A ginsenoside Rh23, egy új anti-melanogén vegyület izolálása és mennyiségi meghatározása a Panax ginseng leveleiből

Absztrakt:

Egy új ginzenozid, ginzenozid Rh23 (1) és 20-O- -D-glükopiranozil-3,6, 12,20,25-pentahidroxidammar{10}} (2) izoláltuk a hidroponikus Panax ginseng leveleiből. A vegyületeket különféle oszlopkromatográfiával izoláltuk, és szerkezetüket spektroszkópiai módszerekkel határoztuk meg, beleértve a nagy felbontású kvadrupól/repülési idő tömegspektrometriát (HR-QTOF/MS), magmágneses rezonancia (NMR) spektroszkópiát és infravörös (IR) spektroszkópiát. . Az anti-melanogén aktivitás meghatározásához az azonosított vegyületekkel kezelt Melan-a sejtekben a melanintartalom változását teszteltük.

Ezenkívül egy zebradán in vivo modellben vizsgáltuk a ginsenozid Rh23 melanin gátló hatását a pigmentációra. Az 1. vegyület hatékony melanogenezist gátolt melan-a sejtekben 37.0 százalékos melanogenezis gátlással 80 µM-nál, és gátolta a test pigmentációját is a zebradán modellben. Bár a 2. vegyület valamivel alacsonyabb gátló aktivitást mutatott, mint az 1. vegyület, szignifikánsan csökkent melanogenezist is mutatott a Melan-a sejtekben és a zebrahal modellben. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a hidroponikus P. ginsengből izolált vegyületek új bőrfehérítő vegyületként használhatók in vitro és in vivo rendszerekben. Ezenkívül ez a tanulmány bemutatta az MS-alapú 1. vegyület kvantitatív analízishez való hasznosságát. A hidroponikus P. ginseng leveleiben 0,31 mg/g ginzenozid Rh23 (1) volt.

A melanin esetében azt találtuk, hogy a Cistanche jelentősen csökkentheti a tirozináz aktivitását, amely a bőr melanin bioszintézisének fő sebességkorlátozó enzimje, és egy réz és fehérje komplexe. Hidroxilezi a tirozint, a melanintermelés fő nyersanyagát a szervezetben, L-dopa előállítására, majd a dopát dopakinonná oxidálja. A dopakinon egy sor anyagcsere-folyamaton megy keresztül, átrendeződik és polimerizálódik, végül a fehérjékkel egyesülve egy sor melanin pigmentet hoz létre, amelyek barnulást okoznak. A melanin a legfontosabb tényező az emberi test bőrszínének meghatározásában. A túlzott szintézis pigmentált bőrbetegségek, például szeplők, chloasma, öregségi foltok és melanoma kialakulását okozhatja. A tirozináz aktivitás gátlási kutatása révén tehát kiszűrhetők a bőrpigmentációt gátló hatásos összetevők, így látható, hogy a Cistanche deserticola összes glikozidja bőrpigmentációt gátló és fehérítő hatású.

Kattintson a Cistanche adagoló termékre

Kulcsszavak:

ginzenozid Rh23; Panax ginzeng; NMR; UPLC-QTOF/MS; zebrahal; mennyiségi elemzés.

1. Bemutatkozás

A Panax ginseng CA Meyer egy nagyon híres hagyományos gyógynövény az ázsiai országokban. A Panax egy "csodálat" eredetû, ami azt jelenti, hogy minden betegségre gyógyír. A P. ginseng az Araliaceae családjába tartozó évelő lágyszárú növény [1]. A P. ginseng négy-hat éves gyökereit elsősorban terápiás célokra használják. A virágok júniusban nyílnak, a levelek pedig szájpadlás alakúak. A P. ginzenget főleg Kelet-Ázsiában termesztik, beleértve Koreát, Kínát és Japánt [2]. A mai napig számos tanulmány számolt be a ginzeng gyökereinek, leveleinek és bogyóinak kémiai összetevőiről; több mint 100 féle ginzenozidot izoláltak. A P. ginseng különféle bioaktivitásairól számoltak be, mint például az immunmoduláló aktivitás fokozása, a táplálkozás megerősítése, a májfunkció javulása, cukorbetegség elleni, rákellenes, antiapoptotikus és antioxidáns aktivitás [3–10].

Jelenleg fokozatosan növekszik az érdeklődés a jóléthez kapcsolódó, kiváló minőségű mezőgazdasági termékek iránt, ami a ginzeng hidroponikus termesztéséhez vezet. A hidroponikus termesztés előnye az egyszerű művelési folyamat és a rövidebb növekedési periódus, mint a talajművelésé. A hidroponikus ginzengnek mindössze 2-4 hónapra van szüksége egy olyan rendszerben, amely szabályozza a hőmérsékletet, peszticidmentes, nedves, könnyű, szerves összetevőket tartalmaz stb. [11]. A talajművelő ginzeng leveleit nem használják gyógyászati ​​célokra és funkcionális zöldségfélékre, míg a hidroponikus ginzeng levelei felhasználhatók.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. Végeredményben a hidroponikus körülmények magas ginzenozid tartalomhoz vezettek, és a levelek teljes ginzenozid tartalma lényegesen magasabb volt, mint a gyökerekben, ami arra utal, hogy a ginzeng levelei jó forrásai lehetnek a funkcionális zöldségeknek és gyógynövényeknek.

Számos ismert fehérítő vegyület, például az arbutin és a kojinsav melanogenezis csökkentésében való hatékonyságát vizsgálták [13]. Sajnos biztonságosabb és hatékonyabb bőrfehérítő szereket kell találni a kojinsav rákkeltő potenciálja, valamint az arbutin biztonságossága és mellékhatásai miatt [14]. Emiatt a kozmetikai iparban folyamatosan nagy figyelmet fordítanak új természetes termékek kifejlesztésére [15,16]. Számos tanulmány beszámolt a talajban termesztett P. ginseng melaninszintézisének gátlásáról [17–20].

Ezeket a vizsgálatokat azonban jól ismert vegyületekkel, például fahéjsavval és fenolos vegyületekkel végezték, és a hidroponikus P. ginseng (HPGL) leveleiről nem számoltak be fehérítő hatásról. Folyamatos munkánk eredményeként kisebb ginsenozidokat izoláltunk a HPGL-ből. Általában a ginzenozidok kis mennyiségben vagy nyomokban nem mutathatók ki HPLC-vel. Ellenkező esetben az analitikai idő nagyon hosszú, ami nem alkalmas a ginzengfűszerek ginzenozidjainak minősítésére [21,22]. Az új vegyületek gyors számszerűsítéséhez olyan gyors és érzékeny módszert kell kidolgozni, amely képes alaposan kimutatni az új vegyületek nyomait. A jelen tanulmányban egy érzékeny ultranagy teljesítményű folyadékkromatográfiát hoztak létre kvadrupól/repülési idő tömegspektrometriás (UPLC-QTOF-MS) módszerrel az új vegyület mennyiségi meghatározására.

A fenti leírás alapján ebben a munkában egy új vegyület izolálását és azonosítását, beleértve a fizikai tulajdonságokat és a mennyiségi meghatározást is spektroszkópiai módszerekkel tártuk fel, valamint antimelanogén hatásukat in vitro és in vivo rendszereken keresztül vizsgáltuk.

2. Eredmények és megbeszélés

A hidroponikus Panax ginseng (HPGL) leveleit vizes metanollal extraháltuk, és etil-acetát (EtOAc), n-butanol (n-BuOH) és H2O frakciókra osztották. Az n-BuOH-frakció ismételt SiO2- és ODS-oszlopkromatográfiája egy új ginzenozidot (1) eredményezett, és egy ritka ginzenozidot (2) izoláltunk a HPGL EtOAc-frakciójából.

Az 1. vegyület, fehér por (metanol), a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálaton lilás színt mutatott 1 0 százalékos H2SO4 permetezés és melegítés hatására. A molekulaképlet C37H64O10 a kvázimolekuláris ioncsúcsból, amely m/z 713,44723 [M plusz COOH]− a negatív QTOF/MS-ben. Az IR-spektrum egy hidroxilcsoport (3377 cm-1) és egy kettős kötés (1647 cm-1) jelenlétére utalt. Az 1H-NMR spektrum (1. táblázat és kiegészítő anyagok) két olefin-metin proton jelet (δH 6,02, 5,64), három oxigénezett metin proton jelet (δH 4,38, 4,03, 3,49), egy metoxi proton jelet (δ118), nyolc és nyolcat mutatott. szingulett metil-proton szignálok (δH 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), ami azt jelzi, hogy az 1. vegyületnek van egy tetraciklusos triterpén része, amely egy transzkonformációjú kettős kötést és három hidroxilcsoportot tartalmaz.

Ezen túlmenően az 1. vegyület protopanaxatriol (PPT) típusúnak bizonyult a metil-proton jelének δH 1,94 (H-28) kémiai eltolódása miatt. A protopanaxadiol (PPD) típusú H-28 kémiai eltolódása általában kb. δH 1,30 mellett figyelhető meg [23]. Ezenkívül egy félacetális protonjelet (δH 5,15), valamint számos oxigénezett metint és metilén proton jelet figyeltek meg δH 4,45–3,95 között, mint egy cukorrész jelét. Az anomer protonjelének csatolási állandójából (J=7,6 Hz) a cukorrész félacetális protonja és H-2 egyaránt axiális elrendezésben volt. A fent említett adatok kombinációja arra a következtetésre jutott, hogy az 1. vegyület protopanaxatriol aminoglikozid. A 13C-NMR spektrum 37 szénjelet mutatott a triterpén-, metoxi- és hexózrészek miatt. Két olefin metin szén (δC 138,5 (C{26}}), 126,8 (C-23)), egy oxigénezett kvaterner szén (δC 74,9 (C{32}})), három oxigénezett metin szén (δC 78,5 (C-3), 7{{90}},3 (C-12), 67,7 (C-6), egy metoxi-szén (δC 50,2 () 25-OCH3)) és nyolc metil-szénatom (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C-27), 26,1 (C-26), 23,0 (C{{) 57}}), 17,6 (C-18), 17,4 (C-19), 17,3 (C-30), 16,4 (C-29)) jeleket figyeltek meg a aglikon rész. Az 1. vegyület NMR-adatai hasonlóak voltak a 2. vegyület adataihoz, kivéve az oxigénezett kvaterner szén kémiai eltolódását, azaz C-25. Ezenkívül a cukrot -glükopiranózként azonosították a hemiacetál (δC 98,3, (C-10 )), négy oxigéntartalmú metin (δC 78,9 (C-30), 78,2 (C{{82) jelekből. }}), 75,2 (C-20), 71,6 (C-40)) és egy oxigénezett metilén (δC 63,0 (C{91}})). A gradiens heteronukleáris többszörös kötés korrelációs (gHMBC) spektrumában hosszú távú korrelációt figyeltek meg az anomer protonjel (δH 5,15 (H-10 )) és az aglikon oxigénezett kvaterner szén jele (δC 83,0 (C) között -20)), ami azt jelzi, hogy a -glükopiranóz a C-20 hidroxilcsoportjához kapcsolódik (1. ábra).

Ezenkívül a metoxi-proton jel (δH 3,18 (25-OCH3)) és az oxigénezett kvaterner szén jel (δc 74,9 (C-25)) közötti korreláció azt jelzi, hogy a metoxi a C{{hoz kapcsolódik. 7}} (1. ábra). A fenti adatok alapján megállapítottuk, hogy az 1 kémiai szerkezete 20-O- -D-glükopiranozil-3 ,6 ,12 ,20 -tetrahidroxi-25- metoxidammar{18}}én, és Rh23 ginzenozidnak nevezték el. A 2. vegyületet 20-O- -D-glükopiranozil-3,6,12,20,25--pentahidroxi-dammar-23-én azonosították az NMR és az MS adatok az irodalomban közölt adatokkal [23,24] (1. ábra). Az 1. és 2. vegyületet először izoláltuk HPGL-ből.

Az UPLC analízissel kimutatott csúcsterületek normalizálása alapján a ginsenozid Rh23 tisztaságát több mint 99 százalékosnak határozták meg. Mivel az UPLC-OTOF/MS alkalmas eszköznek bizonyult a ginsenozid Rh23 azonosítására, a HPGL kivonat összetevőinek szétválasztását UPLC-OTOF/MS segítségével végeztük negatív ion üzemmódban. A 2. ábra az Rh23 ginzenozid és kivonat tipikus összion-kromatogramját (TIC) mutatja tömegdetektálással.

Lineáris kalibrációs görbét kaptunk az Rh23 ginzenozidra különböző koncentrációszinteken. A kalibrációs görbék jellemzőit a 2. táblázat foglalja össze. Amint a táblázatból látható, az Rh23 ginzenozid kiváló korrelációs együtthatókat mutat. A detektorok száma (relatív csúcsterület) lineárisan függött a minta koncentrációjától a 0.02–0,8 µg/mL ginzenozid Rh23 tartományban. A ginsenozid Rh23 LOD értéke 0.002 ppm volt. A ginsenozid Rh23 LOQ-ját 0,005 ppm-ben határozták meg az UPLC-QTOF/MS segítségével negatív ion üzemmódban. A hitelesítési módszerekkel kapott Rh23 ginzenozid mennyisége a HPGL-ben (2. táblázat) 0,319 mg/g volt.

Az anti-melanogén aktivitás meghatározására tisztított és azonosított vegyületekkel kezelt melan-a sejtek melanintartalmának változását vizsgáltuk. A melan-a sejteket 72 órán keresztül kezeltük az 1. és 2. vegyülettel 0 és 80 µM közötti koncentrációban, és a sejtek életképességét CCK-8 sejtéletképességi vizsgálati kittel értékeltük. Az 1. és 2. vegyület sejtéletképessége 80 µM koncentrációnál a melan-a sejt esetében 98,1% feletti, illetve 97,8% volt (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az 1. és 2. vegyület nem citotoxikus természetű. A vegyületek anti-melanogén aktivitásának hatását a 3. ábra mutatja be. Az 1. vegyület melaninszintézisének gátlása 20, 40 és 80 µM koncentrációban 8,4%, 15,6% és 37,0% volt a kontrollhoz képest. A 2. vegyület valamivel alacsonyabb gátló hatást mutatott, mint az 1. vegyület 7,6%, 12,8% és 17,8% 20, 40 és 80 µM koncentrációban. Mindkét vegyület dózisfüggő módon gátolta a melanin szintézist.

Nevezetesen az 1. vegyület mutatta a legmagasabb melaningátló aktivitást, 37.0 százalékot 80 µM koncentrációnál. A jelentések szerint a radix ginseng kivonata 0–1000 µg/ml koncentrációban nem gátolta szignifikánsan a melanint [19], és a fahéjsav, a fehérítőszer, amely főleg a P. ginsengben található, 675 µM mellett 29 százalékos gátlást mutatott a melaninszintézisben. [20]. A radix ginseng és a fahéjsav kivonatához képest az 1. vegyület erős melaninszintézis-gátló hatást mutatott, sőt, nyolcszor alacsonyabb koncentrációban 1,{12}}szer nagyobb melaninszintézist gátló aktivitást mutatott, mint a kumársav [ 17,20].

A zebrahal az emberhez hasonló szervrendszerei és génszekvenciái miatt rendkívül előnyös gerinces modellszervezet [25]. Ezenkívül a zebrahal embriók felhasználása egyre nagyobb figyelmet kap, mivel az állatkísérletek helyettesítő módszerének tekintik [26]. A zebrahal felületén melanin pigmentek találhatók, ami lehetővé teszi a pigmentációs folyamat egyszerű megfigyelését bonyolult kísérleti eljárások nélkül [27].

Így megvizsgáltuk az 1-es vegyület melanin-gátló hatását a zebradán pigmentációjára. Pozitív kontrollként PTU-t (N-fenil-tiokarbamid; kéntartalmú tirozináz inhibitor) használtunk (4B. ábra), amelyet széles körben használnak a zebrahal-kutatásban [28,29]. Ahogy a 4C. ábrán látható, az 1. vegyülettel végzett kezelés D, 40 és 80 µM a zebradán test pigmentációjának figyelemreméltó gátlását eredményezte, ami figyelemre méltóan csökkentette a teljes melanintartalmat a kontroll vivőanyaghoz képest (4A. ábra).

Ebben a vizsgálatban az új ginzenozid Rh23-at (1) izoláltuk hidroponikus P. ginseng levelekből. Eddig több mint 100 ginzenozidról számoltak be ginzengfajokból. A 25-hidroxilezett ginzenozidok azonban ritkán fordulnak elő a természetben, beleértve a ginzeng növényeket is. Ezenkívül nem jelentettek fehérítő aktivitást. A ginzenozid Rh23 gátló aktivitása 37 százalékot mutatott 80 uN koncentráció mellett sejtcitotoxicitás nélkül a melan-a sejtekben, míg a ginsenozid Rh23 nem gátolta az in vitro gomba tirozináz aktivitását (az adatokat nem mutatjuk be). A közelmúltban kimutatták, hogy a ginzeng gyökereiből és leveleiből származó kivonatok vagy tisztított ginzenozidok széles körben antioxidáns tulajdonságokkal rendelkeznek (30, 31), míg a víz vagy a ginzeng szerves kivonata megkötő aktivitást mutatott a DPPH, a szuperoxid anion és a hidroxil gyök ellen (32). Ezért a hidroponikus P. ginseng leveleiből izolált új ginsenozid Rh23 antioxidáns tulajdonsága miatt csökkentheti a tirozinázt. A melanogenezis szerepét azonban még nem vizsgálták. Ezért a további vizsgálatok során meg kell határozni a ginsenozid Rh23 melaninszintézis szabályozására kifejtett hatásának pontos mechanizmusait.

3. Kísérleti

3.1. Tábornok

Az oszlopkromatográfiához Kieselgel 60 és LiChroprep RP-18 gyantákat használtunk (Merck, Darmstadt, Németország). Kieselgel 60 F254-et (Merck) és RP-18 F254S-t (Merck) használtunk szilárd fázisként a vékonyréteg-kromatográfiás kísérletben. A foltok kimutatását a vékonyréteg-kromatográfiás lemezen UV lámpa alatti megfigyeléssel (Spectroline, ENF-240 C/F modell, Spectronics Corp., New York, NY, USA) vagy 10%-os vizes H2SO4 permetezéssel végeztük. lemez, majd melegítés. Az optikai elfordulásokat JASCO P{10}} digitális polariméterrel (Tokió, Japán) mérték. Az olvadáspontokat Fisher-Johns Melting Point Apparatus (Fisher tudományos cég, Pittsburgh, PA, USA) mikroszkóppal határoztuk meg. Az ultraibolya spektrumokat Shimadzu modell UV-1601 spektrofotométeren (Shimadzu Corp., Kyoto, Japán) mérték. Az IR-spektrumokat Perkin Elmer Spectrum One FT-IR spektrométerrel (Buckinghamshire, Egyesült Királyság) vettük. Az NMR-spektrumokat Varian Inova AS 400 spektrométeren vettük fel (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, USA). Az UPLC-QTOF/MS analízist egy negatív ion üzemmódban működő Waters Xevo G2-S sorozat (Waters Corp., Milford, MA, USA) segítségével végeztük.

3.2. Növényi anyagok

A Hydroponic Panax ginzenget az Eumseongban, Chungbuk tartományban található Herbal Crop Research Department üvegházában termesztették a Koreai Köztársaság Vidékfejlesztési Hivatala által kidolgozott "ginseng GAP standard termesztési útmutató" [11,33] protokollja szerint. Az egyéves, 0,8–1 g tömegű ginzeng palánta gyökereit az Országos Kertészeti és Gyógynövénytudományi Intézet (NIHHS), Vidékfejlesztési Igazgatóság (RDA) Gyógynövénykutatási Osztályától vásároltuk, és egy Használat előtt tartsa alacsony hőmérsékleten (1–2 ◦C). A ginzeng palánta gyökereit tápfürdőbe ültették át, és hidroponikus rendszerben tenyésztették. Három hónapos tenyésztés után a hidroponikus ginzengeket kihúzták betakarítás céljából. A betakarított hidroponikus ginzeng növényeket vízzel lemostuk a portól, levelekre és gyökerekre válogattuk, majd 72 órán át fagyasztva szárítógépben (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Korea) szárítottuk. Az utalványmintát (NIHHS14-03) a NIHHS, RDA, Eumseong, Koreai Köztársaság Herbal Crop Research Department of Herbal Crop Research herbáriumában helyezték el.

3.3. Kivonás és izolálás

A hidroponikus P. ginseng (HPGL, 6 kg) szárított és porított leveleit szobahőmérsékleten 80%-os MeOH-val (30 liter × 3) extraháltuk 24 órán át. Az extraktumokat szűrőpapíron átszűrjük és csökkentett nyomáson 45 °C-on bepároljuk, így 1,4 kg kivonatot kapunk. Az extraktumot vízbe (3 liter) öntöttük, és egymás után háromszor etil-acetáttal (3 liter) és n-BuOH-val (2,6 liter háromszor) extraháltuk. Mindegyik réteget csökkentett nyomáson betöményítettük, így EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) és H2O (855 g) frakciókat kaptunk.

Az n-BuOH-frakciót (HPGLB, 130 g) szilikagél oszlopra vittük fel (φ 13 × 17 cm), és CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{42}) eleggyel eluáltuk. } L → 6:4:1, 110 L), így 20 frakciót kapunk (HPGLB1-től HPGLB2-ig0). A HPGLB3 és a HPGLB4 frakciókat egyesítettük (18,9 g, Ve/Vt=0.05–0,12), és tovább frakcionáltuk a szilikagél oszlopon (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L), így 14 frakciót kapunk (HPGLB3-1 - HPGLB3-14). A HPGLB3-4 és a HPGLB3-5 frakciókat egyesítettük (1,27 g, Ve/Vt {{40}},09–0,16), és tovább frakcionáltuk az ODS oszlopon (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 L), így kilenc frakciót kapunk (HPGLB3-4-1 - HPGLB3-4-9). A HPGLB3-4-3 frakciót (119,4 mg, Ve/Vt=0,14–0,26) tovább frakcionáltuk az ODS oszlopon (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1: 1, 1). L) kilenc frakciót kapunk (HPGLB3-4-3-1 - HPGLB3-4-3-9), beleértve az 1. vegyületet (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0,42–0,55, TLC Rf=0,40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0,50 (Kieselgel 60 F254, CHCI3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). A HPGLB5–HPGLB7 frakciókat egyesítettük (24,0 g, Ve/Vt=0,12–0,22), majd szilikagél oszlopon tovább frakcionáltuk (φ 7 × 12 cm, CHCI3–MeOH–H2O=10): 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L), így 16 frakciót kapunk (HPGLB5-1 - HPGLB5-16). A HPGLB5-6 frakciót (323,1 mg, Ve/Vt=0,28–0,31) tovább frakcionáltuk az ODS oszlopon (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3:2, 1,2). L → 3:1, 1,5 L), így tíz frakciót kapunk (HPGLB5-6-1 - HPGLB5-6-10), beleértve a 2. vegyületet (HPGLB5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 0,21–0,23, TLC Rf=0,50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0,45 (Kieselgel 60 F254, CHCI3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Spektroszkópiai adatok

1. vegyület. Fehér por, olvadáspont: 138–140 °C; [ ] 25 D plusz 17,4◦ (c=0,39, MeOH); IR (CaF2 ablak): 3377, 2932, 1382 cm-1; negatív QTOF/MS m/z 713,44723 [M plusz COOH]− (C37H64O10-re számítva 668,4499); Az 1H- és 13C-NMR adatokat lásd az 1. táblázatban.

2. vegyület. Fehér por, olvadáspont: 133–136 °C; [ ] 25 D plusz 20,2◦ (c=0,50, MeOH); IR (CaF2 ablak): 3359, 2929, 1384 cm-1; negatív QTOF/MS m/z 699,48311 [M plusz COOH]− (C36H62O10-re számítva 654,4323);1H- és 13C-NMR adatok, lásd az 1. táblázatot.

3.5. Az 1. új vegyület kvantitatív analízise UPLC-QTOF/MS alkalmazásával

Az 1. vegyület standard törzsoldatát úgy készítettük, hogy egyenként 1.00 mg-ot feloldottunk 1 ml metanolban, így 100 mg/ml koncentrációt kaptunk, és 4 ◦C-on tartottuk. A standard törzsoldatot (1) metanollal hígítottuk, hogy a kalibrációs oldatokat 0.{{10}}2–0,8 µg/ml tartományban kapjuk meg. Egy gramm HPGL-kivonatot pontosan lemértünk, rögzített térfogatú (10 ml) metanolban feloldottuk, 0},20 mm-es szűrőpapíron átszűrtük, és 4 °C-ra hűtöttük. . Az UPLC-t Waters ACQUITY H-Class UPLC-vel (Waters Corp., Milford, MA, USA) ACQUITY BEH C18 oszloppal (2,1 × 100 mm, 1,7 µm) végeztük. A mozgó fázisok 0,1 térfogatszázalék hangyasavat tartalmazó vízből (A) és 0,1 térfogatszázalék hangyasavat tartalmazó acetonitrilből (B) tartalmaztak. Az elúciós gradiens a következő volt: 0-4 perc, B 10-30 százalék; 4-15 perc, B 30-60 százalék ; 15–16 perc, B 60–100 százalék ; 16–19 perc, B 100–10 százalék . Az áramlási sebesség 0,45 ml/perc volt, és az injekció térfogata 2 µl volt minden egyes futtatásnál.

Ezután a HR-MS analízist egy Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, USA) segítségével végeztük, amely negatív ion üzemmódban működött. A tömegspektrométerek váltakozó nagy és alacsony energiájú pásztázást végeztek, amelyet MSE adatgyűjtési módnak neveznek. A pontos tömegméréseket olyan automatizált kalibrációs adagoló rendszerrel végeztük, amely belső referenciaként leucin-enkefalint, m/z 554,262 (ESI neg. mód) tartalmazott. Az optimális működési paramétereket a 3. táblázat szerint állítottuk be.

3.6. Sejtkultúra

A melan-a melanociták egy erősen pigmentált, immortalizált, normál egér melanocita sejtvonal, amely C57BL/6 egerekből származik. A vizsgálatban használt melan-a sejteket Dr. Dorothy Bennetttől szereztük be (St. George's Hospital, London, Egyesült Királyság). A sejteket 37 ◦C-on tenyésztjük 95 százalék levegőt, 10 százalék CO2-t tartalmazó RPMI 1640 tápközegben, amelyet 10 százalék hővel inaktivált magzati szarvasmarha szérummal, 1 százalék penicillin/sztreptomicinnel és 200 nM PMA-val egészítettünk ki. A sejtek életképességét a CCK{14}} sejtszámláló készlet-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Japán) segítségével határoztuk meg.

3.7. Melanin Assay

A Melan-a sejteket 72 órán keresztül kezeltük vegyületekkel, majd a sejteket 1 N NaOH-ban oldottuk 60 °C-on 30 percig. Ezután a lizátumokat spektrofotométerrel 450 nm-en mértük. Az adatokat a sejtlizátumok fehérjetartalmára normalizáltuk. A sejtlizátumokat ezt követően feldolgoztuk a fehérjekoncentráció meghatározásához egy BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) alkalmazásával.

3.8. A szülőhalak eredete és karbantartása

A kifejlett zebrahalakat egy kereskedelmi kereskedőtől szereztük be, és 10–15 halat tartottak 5 literes akriltartályban a következő feltételekkel: 28,5 ◦C, 14/10 órás világos/sötét ciklussal. A zebrahalakat naponta háromszor, heti hat napon etették TetraMin pehelytáppal, amelyet élő sós garnélarákokkal (Artemia salina) egészítettek ki. Az embriókat természetes ívásból nyerték, amelyet reggel a lámpa bekapcsolásával váltottak ki. Az embriók gyűjtése 30 percen belül befejeződött. Minden kísérleti protokollt és eljárást a Chungnam National University (CNU-00866) ​​állatetikai bizottságának jóváhagyott irányelvei és előírásai szerint hajtottak végre.

3.9. Vegyületkezelés és fenotípus alapú értékelés

A szinkronizált embriókat összegyűjtöttük és pipettával rendeztük el (7-9 embrió lyukanként 1 ml embrióközeget tartalmazó 24-lyukú lemezeken). A tesztvegyületeket 0,1% DMSO-ban oldottuk fel, majd 9-72 órával a megtermékenyítés után (hpf) (63 óra expozíció) hozzáadtuk az embrió táptalajhoz. A zebrahal pigmentációjára gyakorolt ​​hatást sztereomikroszkóp alatt figyelték meg. A vegyületek egyenletes eloszlásának biztosítása érdekében alkalmankénti keverést, valamint a táptalaj cseréjét naponta végeztük. Minden kísérletben 0,2 mM 1-fenil-2-tiokarbamidot (PTU) használtak átlátszó zebrahal létrehozására anélkül, hogy a fejlődési folyamatba beleavatkoztak volna [33], és ezt standard pozitív kontrollnak tekintették. A test pigmentációjának fenotípuson alapuló értékelését csipesszel dechorionizáltuk, trikain-metánszulfonát oldatban érzéstelenítettük (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), majd 3 százalékos metilcellulózba helyeztük 35 mm-es tányérra (SPL Lifesciences, Pocheon, Korea). és az MZ16 sztereomikroszkóp alatt fényképezték (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Németország).

4. Konklúziók

Ebben a vizsgálatban az Rh23 ginzenozidot (1) izolálták hidrofonikus Panax ginzeng levelekből 20-O- -D-glükopiranozil-3,6,12,20,25- pentahidroxi-dammar{10}}én (2). Általában sikeresek voltunk azon kísérletünkben, hogy a hidroponikus P. ginsengből származó vegyületek hipopigmentáló hatását megszerezzük. A ginzenozid Rh23 és a 20-O- -D-glükopiranozil-3,6,12,20,25-pentahidroxidammar23-én gátolják a melanin bioszintézisét, citotoxikus hatás nélkül melan-a sejtben. Ezenkívül a ginsenoside Rh23, mint alternatív állatmodell, fokozta a zebrahal depigmentációját. A szervezetben a melanintartalom és a pigmentáció csökkenése fehérítő hatást eredményezhet, és a nem citotoxikus hatás a kedvezőbb pont, mivel a kozmetikai termékekben a fehérítőszerek elsődleges szempontja a biztonság.

Ezért jelenlegi eredményeink alapján fontos, hogy az új hidrofonikus P. ginseng vegyületek potenciálisan hatékony bőrvilágító szerként használhatók. A további vizsgálatok meg fogják világítani a ginsenozid Rh23 melaninszintézis szabályozására kifejtett hatásának pontos mechanizmusait, valamint a ginsenozid Rh23 szerkezeti jellemzői és a melanogenezis közötti kapcsolatot, hogy megbizonyosodjanak arról, hogy a ginzenozid Rh23 potenciális fehérítőszer-e a kozmetikai iparban. A hibrid Q-TOF tömegspektrometria előnyei közé tartozik nem csak a minőségi detektálási képesség és érzékenység, hanem a pontos mérés is, ami megkönnyíti a szerkezeti felderítést. Alkalmazható kisebb vagy újszerű vegyületek minőségi és mennyiségi meghatározására, ami segít a ginzeng fűszerek minőségellenőrzésének javításában.

Kiegészítő anyagok:

Az 1 1H-NMR és 13C-NMR spektruma a Kiegészítő anyagokban érhető el.

Köszönetnyilvánítás:

Ezt a munkát a "Mezőgazdasági Tudományos és Technológiai Fejlesztési Együttműködési Kutatási Program" (PJ01136203), Vidékfejlesztési Igazgatóság, Koreai Köztársaság támogatásával végezték. Köszönjük Cheol-Hee Kimnek (Chungnam Nemzeti Egyetem), hogy megosztotta a zebrahal létesítményt.

A szerző hozzájárulásai:

DYL és N.-IB tervezte és tervezte a kísérleteket; H.-GK és Y.-GL izolálta a vegyületeket; A DYL tisztázta a szerkezeteket; I.-BJ közreműködött a növényi anyagok előkészítésében; A JHK elvégezte a biológiai vizsgálatot és segített a kézirat elkészítésében; A JWL és a B.-RC elvégezte a minták NMR-ét, valamint UPLC-QTOF/MS-ét; G.-SK segített a kézirat lektorálásában; és DYL írta a dolgozatot és irányította a kutatási projektet. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végső kéziratot.

Összeférhetetlenség:

A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről. Az alapító szponzoroknak nem volt szerepük a tanulmány megtervezésében; az adatok összegyűjtése, elemzése vagy értelmezése; a kézirat megírása; vagy az eredmények közzétételére vonatkozó döntés.

Hivatkozások

1. Ben, EW; Michael, W. A világ gyógynövényei. In Shinilbooks; Timber Press Inc.: Portland, OR, USA, 2007.

2. Park, JD; Rhee, DK; Lee, YH A Panax ginseng CA Meyer szaponinjainak biológiai aktivitásai és kémiája. Phytochemistry 2005, 4, 159–175. [CrossRef]

3. Kwon, SJ; Chung, DK A hegyi ruha ginseng, a hegyekben termesztett ginseng és a Panax ginseng immunerősítő hatása. J. Orient. Neuropsychiatry 2004, 15, 89–101.

4. Gillis, CN Panax ginseng farmakológia: A nitrogén-monoxid kapcsolat? Biochem. Pharmacol. 1997, 54, 1–8. [CrossRef]

5. Kang, KS; Yamabe, N.; Kim, HY; Yokozawa, T. Sun ginseng metanolos kivonat hatása lipopoliszacharidok által kiváltott májkárosodásra patkányokban. Phytomedicine 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]

6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J.; Yuan, G.; Li, H.; Xu, G.; Han, X.; Du, P.; An, L. A K vegyület hatása a hiperglikémiára és az inzulinrezisztenciára 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő patkányokban. Fioterapia 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]

7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Park, JH; Im, DS A ginzenozid Rg3 és Rh2 hatásai a prosztataráksejtek proliferációjára. Boltív. Pharm. Res. 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]

8. Nocerino, E.; Amato, M.; Izzo, AA A ginzeng afrodiziákum és adaptogén tulajdonságai. Fitoterápia 2000, 71, S1–S5. [CrossRef]

9. Keum, YS; Park, KK; Lee, JM; Chun, KS; Park, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ A hőkezelt ginzeng metanolos kivonatának antioxidáns és daganatellenes hatása. Cancer Lett. 2000, 150, 41–48. [CrossRef]

10. Kim, GS; Lee, SE; Nem, HJ; Kwon, H.; Lee, SW; Kim, SY; Kim, YB Természetes bioaktív termékek hatása az aeroponikus rendszerben tenyésztett Panax ginzeng növekedésére és ginzenozid tartalmára. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]

11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, YM; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT A ginzenozid és a fenolos összetevők tartalmának összehasonlítása hidroponikusan termesztett ginzeng levelekben, gyümölcsökben és gyökerekben. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]

12. Matsuda, H.; Nakamura, S.; Kubo, M. Természetes forrásból származó kutikulagyógyszerek tanulmányozása. II. A Prunus növények gátló hatásai a melanin bioszintézisére. Biol. Pharm. Bika. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]

13. Duncan, CL; Foster, EM A nátrium-nitrit, a nátrium-klorid és a nátrium-nitrát hatása az anaerob spórák csírázására és növekedésére. Appl. Microbiol. 1968, 16, 406–411. [PubMed]

14. Shimizu, K.; Yasutake, S.; Kondo, R. A Chlorophora új tirozináz-gátló aktivitású stilbénje kiváló. Chem. Pharm. Bika. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]

15. Park, SH; Kim, DS; Kim, WG; Ryoo, IJ; Lee, DH; Huh, CH; Youn, SW; Yoo, azonosító; Park, KC Terrin: Egy új melanogenezis-gátló és mechanizmusa. Sejt. Mol. Élet 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]

16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; fia, DW; Park, SJ; Rho, JH; Choi, SY A fahéjsav gátló hatásai a bőr melanin bioszintézisére. Biol. Pharm. Bika. 2008, 31, 946–948. [CrossRef] [PubMed]

17. Hwang, EY; Choi, SY A Panax ginseng CA Meyer különböző részein található fenolos vegyületek kvantitatív elemzése és a melanin bioszintézisre gyakorolt ​​gátló hatása. Koreai J. Med. Crop Sci. 2006, 14, 148–152.

18. Im, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH A radix ginseng és a radix trichosanthis hatása a melanogenezisre. Biol. Pharm. Bika. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]

19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Yoo, KM; Jo, YO A fehér és a vörös ginzeng fenolvegyület-tartalmának összehasonlítása és a melanin bioszintézisre gyakorolt ​​gátló hatása. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.

20. Zhang, YC; Pi, ZF; Liu, CM; Song, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Az alacsony poláris ginzenozidok elemzése párolt Panax ginzengben magas hőmérsékleten HPLC-ESI-MS/MS módszerrel. Chem. Res. Áll. Univ. 2012, 28, 31–36.

21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Luo, GA A gőzöléssel kiváltott kémiai átalakulások és a Panax ginsengből származó vörös ginzeng holisztikus minőségértékelése HPLC-ESI-MS/MSn alapú többkomponensű kvantifikációs ujjlenyomat segítségével. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]

22. Liu, GY; Li, XW; Wang, NB; Zhou, HY; Wei, W.; Gui, MY; Yang, B.; Jin, YR Három új dammarán típusú triterpén szaponin a Panax ginseng CA Meyer leveleiből. J. Asian Nat. Prod. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]

23. Xing, Q.; Liang, T.; Shen, G.; Wang, X.; Jin, Y.; Liang, X. Átfogó HILIC x RPLC tömegspektrometriás kimutatással a szaponinok elemzéséhez Panax notoginsengben. Elemző 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]

24. Szerelem, DR; Pichler, FB; Dodd, A.; Copp, BR; Greenwood, DR technológia nagy áteresztőképességű képernyőhöz: jelen és jövő a zebrahal használatával. Curr. Opin. Biotechnol. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]

25. Uwe, S.; Stefan, S.; Pobert, G.; Petra, G.; Henner, H.; Sepand, R.; Axel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; et al. Zebrafish embriók az állatkísérletek alternatívájaként – Kommentár a védett életszakasz kezdetének meghatározásához az állatjóléti szabályozásban. Reprod. Toxicol. 2012, 33, 128–132.

26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, CD; Lee, JH; Yoo, TJ Zebrafish, mint a melanogén szabályozó vegyületek fenotípus-alapú szűrésének új modellje. Pigment Cell Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]

27. Elsalini, OA; Rohr, KB A feniltiokarbamid megzavarja a pajzsmirigy működését a fejlődő zebrahalban. Dev. Genes Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]

28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; Nem, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, NI A Panax ginseng leveleiből izolált kisebb ginzenozidok melanogenezis inhibitorként való lehetősége. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]

29. Li, J.; Huang, M.; Teoh, H.; Man, RY A Panax quinquefolium szaponinok megvédik az alacsony sűrűségű lipoproteineket az oxidációtól. Life Sci. 1999, 64, 53–62. [CrossRef]

30. Li, TSC; Mazza, G.; Cottrell, AC; Gao, L. Ginzenozidok az amerikai ginzeng gyökereiben és leveleiben. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 717–720. [CrossRef]

31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Park, MW; Cho, HY A vadon élő ginzeng leveleiből származó különféle oldószeres kivonatok antioxidáns tulajdonságai. LWT 2006, 39, 266–274. [CrossRef]

32. Országos Növénytudományi Intézet. Ginseng GAP szabványos termesztési irányelv; National Institute of Crop Science, Rural Development Administration: Suwon, Korea, 2009.

33. Karlsson, J.; Von Hofsten, J.; Olsson, PE Átlátszó zebrahal generálása: kifinomult módszer a génexpresszió kimutatásának javítására az embrionális fejlődés során. Mar. Biotechnol. 2001, 3, 522–527. [CrossRef] [PubMed]

Minta elérhetősége:

Az 1. és 2. vegyület mintái elérhetők a szerzőktől.

Dae Young Lee 1 ID, Hyoung-Geun Kim 2, Yeong-Geun Lee 2, Jin Hee Kim 3, Jae Won Lee 1 ID, Bo-Ram Choi 1, In-Bae Jang 1, Geum-Soog Kim 1 és Nam-In Baek 2,*

1 Gyógynövénytermesztési Kutatási Osztály, Nemzeti Kertészeti és Gyógynövénytudományi Intézet, RDA, Eumseong 27709, Korea; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Keleti Orvostudományi Biotechnológiai Tanszék, Kyung Hee Egyetem, Yongin 17104, Korea; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Beérkezett: 2017. november 28.; Elfogadva: 2018. január 26.; Közzétéve: 2018. január 29

For more information:1950477648nn@gmail.com