A glükóz anti-melanogén hatást fejt ki a melanocitákban lévő tirozináz közvetett inaktiválásával és az emberi bőr egyenértékével

Absztrakt:

A cukrok mindenütt jelen vannak az organizmusokban, és jól ismert kozmetikai összetevők a bőr hidratálására minimális mellékhatásokkal. A glükózt, az élő sejtek energiaforrásaként használt egyszerű cukrot gyakran használják bőrápoló termékekben. Számos jelentés kimutatta, hogy a cukornak és a cukorral rokon vegyületeknek anti-melanogén hatása van a melanocitákra. Azonban a mögöttes molekuláris mechanizmus, amellyel a glükóz gátolja a melaninszintézist, nem ismert, bár a glükózt fehérítőként és hidratáló összetevőként is használják a kozmetikumokban. Itt azt találtuk, hogy a glükóz jelentősen csökkentette a melanocita-stimuláló hormon (MSH) által stimulált B16-sejtek és a sötéten pigmentált normál humán melanociták melanintartalmát, citotoxicitás jelei nélkül.

Ezenkívül a glükóz helyi kezelése fotózással, Fontana-Masson (F&M) festéssel és többfotonos mikroszkóppal bizonyította fehérítő hatékonyságát pigmentált 3D-s emberi bőrmodellben, a MelanoDermben. A glükóz azonban nem változtatta meg a melanocitákban lévő fő melanogén fehérjék génexpresszióját vagy fehérjeszintjét. Míg a glükóz erőteljesen csökkentette az intracelluláris tirozináz aktivitást a melanocitákban, nem csökkentette a gomba tirozináz aktivitását egy sejtmentes kísérleti rendszerben. A glükóz azonban tejsavvá metabolizálódott, ami erőteljesen elnyomja a tirozináz aktivitást. Így arra a következtetésre jutottunk, hogy a glükóz közvetve gátolja a tirozináz aktivitást a tejsavvá való átalakulás révén, ami megmagyarázza melanocitákban kifejtett melanogénellenes hatását.

A tirozináz egy enzim, amely le tudja bontani a fehérjében lévő tirozint, és tirozin oxidációs termékekké alakítja, például tirozin fenollá és más anyagokká. Ez az enzim széles körben megtalálható az emberi szervezetben, különösen a bélrendszerben, ahol részt vesz az emésztésben és a táplálék felszívódásában. A kutatás során ugyanakkor kiderült, hogy a cistancs csökkentheti a tirozináz aktivitását, és így fehéríti a bőrt.

Kattintson arra, hogy mi a cistanche

Kulcsszavak:

melanogenezis; cukor; szőlőcukor; tirozináz; emberi bőr egyenértékű

1. Bemutatkozás

A melanogenezis a melanin termelés folyamata, és elengedhetetlen a bőr védelméhez. A melanin elnyeli az ultraibolya (UV) fényt, és védi a bőrt az UV fény és a szabad gyökök káros hatásaitól [1]. Mivel azonban a melanin túlzott termelése hiperpigmentációt, például szeplőket és lentigo-t okoz, amelyek esztétikusnak tekinthetők, sok kutatást szenteltek a kozmetikumok vagy gyógyszerek hatékony pigment-eltávolító összetevőinek megtalálására [2–4].

A cukor erős nedvesítőszer a bőr hidratálására, és kozmetikai összetevőként használják a bőr hidratálására minimális mellékhatásokkal. Ezenkívül a cukrok és a cukorral rokon anyagok befolyásolják a melanogenezist [5,6]. A melaninszintézisben kulcsfontosságú enzim, a tirozináz glikozilációja megváltoztatható, ami gátolja a katalitikus aktivitását és felgyorsítja a lebomlását [7]. A cukrok melanogenezisben betöltött szerepére a glikozilációnak a melanociták pigmentációs fenotípusára kifejtett hatását és a cukormaradékok tirozináz katalitikus aktivitására gyakorolt ​​hatását vizsgáló tanulmányok hangsúlyozták [5–7]. Egyes tanulmányok arról számoltak be, hogy a cukorszármazékok gátolhatják a tirozináz érését, befolyásolva annak glikozilációját. Például az N-acetil-glükózamin (NAG), egy amino-hexóz, amelyet fiziológiásan állítanak elő egy aminocsoport glükózhoz való hozzáadásával, megzavarja a tirozináz glikozilációját, ami depigmentáló hatást vált ki a tengerimalac bőrén és az emberi bőrön [8].

Ezenkívül a közelmúltban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a cukorral rokon vegyületek gátolják a tirozináz expresszióját vagy aktiválását, valamint megváltoztatják annak glikozilációját. Például értékeltük a galakturonsav (GA) fehérítő hatékonyságát, egy cukorsav, amely a galaktóz oxidált formája és a pektin fő összetevője. A galakturonsav fehérítő hatást fejt ki a tirozináz aktivitásának és expressziójának szabályozásán keresztül a B16 egér melanoma sejtekben és az emberi bőr ekvivalensében [9]. Egy másik jelentésben a ciklikus oligoszacharidok új típusa, a ciklikus nitrozil-nigeróz (CNN) gyenge, de jelentős közvetlen gátló hatást mutatott a tirozináz enzimaktivitására, ami a hipopigmentáció egyik lehetséges mechanizmusára utal [10]. A megfelelő glikozilációval történő tirozináz éréshez hasonlóan a CNN expressziója vagy aktivitása antimelanogén szerek célpontja lehet [11]. Számos anti-melanogén szernek azonban súlyos mellékhatásai vannak, mint például a vitiligo [12,13]. Ezért nagy az érdeklődés a biztonságosabb pigment-eltávolító vegyületek iránt.

Itt megvizsgáltuk a glükóz anti-melanogén hatásait a B16 egér melanomasejtekre és a normál humán melanocitákra. Ezenkívül megvizsgáltuk a szövetek színét és az epidermális állapotot emberi bőr ekvivalens szövetmetszet-festésével. Eredményeink alapján azt feltételezzük, hogy a glükóz fehérítő hatása a tejsavtermeléstől függ, ami tirozináz inaktivációt eredményez.

2. Eredmények

2.1. A glükóz melanogén elleni hatékonysága B16-ban és NHM-ekben

A glükóz anti-melanogén hatásának vizsgálatához kétféle melanocitát, B16 melanoma sejteket (egér melanoma sejtvonal) és normál humán melanocitákat (NHM) használtunk. Először is meghatároztuk, hogy a glükóz toxikus-e a B16 sejtekre. A glükóz nem mutatott citotoxicitást 100 mM-ig terjedő koncentrációban B16 sejtekben, amint az az 1A. ábrán látható. A citotoxicitási adatok alapján a B16 sejteket különböző koncentrációjú glükózzal kezeltük 72 órán keresztül a melanogenezist indukáló -melanocyte-stimuláló hormon (MSH) jelenlétében. Amint az 1B. ábrán látható, a glükóz egyértelműen és jelentősen csökkentette az intracelluláris melanintartalmat dózisfüggő módon. A kojsavat (KA) referenciavegyületként használták a melanogenezis elleni küzdelemben, mivel gyakran használják bőrvilágosító kozmetikai összetevőként [1,3,4]. A glükózzal kezelt sejtekben a lizátumok színe világosabb volt, mint a kontrollsejtek színe (1C. ábra).

Ezenkívül megerősítettük, hogy a táptalajba szekretált melanin mennyisége csökkent, és a táptalaj színe kivilágosodott (1D ábra). Ezt követően a glükóz anti-melanogén hatását vizsgáltuk sötét pigmentált NHM-eken. A glükóz 100 mM-ig nem volt citotoxikus 4 napig (1E. ábra). Amikor az NHM-ek 4 napos glükózkezelése után meghatároztuk a melanintartalmat, azt találtuk, hogy a melanintartalom dózisfüggő módon csökkent (1F ábra). Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a glükóz elnyomja a melaninszintézist a melanocitákban.

2.2. A glükóz fehérítő hatása egy 3D-s emberi bőrre

A glükóz anti-melanogén képességének további meghatározásához egy pigmentált 3D-s emberi bőrmodellt, a MelanoDermet használtuk. Az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint glükózt alkalmaztunk helyileg a MelanoDerm-re 18 napig, és a sejtek életképességét CCK-8 vizsgálattal határoztuk meg. Amint a 2A. ábra mutatja, 18 napos glükózkezelés után nem figyeltek meg szöveti citotoxicitást. A szövetek színváltozásait fényképezéssel értékeltük. A 2B. ábrán látható módon a glükózzal kezelt szövet világosabb színű volt, mint a foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) kezelt szövet. Ezenkívül a hematoxilinnel és eozinnal (H&E) végzett festés kimutatta, hogy a glükóz nem okoz szövetösszeomlást, míg a fontana-masson (F&M) festés azt mutatta, hogy a glükóz csökkenti a hiperpigmentált melanociták számát (a nyilak jelzik) a bazális rétegben (2C. ábra). .

A melanintartalom változásának további vizsgálatához összehasonlítottuk a melanin autofluoreszcencia jeleit a PBS-sel és glükózzal kezelt szövetek melanocita rétegeiben, kétfoton gerjesztő fluoreszcencia (TPEF) mikroszkóppal, amint az a 2D ábrán látható. A képek elemzése azt mutatta, hogy a melanin térfogata körülbelül 36 százalékkal, és a melanocitákban gazdag területen a melanin TPEF jelintenzitása körülbelül 38 százalékkal csökkent a glükózzal kezelt szövetekben a PBS-sel kezelt szövetekhez képest.

2. ábra: A glükóz hatása az emberi bőrre, MelanoDerm. (A) A glükózzal kezelt emberi bőr egyenértékeinek életképessége. (B) Az emberi bőr ekvivalenseit (MelanoDerm; n=3) helyileg glükózzal kezeltük 18 napig, majd lefényképeztük. A ∆L érték a világosság mértékét jelzi a PBS-sel kezelt szövethez képest. (C) A szövetmetszetek H&E és F&M festése. A tárgylemezeket formaldehid oldatban rögzítettük, és a festéshez paraffinviaszba ágyaztuk (skála, 5{{10}} µm). A fekete nyilak pigmentált melanocitákat jeleznek. (D) Az emberi bőr ekvivalenseinek melanin képalkotását (200 × 200 × 60 µm3) TPEF mikroszkóppal végeztük. Az álszínű (piros) jelek a melanint jelzik (skála, 50 µm). A grafikonok a melanin mennyiségének és a TPEF-jelek mennyiségi meghatározását mutatják. Az adatok legalább három független mérés átlaga ± SD (*p < 0,05, ***p < 0,001).

2.3. A glükóz hatása a melanogén fehérjék expressziójára a melanocitákban

Ezt követően a glükóz melanocitákban lévő depigmentációs mechanizmusának tisztázása érdekében felmértük a melanogén enzimek, például a tirozináz és a Tyrp{0}} B16 sejtekben és NHM-ekben történő expressziójára gyakorolt ​​hatását. A B16 sejteket glükózzal kezeltük a jelzett ideig -MSH jelenlétében. Ezután Western-blot-vizsgálattal meghatároztuk a tirozináz és a Tyrp{4}} fehérjeszintjét (3A. ábra). A tirozináz és a Tyrp{6}} expressziós szintjét a glükóz egyetlen időpontban sem csökkentette. Ezenkívül a tirozináz transzkriptumszintjét nem befolyásolta a glükóz az -MSH-stimulált B16 sejtekben (3B. ábra). A B16-sejtekhez hasonlóan a tirozináz, a Tyrp{12}} és az MITF fehérjeszintjét nem gátolta a glükóz (3C. ábra) a glükózzal kezelt NHM-sejtekben, és a tirozináz és a Tyrp{14}} mRNS-szintje sem volt gátlásos. csökkent, de enyhén emelkedett a glükóz hatására (3D. ábra).

3. ábra: A glükóz hatása a melanogén fehérjék expressziójára B16 sejtekben és NHM-ekben. (A, B) A B16 sejteket -MSH-val kezeltük a jelzett ideig 20 mM glükóz jelenlétében vagy hiányában. Ezután Western blot (A) és qRT-PCR (B) vizsgálatokat végeztünk. (C) Az NHM-eket a megadott koncentrációjú glükózzal kezeltük 48 órán keresztül. Ezután Western blot vizsgálatot végeztünk. (D) Az NHM-eket a jelzett ideig kezeltük 50 mM glükóz jelenlétében. Ezután qRT-PCR vizsgálatokat végeztünk. Az adatokat legalább három független mérés átlaga ± SD értékében fejezzük ki.

2.4. A glükóz hatása a tirozináz aktivitásra

A glükóz hatásmechanizmusának további meghatározásához megvizsgáltuk, hogy van-e gátló hatása a gomba tirozináz aktivitására. A 4A. ábrán látható módon azt találtuk, hogy a glükóznak nincs gátló hatása a gomba tirozináz aktivitására, ami azt jelzi, hogy a glükóz nem befolyásolja közvetlenül a tirozináz aktivitást. Ezt követően teljes intracelluláris tirozináz aktivitási vizsgálatot végeztünk mind a B16 sejtekből, mind az NHM-ekből származó glükózzal kezelt sejtlizátumok felhasználásával. Érdekes módon az intracelluláris tirozináz aktivitás dózisfüggő módon gátolt a glükózzal kezelt B16 sejtekben -MSH jelenlétében (4B. ábra). Az NHM-ekben a glükóz az intracelluláris tirozináz aktivitást is gátolta (4C. ábra). Ezek az adatok alátámasztják annak lehetőségét, hogy a glükóz közvetve inaktiválja a tirozinázt a melanocitákban.

4. ábra: A glükóz hatása a tirozináz aktivitásra. (A) A glükóz hatása a gomba tirozináz aktivitására sejtmentes rendszerben. (B, C) Celluláris tirozináz aktivitási vizsgálat. (B) A B16 sejteket 24 órán keresztül kezeltük a megadott koncentrációjú glükózzal. Ezután a celluláris tirozináz aktivitási vizsgálatot elvégeztük a módszerek részben leírtak szerint. (C) Az NHM-eket 50 mM glükózzal kezeltük a jelzett ideig. Ezután a celluláris tirozináz aktivitási vizsgálatot elvégeztük a módszerek részben leírtak szerint. A celluláris tirozináz aktivitást a teljes fehérjetartalom normalizálta. Az adatok legalább három független mérés átlaga ± SD (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

2.5. A tirozináz inaktiválása tejsav termelődésével glükózzal kezelt melanocitákban

A glükóz a celluláris laktát metabolitjává alakul, amely az oldatban lévő tejsav, és amelyről beszámoltak arról, hogy hatékony a pigment elváltozások kezelésében [14,15]. Ezért azt feltételeztük, hogy a glükóz tejsavvá alakul a melanocitákban, és a megnövekedett tejsavszint a tirozináz inaktivációján keresztül gátolja a melanogenezist. Ennek a hipotézisnek az értékeléséhez először felmértük a tejsav termelődését glükózzal kezelt melanociták tápközegében. Ahogy az várható volt, a glükóz jelentősen megnövelte a tejsavtartalmat a B16 sejtekkel tenyésztett tápközegben (5A. ábra). Ezenkívül, mivel a tejsavról ismert, hogy közvetlenül gátolja a tirozináz aktivitást [15], megvizsgáltuk, hogy a tejsav elnyomja-e a gomba tirozináz aktivitását. Amint az 5B. ábrán látható, a tejsav drámaian gátolta a gomba tirozináz aktivitását, ellentétben a glükózzal. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a glükóz tejsavvá történő átalakulása melanogénellenes hatást fejt ki a tejsav tirozináz inaktiválása révén.

5. ábra: Laktát termelése glükóz által és a tejsav hatása a tirozináz aktivitásra. (A) Laktát termelés glükózzal kezelt B16 sejtekben. (A) A B16 sejteket 3 napon keresztül kezeltük a megadott koncentrációjú glükózzal. Ezután a tenyésztési táptalaj használatával laktátvizsgálatot végeztünk, a módszerek részben leírtak szerint. (B) A tejsav hatása a gomba tirozináz aktivitására sejtmentes rendszerben. Az adatok legalább három független mérés átlaga ± SD (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001) .

3. Megbeszélés

A cukrokat vagy cukorból származó anyagokat gyakran használják kozmetikai összetevőként a bőr védelmére és fiziológiai szabályozására. Például a raffinóz növeli az mTOR-független autofágiát, és csökkenti a sejthalált az UVB-besugárzott keratinocitákban, jelezve, hogy a raffinóz természetes hatóanyaga potenciálisan korlátozza a fotokárosodást [16]. A trehalóz és a szacharóz az autofágia új aktivátorai humán keratinocitákban egy mTOR-független útvonalon keresztül [17]. Ezek az eredmények új betekintést nyújtanak az autofágia cukor által közvetített szabályozásába a keratinocitákban. A glükóz esetében kimutatták, hogy a topikális glükóz claudin-1 és filaggrin expressziót indukál az atópiás dermatitisz egérmodelljében és a keratinocita-tenyészetben, ami azt jelzi, hogy gyulladáscsökkentő hatása van azáltal, hogy javítja a bőr barrier funkcióját [18]. Ezenkívül a glükóz gátolja a proliferációt és fokozza a bőr keratinocitáinak differenciálódását [19]. Ezért a glükóz szabályozza az epidermális fiziológia különböző aspektusait, például a bőr barrier funkcióit és a keratinociták hidratáltsági szintjét.

A cukrok depigmentáló szerekként működhetnek számos különböző mechanizmuson keresztül, amelyekben a tirozináz is szerepet játszik. Például egyes szerek gátolják a tirozináz érését, míg mások a tirozináz gén expressziójának vagy aktivitásának gátlását indukálják [5,8–10]. Azonban kevés tanulmány vizsgálta a glükóz depigmentációs hatásának hátterében álló mechanizmusokat.

A glükóz melanogenezisre gyakorolt ​​hatásának meghatározásához korábban a máj X-receptorokra (LXR-ekre) összpontosítottunk, amelyek ligandum-aktivált nukleáris receptorok, amelyek kulcsszerepet játszanak a lipid-anyagcserében és a koleszterin-homeosztázisban [20]. Azt találtuk, hogy a máj X-receptor aktiválása gátolja a melanogenezist az extracelluláris szignál-szabályozott kináz (ERK) által közvetített mikroftalmia-asszociált transzkripciós faktor (MITF) lebomlásának felgyorsítása révén [21]. Ezenkívül a glükóz endogén LXR ligandum [22]. Feltételeztük tehát, hogy a glükóz anti-melanogén hatást fejt ki egy LXR-függő útvonal aktiválása miatt. Azonban, amint az a 3C. ábrán látható, a glükóz nem változtatta meg a tirozináz vagy MITF expressziós szintjét, bár az LXR aktiválása csökkentette e fehérjék expressziós szintjét a melanocitákban.

Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a glükóz depigmentáló hatással van a melanocitákra, függetlenül az LXR aktiválásától.

A glükóz az energiatermelés fő szubsztrátja, és számos enzim soros reakciói, úgynevezett glikolízis során hidrolizálják. Számos tanulmány kimutatta, hogy a glikolízisnek csak egy végterméke van, a tejsav, akár aerob, akár anaerob körülmények között. Aerob körülmények között (O2) a laktát a mitokondriális laktát-dehidrogenáz (MLD) szubsztrátjaként hasznosul. Az LDH-k piruváttá alakítják, amely belép a trikarbonsav (TCA) ciklusba. Anaerob körülmények között (N2) a laktát felhalmozódik a citoszolban. Ezért a glikolízis útja a glükózzal kezdődik, mint szubsztrátjával, és a laktát termelésével végződik, mint fő végterméke [23]. Ezenkívül David és mtsai. Megmérték a glükóz azon frakcióját, amely tejsavvá vagy piruváttá alakult át a normál humán melanocitákban [24]. A glükóz metabolitjainak többsége inkább tejsav volt, mint piruvát.

A tejsav egy alfa-hidroxisav (AHA); ezeket a savakat széles körben használják a kozmetikai készítményekben felületi hámlasztóként [25]. Ezen túlmenően a tejsav gátolja a melaninképződést azáltal, hogy közvetlenül gátolja a tirozináz aktivitást, ami a savas természetétől független hatás, ami azt jelenti, hogy a tejsav pigment elváltozásokra gyakorolt ​​hatása nemcsak az epidermális sejtek felgyorsulásának, hanem a melanin képződés közvetlen gátlásának is köszönhető. melanociták [15]. Így arra jutottunk, hogy a glükóz a tejsavtermelésen keresztül fejtheti ki melanogénellenes hatását, mivel a glükóz tejsavvá alakulhat. Ahogy az várható volt, azt találtuk, hogy a glükózkezelés tejsavtermelést eredményezett a melanocitákban (5A. ábra).

Ezenkívül megerősítettük, hogy a tejsav erőteljesen és közvetlenül gátolta a tirozináz aktivitást (5B. ábra). Usuki et al. azt is felfedezték, hogy a tejsav csökkentette az intracelluláris tirozináz aktivitást B16 sejtekben és humán HM3KO sejtekben [15]. A jelentésben a tirozináz és a Tyrp{4}} mRNS- és fehérjeszintjét nem befolyásolta a tejsav. Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a glükóz növeli a tejsavtermelést, és ez a tejsav közvetlenül gátolja a tirozináz aktivitást anélkül, hogy befolyásolná a génexpressziós szintet, ami azt jelzi, hogy a glükóz a melanocitákban a tejsavtermeléstől függő közvetett tirozináz inaktiváción keresztül anti-melanogén hatást fejt ki. További kísérletekre van azonban szükség a tejsav és a glükóz depigmentációban betöltött szerepének igazolására.

A tanulmányból származó összesített adatok előzetes bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a helyi glükóz hatékony fehérítő, valamint hidratáló reagensként használható, amely biztonságosan használható kozmetikumokban és gyógyászati ​​készítményekben.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Anyagok

A D-glükózt, -MSH-t, kojsavat (KA), L-tirozint, L-DOPA-t és tejsavat a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) vásároltuk. A tirozináz és aktin elleni antitesteket az Abcam cégtől (Cambridge, Egyesült Királyság) vásároltuk. A Tyrp{5}} elleni antitestet a Santa Cruz Biotechnology-tól (CA, USA) vásároltuk. Az MITF elleni antitestet a Proteintech-től (város, IL, USA) vásároltuk.

4.2. Sejtkultúra és életképességi vizsgálat

Az American Type Culture Collection-tól (ATCC, Manassas, VA, USA) vásároltunk B16 egér melanoma sejteket, Dulbecco módosított Eagle táptalajt (DMEM) és magzati szarvasmarha szérumot (FBS). A B16 sejteket 4500 mg/l magas glükózt (ATCC 30-2002) tartalmazó DMEM-ben tenyésztettük a gyártó (ATCC) ajánlása szerint, 5 százalék FBS-sel kiegészítve, és 37 ◦C-on, 95 százalék levegőt és levegőt és levegőt tartalmazó párásított atmoszférában inkubáltuk. 10 százalék CO2. A sötéten pigmentált elsődleges NHM-eket a Thermo Fisher Scientific cégtől vásároltuk (#C2025C; Waltham, MA, USA). A sejteket 254-es táptalajban (#M254500) tenyésztettük, amelyet humán melanocita növekedési kiegészítéssel (#S0025) egészítettünk ki, és 37 °C-on inkubáltuk 5 százalékos CO2 atmoszférában. A kísérletekhez a 4. és 7. passzázs közötti elsődleges NHM-eket használtuk. A tenyésztett sejtek életképességét Cell Counting Kit-8 (CCK-8) segítségével értékeltük a gyártó (DOJINDO, Tokió, Japán) leírása szerint.

4.3. Melanintartalom mérése

A melanintartalmat a korábbi jelentésekben leírtak szerint határozták meg [2–4]. Röviden, a B16 sejteket a megadott koncentrációjú glükózzal kezeltük -MSH (200 nM) jelenlétében 72 órán át. Az NHM-eket 4 napon keresztül kezeltük a megadott koncentrációjú glükózzal. Ezt követően az összes sejtet foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) mostuk, és 1 N NaOH-ban oldottuk 60 °C-on 1 órán át. A sejtlizátumokat egy 96-lyukú lemezre vittük, és az abszorbanciát 405 nm-en mértük. Az értékeket az egyes mintaüregekben lévő fehérjekoncentrációk alapján normalizáltuk.

4.4. Gomba tirozináz aktivitási vizsgálat

Megvizsgáltuk a feltüntetett glükózkoncentrációk közvetlen hatását a gomba tirozináz aktivitására. Röviden összefoglalva, 100 µl glükózt tartalmazó foszfátpuffert kevertünk össze gomba tirozinázzal (10 egység/lyuk), és 50 µl 0,03 százalékos L-tirozint vagy L-DOPA-t kevertünk össze desztillált vízben. Ezután a keveréket együtt inkubáltuk 37 °C-on 10 percig, és az abszorbanciát 405 nm-en mértük. Referenciavegyületként a kojsavat (KA), egy jól ismert tirozináz-ellenes szert alkalmaztak.

4.5. Intracelluláris tirozináz aktivitási vizsgálat

Röviden, a B16 sejteket vagy NHM-eket a megadott glükózkoncentrációkkal kezeltük a megadott ideig. Ezután a sejteket PBS-sel mostuk, és 1% Triton X-100-ot és 0,1 mM fenil-metil-szulfonil-fluoridot tartalmazó 50 mM foszfátpufferben (pH 6,8) végzett inkubálással lizáltuk. A sejtlizátumokat ezután 12, 000 fordulatszámmal centrifugáltuk 4 ◦C-on 20 percig. A celluláris tirozinázt tartalmazó felülúszót összegyűjtöttük, és normalizálás céljából meghatároztuk a fehérjetartalmat. A sejtkivonatot L-DOPA-val inkubáltuk foszfátpufferben, és a dopakróm képződését 30 percen belül 405 nm-en mért abszorbancia mérésével követtük.

4.6. RNS izolálás és valós idejű kvantitatív reverz transzkripciós-polimeráz láncreakció (qRT-PCR)

A kiválasztott gének relatív mRNS expressziójának meghatározásához teljes RNS-t izoláltunk TRIzollal (Invitrogen, CA, USA), a gyártó utasításai szerint, és 4 µg RNS-t fordítottunk cDNS-vé RT-premix segítségével (Bioneer, Seoul, South). Korea). A kvantitatív PCR-t ABI 7500 Fast Real-Time PCR rendszerrel (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) végeztük. A tirozináz és a Tyrp{6}} qRT-PCR primer készleteit az Applied Biosystemstől vásároltuk, az amplifikációhoz pedig TaqMan Gene Expression Assay kiteket (Applied Biosystems) használtunk. A célgén expresszióját a riboszomális fehérje laterális szár alegységét (RPLP0) kódoló housekeeping gén expressziójára normalizáltuk. A relatív kvantálást összehasonlító ∆∆Ct módszerrel végeztük a gyártó utasításai szerint.

4.7. Western blottolás

A sejteket kétszer mostuk hideg PBS-sel, majd jéghideg módosított RIPA pufferben (Cell Signaling Technology, MA, USA) lizáltuk, amely proteáz inhibitorokat (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) tartalmazott. Meghatároztuk a teljes fehérjekoncentrációt, és a fehérjéket SDS-PAGE-val 4-12 százalékos gradiens Bis-Tris géleken (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) nitrocellulóz membránokra vittük át (Thermo Fisher Scientific). Az átvitel után a membránokat 5%-os blokkolóoldatban blokkoltuk. A membránokat primer antitestekkel inkubáltuk 4 ◦C-on 24 órán keresztül, mostuk 0,1% Tween-20 (TBST) tartalmú Tris-pufferolt sóoldattal, és 1 órán át peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel tették ki. szobahőmérsékleten. A membránokat háromszor öblítettük TBST-vel. A kemilumineszcens jelet Western blotting ECL reagens (GE Healthcare, Hatfield, Egyesült Királyság) segítségével fejlesztettük ki.

4.8. Háromdimenziós (3D) emberi bőr ekvivalens

Emberi bőrszövet modellként a MelanoDermet (MEL{0}}B; MatTek Corp., Ashland, MA, USA) használtuk. Ez az életképes, helyreállított, 3D emberi bőr ekvivalens fekete donoroktól származik, és normál melanocitákat és keratinocitákat tartalmaz. A MelanoDerm-et a levegő-folyadék határfelületen termesztették EPI-100-NMM-113 táptalajban (MatTek Corp, Ashland, MA, USA). A glükózkezelés előtt a szöveteket 1 ml PBS-sel mostuk a maradék vegyületek eltávolítására. A glükózt PBS-ben oldottuk. A glükóz végső koncentrációja 2 százalék volt. A kontrollmintát csak PBS-sel kezeltük. Glükózt vittünk fel a MelanoDermre az 1., 4., 6., 8., 11., 13. és 15. napon. 18 nap elteltével a MelanoDerm szöveteket 4 százalékos pufferolt formaldehidben fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, 3 µm vastagságúra vágtuk, és alávetettük. a H&E és F&M festéshez. A szövetminták életképességét Cell Counting Kit-8 (CCK-8) segítségével értékeltük a gyártó (DOJINDO, Tokió, Japán) leírása szerint. A MelanoDerm pigmentációját az L* érték változásának összehasonlításával értékeltük.

4.9. Kétfoton gerjesztésű fluoreszcencia (TPEF) képalkotás

A melanin 3D-s humán bőr ekvivalensben való eloszlásának megjelenítéséhez TPEF képalkotást végeztünk, a korábbi jelentéseinkben leírtak szerint [3,4]. Röviden, mindegyik MelanoDerm készítményt 4 százalékos formalinban fixáltuk 24 órán keresztül 4 °C-on, majd mostuk PBS/0,1 százalék BSA-val (marha szérumalbumin, Merck, Branchburg, NJ, USA). A TPEF képeket a bazális rétegből vettük, hogy mérjük az intracelluláris melanint a melanocita rétegben. A mérési térfogatban a melanin relatív TPEF jelintenzitását Image-Pro Premier 3D szoftverrel (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) határoztuk meg.

4.10. L-laktát vizsgálat

A B16 sejteket 1.0 × 105 sejt/lyuk arányban oltottuk be egy 12-lyukú lemezre. 3 napos glükóz kezelés után az extracelluláris laktátszinteket L-laktát kolorimetriás vizsgálati készlettel (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) határoztuk meg a gyártó protokollja szerint.

4.11. Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SD-kben (standard deviációk) fejeztük ki, a statisztikai szignifikanciát Student-féle t-próbával határoztuk meg. A < 0,05 p-értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

A szerző hozzájárulásai:

Conceptualization, H.-JK, JL és CSL; Adatkezelés, SHL; Nyomozás, SHL; Módszertan, SHL, I.-HB és E.-SL; Felügyelet, JL és CSL; Írás – eredeti piszkozat, SHL és CSL; Írás – áttekintés és szerkesztés, JL. Minden szerző elolvasta és beleegyezett a kézirat közzétett változatába.

Finanszírozás:

Ezt a kutatást az Alapvető Tudományos Kutatási Program finanszírozta a Koreai Nemzeti Kutatási Alapítványon (NRF) keresztül, amelyet az Oktatási Minisztérium finanszírozott (támogatási szám: 2018R1D1A1B07049402).

Összeférhetetlenség:

A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Rövidítések

-MSH -melanocita-stimuláló hormon

Tyrp-1 tirozinázzal rokon fehérje 1

MITF mikroftalmia-asszociált transzkripciós faktor

NHM normál humán melanociták

TPEF kétfoton gerjesztésű fluoreszcencia

LXR máj X receptor

AHA-k alfa-hidroxisavak

H&E hematoxilin és eozin

F&M Fontana-Masson

Hivatkozások

1. Swalwell, H.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA A melanin szerepének vizsgálata az UVA/UVB és a hidrogén-peroxid által kiváltott celluláris és mitokondriális ROS termelésben és mitokondriális DNS károsodásban humán melanoma sejtekben. Free Radic. Biol. Med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]

2. Lee, CS; Jang, WH; Park, M.; Jung, K.; Baek, HS; Joo, YH; Park, YH; Lim, KM Egy új adamantil-benzil-benzamid-származék, az AP736, a cAMP-PKA-CREB-aktivált mikroftalmia-asszociált transzkripciós faktor és a tirozináz expresszió gátlásán keresztül gátolja a melanogenezist. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Park, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Ó, SG; et al. A Melasolv (3,4,5-trimetoxicinnamát timol-észter) melanogén hatásossága melanocitákban és háromdimenziós emberi bőregyenértékben. Skin Pharmacol. Physiol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]

4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lee, CS A mannozileritrit lipidek gátolják a melanogenezist azáltal, hogy elnyomják az ERK-CREB-MITF-tirozináz jelátvitelt normál humán melanocitákban és egy háromdimenziós emberi bőr ekvivalensben. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]

5. Bin, BH; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG Cukor alapú anti-melanogén szerek fejlesztése. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]

6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK Melanogenezis-gátlók. Acta. Bőr. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]

7. Ando, ​​H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Hallás, VJ Megközelítések a melanin bioszintézis inhibitorainak azonosítására a tirozináz minőségellenőrzésével. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]

8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, ÉN; Yoon, TJ A tirozináz glikoziláció megzavarása az N-acetil-glükózamin által és depigmentáló hatása tengerimalac bőrben és emberi bőrben. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]

9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW A galakturonsav depigmentációs hatékonysága tirozináz szabályozáson keresztül B16 rágcsáló melanoma sejtekben és egy háromdimenziós emberi bőr ekvivalensben. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]

10. Nakamura, S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Egy nem ciklodextrin ciklikus szénhidrát hatása egér melanoma sejtekre: Egy új típusú hipopigmentált cukor jellemzése. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]

11. Khan, MT Természeti erőforrásokból származó új tirozináz inhibitorok – Számítógépes vizsgálataik. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]

12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: Frissített áttekintés a biológiai, kémiai és klinikai szempontokról. Pigment. Sejt. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Park, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Park, NH; Lee, JH; Park, YH; Shin, SS; et al. Öt pigment-eltávolító vegyület, a rododendron, a málna keton, a monobenzon, a rucinol és az AP736 különböző hatásai az emberi epidermális melanociták melanogenezisére és életképességére. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]

14. Mulukutla, Kr. e.; Khan, S.; Lange, A.; Hu, WS Glükóz metabolizmus emlős sejttenyészetben: Új betekintés a szüreti útvonalak módosításához. Trendek. Biotechnol. 2010, 28, 476–484. [CrossRef]

15. Usuki, A.; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y.; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. A glikolsav és a tejsav gátló hatása a melanin szintézisére melanoma sejtekben. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]

16. Lin, S.; Li, L.; Li, M.; Gu, H.; Chen, X. A Raffinose növeli az autofágiát és csökkenti a sejthalált UVB-besugárzott keratinocitákban. J. Photochem. Photobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]

17. Chen, X.; Li, M.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M.; Huang, J.; Chen, K.; Gu, H. A trehalóz, a szacharóz és a raffinóz az autofágia új aktivátorai humán keratinocitákban mTOR-független útvonalon keresztül. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]

18. Yamada, K.; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. A helyi glükóz Claudin-1 és Filaggrin expresszióját idézi elő az atópiás dermatitisz egérmodelljében és keratinocita-tenyészetben, gyulladáscsökkentő hatást fejt ki a bőrvédő funkció javításával. Acta. Bőr. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]

19. Szpravcsikov, N.; Szizjakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. A glükóz hatása a bőr keratinocitáira: A cukorbetegség bőrszövődményeinek következményei. Diabetes 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]

20. Castrillo, A.; Tontonoz, P. Nukleáris receptorok a makrofágbiológiában: A lipidanyagcsere és a gyulladás kereszteződésében. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004, 20, 455–480. [CrossRef]

21. Lee, CS; Park, M.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Fia, ED; Park, YH; A Lim, KM Liver X receptor aktiválása gátolja a melanogenezist az ERK által közvetített MITF degradáció felgyorsításán keresztül. J. Invest. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]

22. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, E.; Molteni, V.; Kreusch, A.; Saez, E. Az LXR nukleáris receptor egy glükózérzékelő. Természet 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]

23. Schurr, A. Szénhidrát; IntechOpen: London, Egyesült Királyság, 2017; 21–35.

24. Scott, D.; Richardson, A.; Filipp, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Rónai, Z.; Osterman, A.; Smith, J. Comparative metabolic Flux profiling of melanoma cell lines: Beyond the Warburg effect. J. Biol. Chem. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]

25. Tang, SC; Yang, JH Az alfa-hidroxi-savak kettős hatása a bőrre. Molecules 2018, 23, 863. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com