állítottunk elő LC-MS minőségű metanolos oldattal. A mennyiségi meghatározási határt (LOQ) 0,01 ug/ml-ben határozták meg.

Az LC-MS/MS vizsgálatot három párhuzamosban végeztük. A kapott adatokat átlag ± standard deviáció formájában adtuk meg.

3.3. Az antioxidáns tulajdonságok meghatározása

3.3.1.ABTS· plus Scavenging Assay

Először az ABTS-oldatot 19,5 mg ABTS és 3,3 mg kálium-perszulfát 7 ml foszfátpufferrel (pH{5}},4) összekeverésével készítettük el, és 16 órán át sötétben feloldottuk. Ezután az oldatot körülbelül 1-es abszorbanciára hígítottuk.0. Az abszorbanciákat 入=734 nm hullámhosszon mértük. Ezután 20 ml KTE, PGE, PRE, CTE és GGE kivonatot (10 100 250 500 ug/ml) összekevertünk 980 ml hígított ABTSe ​​plus oldattal, majd 10 percig sötétben inkubáltuk. A következő lépésben az előkészített minták abszorbanciáját mértük 入=734 nm-en UV/VIS spektrofotométerrel Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Vakmintaként desztillált vizet használtunk. Az ABTS plusz öblítést az (1) egyenletből számítottuk ki:

ahol: As – a minta abszorbanciája; Ac – a kontrollminta abszorbanciája. A méréseket minden kivont mintánál háromszor végeztük. Az eljárást Gawel-Beben et al. [83].

3.3.2. DPPH gyökfogó vizsgálat

A kivonatok szabad gyököket megkötő képességét a Brand-Williams és munkatársai által leírt módszerrel végeztük. [84]. Az 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) gyök használatán alapul. Először 33 μl 100 ug/ml koncentrációjú vizes kivonatoldatot kevertünk össze 167 µl metanolos DPPH (4 mM) oldattal, és egy 96-lyukú lemezre vittük, majd rázatással összekevertük. Ezt követően a minták abszorbanciáját 517 nm hullámhosszon mértük. A méréseket 5 percenként, 30 percig végeztük UV-VIS Filter Max入=5 spektrofotométeren (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Mindegyik kivonathoz három független ismétlést végeztünk. Kontrollként DPPH-oldatot tartalmazó vizet használtunk. Az antioxidáns kapacitást a DPPH-gátlás százalékában fejeztük ki a (2) egyenlet segítségével:

ahol: As – a minta abszorbanciája; Ac – a kontrollminta abszorbanciája. A méréseket minden kivont mintánál háromszor végeztük.

3.3.3. Reaktív oxigénfajok (ROS) intracelluláris szintjének kimutatása

A vizsgált kivonatok azon képességének meghatározására, hogy a HaCaT és BJ sejtekben reaktív oxigénfajták intracelluláris termelését generálják, fluorogén H, DCFDA festéket használtunk. Ez a vegyület passzív diffúzióval képes bejutni a sejtekbe, ahol az intracelluláris észterázok nem fluoreszcens vegyületté dezacetilálják. Ha reaktív oxigénfajták vannak jelen a sejtben, ez a vegyület erősen fluoreszkáló DCF-vé alakul. A ROS intracelluláris szintjének meghatározásához HaCaT-ben és BJ-ben a sejteket 96-lyuklemezekre oltottuk. Ezután a sejteket inkubátorban tenyésztjük 24 órán át. A DMEM táptalajt eltávolítottuk, és szérummentes DMEM tápközegben oldott 10 μM H2DCFDA-val (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) helyettesítettük. A HaCaT és BJ sejteket H, DCFDA-ban 45 percig inkubáltuk, majd a kivonatokkal 100, 250 és 500 ug/ml koncentrációban inkubáltuk. Pozitív kontrollként 1 mM hidrogén-peroxiddal (H2O2) kezelt sejteket használtunk. A kontrollminták a vizsgált kivonatokkal kezeletlen sejtek voltak. A DCF fluoreszcenciát 90 percenként mértük FilterMax F5 mikrolemez-leolvasóval (Thermo Fisher Scientific) 485 nm maximális gerjesztésnél és 530 nm emissziós spektrumnál [85].

3.4. A mátrix metallopeptidázok gátlásának értékelése

3.4.1.Az anti-elasztáz aktivitás meghatározása

A mátrix metalloproteináz, a neutrofil elasztáz (NE) gátlásának lehetőségének meghatározására fluorometriás kit-et (Abcam, ab118971) alkalmaztunk. A tesztet a készlethez mellékelt utasítások és a Niziol-Lukaszewska és munkatársai által leírt eljárás szerint végeztük. [86]. Az elemzéseket egy átlátszó, lapos fenekű, szabványos 96-lyuklemezen végeztük. Az elemzéshez növényi kivonatokat használtunk 100 és 250 ug/ml koncentrációban. Kezdetben NE enzim oldatokat, NE szubsztrátot és inhibitor kontrollt (SPCK) készítettek az utasításoknak megfelelően. Minden lyukba hígított NE-oldatot adtunk, majd a tesztmintákat, az inhibitor kontrollt és az enzimkontrollt (Assay Buffer) a következő lyukakba. Ezt követően a mintákat összekevertük és 37 fokon 5 percig inkubáltuk. Időközben reakcióelegyet készítettünk a vizsgálati puffer és az NE szubsztrát összekeverésével. A keveréket mindegyik lyukba hozzáadjuk, és alaposan összekeverjük. A fluoreszcenciát azonnal mértük 入=400 nm gerjesztési hullámhossznál és 入=505 nm emissziónál mikrolemez-leolvasóval (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). a mintákat a (3) egyenletből számítottuk ki:

A végeredmény három független mérés számtani átlaga lett.

3.4.2. Az anti-kollagenáz aktivitás meghatározása

A kapott kivonatok kollagenáz aktivitást gátló képességének felmérésére fluormetriás kit-et (Abcam, Cambridge, UK, ab211108) alkalmaztunk. A tesztet a készlethez mellékelt utasítások és a Niziol-Lukaszewska és munkatársai által leírt eljárás szerint végeztük. [86]. Az elemzéseket egy átlátszó, lapos fenekű szabványos 96-lyuklemezen végeztük. Az elemzéshez növényi kivonatokat használtunk 100 és 250 ug/ml koncentrációban. Először a kollagenázt (COL) kollagenáz-elemző pufferben (CAB) oldottuk fel. Ezután az elemzett mintákat hozzáadtuk a COL-hoz és a CAB-hoz. Az inhibitor kontroll mintákat a kollagenáz inhibitor (1,10-fenantrolin (80 mM) kollagenázzal és CAB pufferrel való összekeverésével állítottuk elő. Az enzimkontroll lyukakat hígított COL és CAB keverésével készítettük. A CAB puffert háttérkontrollként használtuk Ezután a mintákat szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk, majd a kollagenáz szubsztrát CAB-vel való összekeverésével reakcióelegyet készítettünk.Az így elkészített reakcióelegyet hozzáadtuk az összes elemzett mintához és alaposan összekevertük, majd fluoreszcenciát mértünk 490 nm gerjesztési hullámhossz és 520 nm emisszió A mérést kinetikus üzemmódban 60 percig 37 C-on végeztük.

3.5. Gyulladáscsökkentő tulajdonságok meghatározása

3.5.1. A fehérje denaturáció gátlása

A PRE, PGE, KTE, CTE és GGE kivonatok proteináz gátló aktivitását Sakat és mtsai.[87] módszere szerint végeztük, amelyet Gunathilake és mtsai.[88] módosítottak. Röviden, a reakcióoldat (2 ml) 1 ml 1% tripszin 2{{10}} mM Tris-HCl pufferben (pH7,4) és 1 ml tesztmintából ({{17}) állt. },02 ml kivonat 0,980 ml víz). Az oldatot 37 °C-on 5 percig inkubáltuk, majd 1 ml 0,8 tömegszázalékos (w/v) kazeint adtunk hozzá, és az elegyet tovább inkubáltuk 20 percig. Az inkubálás végén 2 ml 70%-os perklórsavat adtunk hozzá a reakció befejezéséhez. Az elegyet centrifugáltuk, és a felülúszó abszorbanciáját 210 nm-en mértük a pufferrel szemben, mint vakpróba. Kontrollként a foszfát pufferoldatot használtuk. A fehérje denaturáció gátlásának százalékos mértékét a következő képlettel számítottuk ki:

ahol a kontrollminta A1= abszorpciója és a tesztminta A2= abszorpciója.

3.5.2. A lipoxigenáz aktivitás gátlása

A kapott kivonatok lipoxigenáz aktivitást gátló képességét Sarvesvaran és munkatársai által leírt módszerrel határoztuk meg. 【89】. Először 10 μl különböző koncentrációjú (100, 250 és 500 ug/ml) növényi kivonatot kevertünk össze egy 96-lyukú lemezen 160 µl 100 mM PBS-sel és 20 µl szójabab lipoxigenáz oldattal (167 U/). ml) A mintákat 25 fokon 10 percig inkubáltuk, majd ezután 10 μl nátrium-linolsavat adtunk hozzá a reakció megindításához. Ezután a minták abszorbanciáját 234 nm-en mértük 3 percen keresztül, percenként egy FilterMax F5microplate olvasóval (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Pozitív kontrollként diklofenakot használtunk. A lipoxigenáz aktivitás gátlás százalékát a (6) egyenletből számítottuk ki:

ahol: Ahogy a vizsgált minta abszorbanciája, Ac a negatív kontroll abszorbanciája.

A végeredmény három független mérés számtani átlaga lett.

3.6. Citotoxicitási elemzés

3.6.1. Sejtkultúra

Ebben a vizsgálatban két bőrsejtvonalat használtak: normál humán keratinocitákat (HaCaT) és fibroblasztokat (BJ). A HaCaT-eket a CLSCell Lines Service-től (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Németország), a BJ-ket pedig az American Type Culture Collection-től szereztük be. Manassas, VA, USA). A sejteket Dulbecco's Modification of Eagle's Mediumban (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, USA) növesztettük nátrium-piruváttal, L-glutaminnal és magas glükóztartalommal (4,5 g/l). A táptalajt 10% magzati szarvasmarha-szérummal (Gibco, Waltham, MA, USA) és 1% antibiotikumokkal (100 U/ml penicillin és 1000 ug/ml streptomycin, Gibco) is dúsították a mikrobiális szennyeződés megelőzése érdekében. A sejteket inkubátorban, 37 fokon, 95 százalékos levegőt és 5 százalék szén-dioxidot tartalmazó párásított atmoszférában növesztettük.

3.6.2. Alamar Blue Assay

Miután a tenyésztett sejtek (HaCaT és BJ) elérték a kívánt konfluenciát, a DMEM táptalajt leszívtuk a tenyésztő lombikban. Az alul tapadt sejteket kétszer mostuk steril foszfáttal pufferolt sóoldattal. A sejtréteget tripszinnel leválasztottuk, majd a sejteket friss DMEM táptalajba helyeztük. A sejteket 96-lyukú lapos fenekű lemezekre szélesztettük (VWR, Radnor, PE, USA), és a lemezek aljához való rögzítés után a sejteket kivonatokkal (100, 250 és 500 ug/ml) kezeltük. A sejteket 24 órán át inkubáltuk.

A citotoxicitási tesztet Alamar Blue assay-vel (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Hollandia) végeztük. Inkubálás után 60 uM koncentrációjú resazurin oldatot adtunk a lyukakba, majd a lemezeket 2 órára 37 fokos inkubátorba helyeztük. Ezen idő után a fluoreszcenciát megmértük (入=570nm). Minden extraktumkoncentrációt három ismétlésben végeztünk.

3.6.3. Semleges vörös felvételi vizsgálat

A Neutral Red Uptake Assay a második teszt, amelyet a PRE, PGE, KTE, CTE és GGE citotoxicitásának meghatározására használnak. Először96-a lapos fenekű lemezeket készítettük elő az előző részben leírtak szerint. A sejteket 24 órán át a kivonatokkal kezeltük, leszívtuk, és semleges vörös festékkel (40 ug/ml) helyettesítettük, és 2 órán át inkubáltuk. Ezen idő elteltével a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal mostuk. A következő lépésben színtelenítő puffert (150 μL) adtunk a lyukakba. Ezután az optikai sűrűség (OD) mérésével 540 nm-en határoztuk meg a semleges vörös dve felvételét. Minden extraktumkoncentrációt három ismétlésben végeztünk.

3.7. A fényvédő faktor meghatározása (in vitro)

A fényvédő faktort (SPF) úgy határoztuk meg, hogy megmértük a kivonatok vizes oldatának abszorbanciáját 10 ug/ml és 50 ug/ml koncentrációban a 290 és 320 nm közötti hullámhossz-tartományban, 5- nm-es időközönként. A kapott eredményekből az SPF-t a Mansur-egyenletből [90] számítottuk ki: ahol∶ EE（λ） – bőrpír hatásspektrum, I (入) – napsugárzás intenzitási spektruma, ABS(入) – a fényvédő termék abszorbanciája, CF- korrekciós tényező (=10), E (N) × I (λ) – a Sayre által meghatározott értékeket használtuk [91].

3.8. Transzepidermális vízveszteség (TEWL) és a bőr hidratáltságának mérése

A TEWL és a bőr hidratáltságának mérését TEWAmeter TM 300 szondával és Corneometer CM 825 szondával végeztük, amely MPA adapterhez volt csatlakoztatva (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Németország). A vizsgálatban öt önkéntes vett részt. Az alkarjukon. bőrön hat (2 × 2 cm-es) területet jelöltünk meg A vizsgált növényi kivonatokból öt helyre 0,2 ml mennyiséget vittünk fel, a hatodik helyen a kontroll (mintával nem kezelt) 60 és 360 perc elteltével. 5 független mérés (bőrhidratáció) és 20 mérés (TEWL) számtani átlaga lett (minden önkéntestől).

3.9. Kivonatokat tartalmazó modellkozmetikumok (sminklemosó) készítése

Model kozmetikai (sminklemosó) készült. Az összes felhasznált komponens megfelelt az EcoCert és a COSMOS követelményeinek. A készítményt a 7. táblázat mutatja.

A terméket úgy állítottuk elő, hogy az összetevőket (1. tételtől 6. tételig) szobahőmérsékleten addig kevertük, amíg homogén folyadékot nem kaptunk. Az utolsó lépésben a készítmény pH-ját beállítottuk. A sminklemosót részekre osztották. A kivonat törzsoldatainak 1%-át minden adaghoz hozzáadtuk, és alaposan összekevertük.

3.10. A kivonatokat és kozmetikumokat (sminklemosó szerek) tartalmazó kivonatok színparamétereinek meghatározása

A kivonatmintákat és a kivonatot tartalmazó kozmetikumokat szobahőmérsékleten teszteltük, 48 órával az elkészítést követően. A színparaméterek (CIELAB koordináták) kiértékeléséhez CHROMA METER CR-400 (Konica Minolta, Sensing Inc., Tokió, Japán) szolgált. A CIELAB rendszert a Nemzetközi Világítási Bizottság határozta meg 1978-ban. Három színattribútumon alapul: L*, a*,b, ahol L* a Munsell-rendszer értékével arányos fényerő-változó, valamint a* és b* kromatikus koordináták. Az a* és b* koordináták a piros/zöld, illetve a sárga/kék tengelyen lévő pozíciókat jelzik ( plusz a=piros, -a=zöld; plusz b=sárga, - b =kék).

A kapott adatok: L*, a* és b* alapján a következő színparamétereket számítottuk ki: színárnyalat (C*) és színárnyalat (h). A következő egyenleteket használták:

4. Konklúziók

A kapott eredmények alapján megállapítható, hogy a vizsgált növényi kivonatok számos pozitív tulajdonságot mutatnak, amelyeknek köszönhetően biztonságos és bioaktív összetevőjükként felhasználhatók a kozmetikumok gyártásában. Kimutatták, hogy ezek a növények polifenolok gazdag forrásai, ami antioxidáns tulajdonságokkal ruházza fel őket. A PRE mutatta a legjobb szabad gyökök megkötő képességét, ami valószínűleg azért van, mert más növényekhez képest ez tartalmazza a legtöbb polifenolt. A PGE és a PRE mutatta a legjobb képességet a sejtek ROS termelésének csökkentésére. Ezenkívül a növények nem mutatnak citotoxikus aktivitást. Minden vizsgált kivonat gátló hatást mutatott az elasztáz és kollagenáz enzimekre, a P. granatum és a GGE a legnagyobb gátló hatást. Ez arra utalhat, hogy ezek a növények felhasználhatók a kozmetikumokban, mint olyan anyagok, amelyek lassítják az öregedési folyamatokat. Ezenkívül a kapott eredmények azt mutatják, hogy ezek a növények gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkeznek. Ebben az esetben a CTE és a KTE tűnt a legjobbnak. A KTE és a PGE alacsony koncentrációban is védő hatást mutatott az UV sugárzás ellen. Magasabb koncentrációknál minden növény rendelkezett UV-védő hatással. Ezenkívül a növények pozitív hatással voltak a bőr hidratálására és csökkentik a transzepidermális vízveszteséget. A PRE, KTE és CTE kivonatok hatékony színezőanyagként használhatók kozmetikai termékekben. A fent említett kivonatokat tartalmazó sminkeltávolító modellfolyadékot intenzív és időben stabil szín jellemezte. A PGE és GGE kivonatú kozmetikumok színét csak tapasztalt megfigyelők vehetik észre, és nem térnek el lényegesen a vak kozmetikai mintától, kivonat hozzáadása nélkül. Az összes kapott eredményt figyelembe véve megállapítható, hogy a Papaver rhoeas, a Clitoria ternatea és a Carthamus tinctorius sikeresen alkalmazható sárga, narancssárga, kék és lila színezékforrásként biztonságosan használható kozmetikumok gyártásában, és mi több, pozitív hatással lesz a bőrre.

Ez a cikk a Molecules 2022, 27, 922-ből származik. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules