Graham{0}}A tanulás egyedi átiratot eredményez

Absztrakt:
A tanulás többszörös skálán indukálhatja a neurofiziológiai plaszticitást a hallókéregben. A hallókérgi funkcióban napokon, heteken át vagy akár egy életen át fennmaradó tartós változások tanulás által kiváltott génexpressziót igényelnek. Valójában a de novo transzkripció molekuláris meghatározója annak, hogy az átmeneti tapasztalatok átalakulnak-e hosszú távú emlékekké, amelyek tartós hatással vannak a viselkedésre.

A tudomány és a technika folyamatos fejlődésével számos mágikus életjelenség jelent meg az emberi élet során, amelyek közül a kutatás szempontjából legértékesebb az emlékezet. Az emlékezet fontos része az emberi fejlett neurális tevékenységnek, és az emberi evolúció óta bekövetkezett különféle események feljegyzése és felhalmozódása is. Tehát van-e kapcsolat a génexpresszió és a memória között? A válasz igen.

Először is, a gének befolyása a memóriára nyilvánvaló. Számos, a memóriával kapcsolatos molekula és fehérje expresszióját képes szabályozni egyetlen nukleotid polimorfizmusok (SNP-k) és más módszerek révén. Ez befolyásolhatja a neuronok közötti kommunikáció hatékonyságát, ezáltal befolyásolhatja az ember kognitív, fogalmi, érzelmi és egyéb jellemzőit, ami a memória minőségét jelzi.

Másodszor, a memória bizonyos hatással lehet a génexpresszióra. Tanulásunk, emlékezetünk és gondolkodásunk folyamatában nemcsak az agy idegi tevékenységének változásai, hanem számos gén és molekula szabályozása és beavatkozása is szerepet játszik. Ezeknek a géneknek és molekuláknak a szabályozása nyomokat rögzít a hosszú távú emlékezetünkben meglévő érzéseknek és tapasztalatoknak megfelelően, és végül a génekben tárolódik.

Végül, kölcsönös függés van a pozitív hozzáállás és a hosszú távú memória képessége között. A boldog hangulat segíthet jobban összpontosítani és koncentrálni a tanulási és gondolkodási folyamat során, ezáltal javítva a memória képességét. A hosszú távú szándékos memória új idegi kapcsolatok és struktúrák kialakulását is elősegítheti az agyban, ami szintén nagyon hasznos a jövőbeni tanulás és memória szempontjából.

Ebből arra következtethetünk, hogy összefüggés van a génexpresszió és a memória között. Tudatos memóriával, optimizmussal és pozitív gondolkodással fejleszthetjük és javíthatjuk memóriaképességünket, ami szintén segíthet a jobb testi és lelki egészség elérésében. Csak így tudjuk jobban szolgálni a társadalmat és az emberi fejlődést. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, és a Cistanche deserticola jelentősen javíthatja a memóriát, mert a Cistanche deserticola egy hagyományos kínai gyógyászati ​​anyag, amelynek számos egyedi hatása van, amelyek közül az egyik a memória javítása. A darált hús hatékonyságát a benne található különféle hatóanyagok jelentik, beleértve a savakat, poliszacharidokat, flavonoidokat stb. Ezek az összetevők különféle módon elősegíthetik az agy egészségét.

Kattintson a know-kiegészítőkre a memória javítása érdekében

Azonban a hallókérgi gének, amelyek támogatják az auditív tanulást, a memóriát és a szerzett hangspecifikus viselkedést, nagyrészt ismeretlenek. Ez a jelentés az első, amely az egész genomra kiterjedő változásokat azonosított a tanulás által kiváltott génexpresszióban a hallókéregben, amelyekről úgy gondolják, hogy a hallómemória kialakulásának hátterében állnak. Az RNS-szekvenálásból származó géndúsítási profilok bioinformatikai elemzései olyan biológiai utakat azonosítottak, amelyek magukban foglalják a kolinergszinapszisokat és a neuroaktív receptor kölcsönhatásokat.

Az eredmények a kortikális funkcióban bekövetkező változások mögött meghúzódó kulcsfontosságú effektorokat jellemzik, amelyek támogatják a hosszú távú hallásmemória kialakulását a felnőtt agyban. Az azonosított molekulák és mechanizmusok potenciális terápiás célpontok, amelyek elősegítik a felnőttkori hallásfunkció hosszú távú és hangspecifikus változásait, és most a jövőbeli gén-célzott vizsgálatok elsődleges fontosságúak.

Kézirat:

A tanulás és a memória területén jól elfogadott koncepció az, hogy az emlékeket ott tárolják, ahol feldolgozzák őket (Nadel és Hardt, 2011). A memóriakonszolidációnak nevezett biológiai események stabilizálhatják az érzékszervi tapasztalatok által kiváltott tranziens neurális reprezentációkat (Lechner, Squire és Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). A memóriakonszolidációt elindító alapvető és evolúciósan konzervált mechanizmusok a transzkripció és a transzláció, amelyeket a gének, illetve az azt követő fehérjetermékeik aktív expressziójaként határoznak meg (Alberini &Kandel, 2014; Costa-Mattioli és mtsai, 2009).

Feltételeztük, hogy a hangalapú megkülönböztetés tanulása de novo génexpressziót indukál a hallókéregben. A hangjelzések nagyon specifikus reprezentációi túlélhetik a tapasztalatok múlékonyságát (másodpercek és percek) azáltal, hogy a hosszú távú memóriába tömörülnek (óráktól napokig), amely később a hangjelzések által irányított viselkedést irányítja. Míg úgy gondolják, hogy a megkülönböztető regionális transzkriptomikus profilok felelősek a memória konszolidációjáért (Katzman és mtsai, 2021), a tanulás által kiváltott transzkripciós események, amelyek támogatják a memória kialakulását a központi hallórendszerben, erősen alul vannak írva.

Ezzel szemben a hallókéreg kivételesen jól le van írva a hallási tanulás és memória vizsgálataiban a neurofiziológiai változások szintjén, különösen a receptív mezők és a tonotopikus térképek szintjén (Schreiner & Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011), cortico- corticalis és cortico-fugal kapcsolat (Souffi és mtsai, 2021; Lesicko és Geffen, 2022; Schreiner és Polley, 2014; Liu és mtsai, 2011; Xiong, Znamenskiy és Zador, 2015), több időskálán is (F Martinsroemke) , 2011; Froemke és Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David és Shamma, 2007; Tchernichovski és Margoliash, 2013). Ezenkívül a neurofiziológiai változások a viselkedéshez kapcsolódnak, például a jelzésekre irányított cselekvéshez (Letzkus, Wolff és Lüthi, 2015), a figyelemhez (Fritz és mtsai, 2007; Elhilali és mtsai, 2007) és a hangjelzések memóriájához (Bieszczad és Weinberger 2010; Grosso et al., 2015; Aschauer és Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso és Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff és Lüthi, 2015; Ghosh és Zador, 2021).

A hallókéreg tanulás által kiváltott neurofiziológiai plaszticitására vonatkozó évtizedes bizonyítékok a hallómemória közös viselkedési jellemzőit mutatják (Weinberger 2007a; 2007b), így a hallómemória konszolidációjának legjobb jelölt régiója. A hallókéreg bioinformatikai vizsgálatával egyben elfogulatlan lehetőséget is kihasználunk arra, hogy feltárjuk az adaptív hallási funkció mögött rejlő neuroplaszticitás agyszintű közös vagy eltérő biológiai kapuőreit. Tágabb perspektívából a regionális transzkriptomikus profilalkotás elvezethet annak teljesebb megértéséhez, hogy az érzékszervi rendszer hogyan módosul a tapasztalat által az emlékezet szolgálatában.

A hallókéregben azonosított tanulás által indukált transzkriptomikus profil validálhatja, kiterjesztheti vagy új biológiai folyamatmodelleket eredményezhet, amelyek támogatják vagy rontják az adaptív hallásfeldolgozást. A hallómemória megszilárdulása valószínűleg a génexpresszióban bekövetkező tapasztalatfüggő változások eredménye, amelyek befolyásolják a hallókéreg sejtfunkcióit, amelyek viszont tartós változásokat idéznek elő a hang által kiváltott neurofiziológiai válaszkészségben, amelyek megváltoztatják a hang által kiváltott viselkedést.

A tanulás által indukált transzkriptumok azonosítására expressziós profilalkotási analízist végeztünk RNAsequencing (RNAseq) segítségével anatómiailag meghatározott hallókéreg mintáin (Bregma -3,10 mm, Interaurális 6,90 mm; Paxinos & Watson, 2007). ). A megcélzott tiszta hangfrekvenciára (5,0 kHz; 65 dB SPL) adott válaszok jutalmat eredményeztek, míg a nem célzott (11,5 kHz; 65 dB SPL) válaszok nem voltak jutalmazva, és időtúllépést kezdeményeztek, ami meghosszabbította az időt a következő próbaig.

Ez a kéttónusú diszkriminációs feladat (2TD) érzékelési szempontból nem nehéz; az akusztikus frekvenciák több mint egy oktávnyi távolságra vannak egymástól, és a rágcsálók könnyen megkülönböztetik őket (Talwar és Gerstein, 1998). A viselkedési kihívás inkább asszociatív volt: a 2TD teljesítmény memóriát igényel, amelyhez a hanghoz jutalom társul (a jutalom nélkül). A betanított patkányokat (N=8) három egymást követő napi 45-perces 2TD edzés után leölték, és összehasonlították a hangtalan patkányok csoportjával (N=4). Ez egy olyan időpont a képzés korai szakaszában, amikor az állatok még teljesítik a 2TD feladatot. A korai feladatszerzés célja a kezdeti tanulás által kiváltott transzkripciós események rögzítése volt, amelyek megalapozták a 2TD-teljesítmény későbbi növekedését, amelyet a hetekig tartó edzés során megfigyeltek.

Például az átlagos teljesítmény meghaladta a véletlent, de csak 66±7,81% 3 nap után, szemben a hosszabb edzés utáni 90% vagy nagyobb értékkel (Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019). A sikeres hangspecifikus asszociatív memória szempontjából releváns gének expressziójának azonosítására szolgáló lehetőség kihasználása érdekében egy HDAC-gátlót használtunk, amely az aktivitásfüggő génexpresszió szeepigenetikus szabályozását célozza meg a tanulásban és a memóriaképzésben (McQuown et al., 2011; Kwapis et al. al., 2017; Malvaez és mtsai, 2012). Fontos, hogy egy évtizednyi munka kimutatta, hogy a HDAC-gátlás elősegítheti a tanulás által kiváltott neurofiziológiai plaszticitást a hang által kiváltott hallókérgi válaszokban (a hordozóhoz viszonyítva), és fokozhatja a hallási diszkriminatív viselkedést (Bieszczad és mtsai, 2015; Phan és mtsai, 2017; Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019; Rotondo és Bieszczad, 2020; Rotondo és Bieszczad, 2021a; 2021b), beleértve az emberteleneket (Gervain et al., 2013).

A betanított állatok felét HDAC-inhibitorral, RGFP966-tal kezelték (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, cat#A8803; sub. cu. injekció) , míg a másik fele azonosan kiképzett, de vivőanyag-oldatot kapott (N=4; megfelelő térfogatú, sub. cu. injekció; 1a. ábra). Nem volt különbség a 2TD teljesítményben a csoportok között az agygyűjtés időpontjában (RGFP966: 61±5,0% vs. Jármű: 71±7,0%; t(5,9166)=-1.21, p=0.272 Welch-teszt). Az agyakat azonnal összegyűjtöttük és lefagyasztottuk egy olyan időpontban, amely megegyezik az inhibitor csúcskoncentrációjával a hallókéregben, egy órával a HDAC-inhibitor vagy a vivőanyag kezelés utáni injekciója után (Bieszczad et al., 2015).

Az itt található eredmények az elsők, amelyek azonosítják az asszociatív tanulás transzkriptomikus profilját a hallókéregben. A kéttónusú diszkriminációs feladatban való tanulás több száz gén transzkripciós szintjének változásait idézte elő (a hang-naivokhoz képest) (1b. ábra). Egy hierarchikus klaszterező algoritmus kimutatta, hogy a gének egyedileg felfelé vagy lefelé szabályozottak, feltárva a hallási tanulás által kiváltott kérgi génexpressziós események összetett hálózatát (2a. ábra).

A dúsítási elemzések (iPathwayGuideTM; Impact Analysis módszer) a kolinergszinapszist (differenciálisan expresszált gének (DEG) / összes gén (ALL): 22/101; p=0.004, Bonferronicorrection) azonosították a legfontosabb biológiai útvonalként (1. táblázat) . Ez az eredmény összhangban van az 1990-es évek óta végzett kutatásokkal, amelyek rávilágítottak a hallókéregben a kolinerg jelátvitel elégséges voltára a neurofiziológiai plaszticitás és a kapcsolódó hallási viselkedés szempontjából (Froemke és Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin és Weinberger, 1996; Kilgard és Merzenich, 19998). A HDAC-gátlás alatti tanulás által indukált transzkriptumszintek vagy ugyanabba az irányba erősítettek (az egyedi géntranszkriptum-szintek további növekedésével vagy további csökkenésével) (2b. ábra), vagy tompultak az egyedüli tanuláshoz képest (2c. ábra). Ilyen körülmények között az egyik legfontosabb biológiai út a neuroaktív ligandum-receptor kölcsönhatás volt (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; 1. táblázat), amely az idegi aktiváció szempontjából kulcsfontosságú effektorokat tartalmazott.

Egy másik csúcsút az extracelluláris mátrix receptor (ECM-receptor) kölcsönhatása volt (DEG/ALL: 14/69; p=0.04; 1. táblázat). Az ECM összetevői kritikusak a kortikális plaszticitás és a memória konszolidáció szempontjából (Happel és mtsai, 2014; Banerjee és mtsai, 2017; El-Tabbal és mtsai, 2021; Sonntag és mtsai, 2015). Ezek az útvonalak potenciális – esetleg kiegészítő – alternatívákat kínálnak a kolinerg jelátvitelhez, amelyek elősegíthetik a hallásfunkció tartós, tapasztalatfüggő változásait (Ji, Gao és Suga, 2001; Luo és Yan, 2013; Metherate, 2011). Más gének, amelyek expressziója megváltozott az auditív tanulással, de nem a HDAC-gátlással, valószínűleg a feladat eljárási feltételeihez kapcsolódnak, nem pedig a hangspecifikus asszociatív memóriához. Például azonosították az apelin jelátviteli útvonalat (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), amely fontos az agyban a vízfelvétel homeosztatikus szabályozásában (Hu et al., 2021). A transzkriptumszintek közvetlen összehasonlítása a betanított patkányok két csoportja között (HDAC gátlással vagy anélkül tanulva) nagyon kevés egyedileg differenciálisan expresszált gént (DEG) mutatott ki.

A legvalószínűbb DEG-ek azonosítására használt küszöbérték (p =0.05) azt találta, hogy csak az Adamts13, az U6, a Rexo4 és a Cabin1 expressziója különbözik (2d. ábra). Így a HDAC-gátlás fő hatása úgy tűnik, hogy a hallási tanulás által indukált gének expresszióját szabályozzák normál körülmények között, ahelyett, hogy újonnan toboroznának egyedi géneket a hangspecifikus memória fenntartására. Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a hallókéregben nagy léptékű transzkriptomi változások következnek be a képzés korai szakaszában, amikor a felnőtt állatok megtanulják megkülönböztetni a hangjelzések közötti asszociatív kapcsolatokat. A hallásműködést elősegítő HDAC-gátlásról szóló megalapozott neurofiziológiai és viselkedési jelentésekkel együtt ezek az eredmények alátámasztják azt a taktikát, hogy HDAC-inhibitort alkalmaznak azon gének megkülönböztetésére, amelyek expressziója meghatározza a hallóemlékezet kialakulásának sikerét.

Számos érdekes gént (GOI) választottak ki az inbiológiai utak dúsítási analíziséből, hogy a genom-szintű szekvenálást gén-célzott megközelítéssel validálják. A mintákat különálló csoportokból gyűjtöttük, amelyek a kiképzett és kezelt állatok két csoportját replikálták ugyanabban a korai szakaszban. képzési időpont (azaz egy órával a harmadik 2TD edzés után) a génexpressziós analízishez kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (qRT-PCR) alkalmazásával. Nem volt különbség a 2TD teljesítményben az ismétlődő kohorszokban (RGFP9661: 61±5.0% vs. RGFP9662: 67±6.0%; t(8.441)=-0.834, p {{20}}.4274; és Jármű1:71±6.0% vs. Jármű2: 74±3,0%; t(4.0809)=-0.444, p {{ 34}}.6796; Welch-féle t-próba).

Az első GOI az Egr1 volt, egy jól tanulmányozott, tevékenységtől függő „azonnali korai gén”, amelyről ismert, hogy a tanulás első óráiban tetőzik, és kritikus a memória kialakulásához (Duclot és Kabbaj, 2017). Ez egy topplearning-indukált gén volt, megerősített megnövekedett expresszióval, amelyet szintén HDAC-gátlással amplifikáltunk egy külön állatcsoportban a gén-célzott vizsgálatban (3. ábra). Ugyanez igaz a Per2-re, egy génre, amely az agy cirkadián ritmusának és szerotoninerg pályáinak szabályozásában vesz részt (Bae és mtsai, 2001; Albrecht és mtsai, 2001; Cuesta és mtsai, 2009; Reh et al. ,2020). A Per2 az "óragén" család része, amelyet más agyi régiókban a HDAC modulációhoz kapcsoltak (Kwapis és mtsai, 2018), és a hallásműködésben is szerepet játszhat (Reh et al., 2020). Ezzel szemben néhány genom-szerte azonosított GOI csak részben igazolódott.

A Chrna7 a dinamikus nikotinos acetilkolin receptor (nAChR) egy alegységét kódolja, amelyről kiderült, hogy a hallástanulás következtében leszabályozott, összhangban a neurofiziológiai bizonyítékokkal (Takesian és mtsai, 2018; Kuchibhotla és mtsai, 2017). Így azt vártuk, hogy a gén-célzott vizsgálat megerősíti a Chrna7 leszabályozását minden 2TD-vel edzett állatban, de a leszabályozás csak a hordozóval kezelt állatoknál volt nyilvánvaló, amelyek megtanulták a 2TD-t HDAC-gátlás nélkül. További kiválasztott GOI-k a Nr4a árva nukleáris receptor családból, a Nr4a1 és Nr4a2 gének, amelyekről a jelentések szerint szükség van az RGFP966 szelektív HDAC célpontjának downstream hatásainak más agyi régiókban való terjesztéséhez (McQuown et al., 2011; Kwapis et al. ., 2019).

A Nr4a család génexpressziójának feladatfüggő regionális különbségeiről szóló korábbi jelentésekkel összhangban (McNulty et al., 2012), a Nr4a1, de az Nr4a2 nem volt szabályozva a hallókéregben a hallási tanulás után. Más DEG-eket, a Htr1a-t vagy az Adamts13-at nem erősítette meg a gén-célzott vizsgálat, valószínűleg az egyedi tervezésű, gén-célzott szondák által nem észlelt ismert transzkriptum-variánsok különbségei miatt, vagy az I. típusú hiba miatt, vagy a kiképzett állatcsoportok közötti finom viselkedésbeli különbségek miatt. észrevétlen maradt a 2TD teljesítményméréseknél. Megvizsgáltuk a Lynx1 gént is, amely hosszú múltra tekint vissza a „kritikus időszak”-szerű plaszticitás újbóli megnyitására az érzékszervi kéregben (Morishita et al., 2010), valószínűleg a kolinerg és szerotonerg modulációra gyakorolt ​​hatása miatt (Takesian et al. , 2018). Bármennyire is összhangban van a korábbi genomszintű jelentésekkel, amelyek nem sikerült kimutatni (Kalish, et al., 2020), sem az RNAseq-adatkészletünkben, sem egy gén-célzott vizsgálatban nem mutatták ki.

Bár továbbra is kihívást jelent annak meghatározása, hogy az eltérések az állatok közötti valós biológiai vagy egyéni variabilitással magyarázhatók-e, vagy az alacsony abundanciával vagy sejttípus-specifikus expresszáló transzkriptumokkal járó technikai variabilitás miatt, kivételesen konzisztens eredményeket közölünk egyes GOI-k esetében. Mivel a Chrna7, Egr1 és Per2 tanulás által kiváltott expressziója konzisztens a gén-célzott és az egész genomra kiterjedő megközelítések, valamint a képzett állatok különböző csoportjai között, magától értetődik, hogy ezek a gének lehetnek a legfontosabb szereplők a tartós változásokban. a hallásfunkció és a memória, és most a jövőbeli vizsgálatok elsődleges fontosságúak.

Együtt tekintve az eredmények egy dinamikus transzkripciós tájat tárnak fel a felnőtt hallókéregben, amely támogathatja az új hallásfunkciókat a neurofiziológiában és a viselkedésben. Tekintettel az érzékszervi működésre vonatkozó epigenetikai kontrollok egyre növekvő bizonyítékaira (vö. Shang & Bieszczad, 2022), izgalmas megfontolni. hogyan játszanak szerepet az epigenetikai mechanizmusok a hallókérgi körök tapasztalatfüggő plaszticitásával való egyensúly megteremtésében. Például a jelenlegi genomszintű adatkészlet az arepresszív hiszton-dezacetiláz, a Hdac9, tanulás által kiváltott expressziójának csökkenését is azonosította, amely hiányzott a HDAC-gátlás miatt.

Csábító, hogy a csökkent HDAC9 expresszió hatását a HDAC-k farmakológiailag gátló hatásához hasonlítsuk a tanulás által kiváltott transzkripciót elősegítő hatáshoz. Az epigenetikai szabályozók egy másik fontos osztálya a hisztonok helyett a DNS-t változtatja meg. Példa erre a Tet1 és a Gadd45b, amelyek egyaránt befolyásolják a DNS-metilációt (Bayraktar és Kreutz, 2018), és azt találták, hogy a HDAC gátlása alatt lefelé, illetve felfelé szabályozzák a tanulást. Továbbá a mikroRNS-ek egy osztálya jelent meg a HDAC-gátlással való tanulás által indukált legjobb biológiai útként (lásd 1. táblázat), amelyek a terepen az idegi transzkripciós szabályozás kulcsfontosságú epigenetikai szabályozóiként nyertek teret (Saab & Mansuy, 2014). Az epigenetikus szereplők és az expresszált gének fehérjetermékei közötti magasabb rendű molekuláris kölcsönhatások is valószínűek. Például az azonosított, felfelé szabályozott Egr1 képes toborozni a Tet1-et, hogy eltávolítsa a represszív metilációs jeleket, hogy aktiválja a downstream géneket (Sun et al., 2019). További molekuláris vizsgálatokra lesz szükség a hallórendszer epigenetikai szabályozói közötti kölcsönhatások jelentőségének elemzésére a tanulás során. Ezenkívül ez a jelentés azonnali lehetőséget kínál arra, hogy kapcsolatokat létesítsen kiválasztott hallókérgi gének és azok downstream effektorai között.

Az e gének és molekulák közötti szakadék áthidalása a hang által kiváltott neurofiziológiai eseményekre gyakorolt ​​hatások között elengedhetetlen annak megértéséhez, hogy a felnőtt hallórendszer hogyan alkalmazkodik a tapasztalatokhoz a viselkedés megváltoztatásához. Valójában a de novo átirat lefordítása szükséges a viselkedési funkciók hosszú távú megváltoztatásához, mivel ezek tartós változásokat okoznak a sejtműködésben. Például a tanulás által kiváltott transzkripciós folyamatok kulcsfontosságú céleffektorai megváltoztathatják a csatornák vagy receptorok elérhetőségét (Metherate, Intskirveli és Kawai, 2012; Brown és Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao és Tzounopoulos, 2023) a hangot meghatározó áramkörökön belül. kiváltott küszöb, reszponzivitás és receptív mező architektúra a hallórendszerben. Ésszerű feltételezni, hogy a különböző hallási feladatok egyedi génhálózatokat toboroznak az adott sejtfunkciók szempontjából releváns biológiai útvonalak számára, amelyek támogatják a feladathoz kapcsolódó hangjellemzők vagy feladatstruktúrák tanulását.

Összességében ez a jelentés kiindulási pontként szolgál az RNAseq-adatkészletek elérhetővé tételéhez a tanulási, a felnőttkori és a hallókéregből (lásd az Adattárat). Üdvözöljük a felnőtt hallókéreg molekuláris genetikai folyamataira összpontosító tanulmányok súlyos hiánya miatt súlyosbított tudásbeli szakadék csökkentésére irányuló erőfeszítéseket. Javasoljuk, hogy a tömeges RNS-szekvenálás tér- és időbeli korlátain túlmutató tanulmányokat végezzenek, amelyek érzékenységét technikailag az olvasási mélység is korlátozza (Li& Wang, 2021), különösen mivel a modern Omics technológiák gyorsan fejlődnek és javulnak.

Míg a hallókéreg kutatása néhány kezdeti lépést tett a molekuláris genetikában, amelyek lényeges molekuláris kaszkádokat azonosítottak (Schicknick et al., 2008), megengedő IEG profilokat (Mello, Velho és Pinaud, 2006; de Hoz és mtsai, 2018). Peter és mtsai, 2011), sőt a kromatindinamikára (Peter és mtsai, 2021) is van precedens a hallási periférián, ahol a transzkripciós dinamikát szépen tanulmányozzák (Kwan, 2016; Barta és mtsai, 2018; Li, et al. al., 2020; Ebeid et al., 2017). A meglévő molekuláris eszközök, mint például az egysejtű RNS-szekvenálás (RNA-Seq) és a kismolekulájú fluoreszcens in situ hibridizáció (smFISH), hasznosak lesznek, hogy betekintést nyújtsanak a tapasztalatfüggő sejt-sejt variációkba és a hallókérgi sejtekben és áramkörökön belüli molekuláris kölcsönhatásokba. A tömeges RNAseq-től eltérően ezek a módszerek tiszteletben tartják a mély sejtdiverzitást és a hallókéreg magasabb rendű szerveződését, például annak rétegspecifikus mikroáramkörét és lemniszkális topográfiáját.
A csak a közelmúltban aktív hallókérgi sejtekből származó címkék és szekvencia átiratok okos megközelítései (Cho, Huang és Gray, 2016) eléggé növelhetik az érzékenységet ahhoz, hogy a funkcionálisan legrelevánsabb sejttípusokból és -populációkból a funkcionálisan legrelevánsabb génkészleteket megkapják. Hasonló megközelítések alkalmazhatók szubkortikálisan is az aktivitásfüggő regionális transzkriptomikus profilok rögzítésére és kontrasztjaira a kéregben, amelyek tiszteletben tartják a kéreg hihetetlen integrációját a hallórendszer szubkortikális funkciójával, különböző hallási feltételek vagy viselkedési igények mellett. A felnőtt agyban a hallási tanulás alapjául szolgáló genetikai és molekuláris mechanizmusok sejtszintű és regionális különbségeinek teljes körű jellemzése elengedhetetlen a helyszelektív és molekula-célzott precíziós terápiák kifejlesztéséhez, amelyek robusztus és tartós funkcionális változásokat tesznek lehetővé, hogy támogassák a specifikus hallást és hallgathatóságot az élet során.

Mód

Alanyok: Összesen 24 felnőtt hím Sprague-Dawley patkányt (250-300 g érkezéskor; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA) használtunk viselkedési és molekuláris kísérletekben. Az összes állatot egyenként, szabályozott hőmérsékletű (24 ˚C) kolóniaszobában helyezték el, 12-órás fény/sötét ciklusban. Az alanyok ad libitum juthattak élelemhez és vízhez a viselkedési tréning előtt. Az összes eljárást a Rutgers-i Állatgondozási és Felhasználási Bizottság (IACUC) irányelvei szerint hagyta jóvá és végezte el (Protokollszám: 999900026 (KMB)).

Viselkedési apparátus és hangingerek: Minden viselkedési ülést két azonos hangszeres kondicionáló kamrában (H{{0}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) végeztünk egy hangcsillapított dobozban. A napi edzéseket kiegyenlítették, hogy mindkét kamrában egyenlő expozíciót biztosítsanak. Mindegyik kamra (12" Sz x 10" M x 12" H; a dróthálós padlót válaszkarral (H21-03R), házvilágítással (H11-01R), hangszóróval (H{) szerelték fel. {8}}R), és egy vízadagoló rendszer (H14-05R). A képzési fázisok során az állatok lenyomhatták a válaszkart ("barpress"), ami kiváltotta a vizespohár (~0,02 cm3) felmutatását. a jutalomnyílásban (1,25"Sz x 1,625"H). A korai ülés során egy kézi kapcsolót (H21-01) használtak az állat rúdnyomási reakciójának alakítására, hogy kiváltsák a vizespohár bemutatását, amely lehetővé tette a hozzáférést a A viselkedési válaszokat Graphic State 4 szoftverrel (CoulbournInstruments, Holliston MA) rögzítettük offline elemzéshez.

Az összes hallási ingert Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) és RPvdsEx szoftverrel generáltuk, és az operáns kamra falra szerelt hangszóróján keresztül mutattuk be. A fehérzaj (a procedurális betanítás során; 1a. ábra) 7 vagy 9 másodpercig (75 dB SPL) volt megjelenítve. A tiszta hangok (kéttónusú diszkriminációs tréning során; 1a. ábra) mindig 8 másodpercig (70 dB SPL) voltak láthatóak. A hangszinteket naponta kalibrálták digitális hangmérővel (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Viselkedési tréning és a HDAC3 farmakológiai gátlása: A theviváriumhoz való egynapos akklimatizáció után a patkányokat naponta kezeltük legalább 3 napig. A viselkedési tréning megkezdése előtt a patkányokat korlátozott vízfogyasztásra helyezték, amíg el nem érték az azonos korú kontroll állatok nem korlátozott súlyának 85%-át. A vízben korlátozott patkányokat ezután hangcsillapított kamrákba alakítottuk, hogy megnyomják a víz jutalmát (1a. ábra). A nyomógomb formálása és az azt követő hangképzés a korábban leírtak szerint történt (Shang, Bylipudi és Bieszczad, 2019). Röviden, minden állatot úgy alakítottunk ki, hogy 5 napon keresztül ütögethessen, majd egy eljárási feladatra oktatták, hogy megtanulják a hangot nyomni, ami ebben a fázisban széles sávú Gauss-zajinger volt (1-12,5 kHz sávszűrő szűrt fehér zaj; 75 dB SPL), hogy vízjutalmat kapjon. Minden állat sikeresen megtanulta ezt a hangot a jutalommal társítani, mielőtt a képzés következő fázisába lépett volna. Az eljárási tréning egyéni változatosságot mutatott abban, hogy az állatok milyen gyorsan tudták megtanulni a feladatot magas szintű teljesítményre. Ennek ellenére minden állat képes volt 90%-nál nagyobb vagy azzal egyenlő teljesítményszintet elérni két egymást követő napon (átlag=92,85%, sem =0,01%) átlagosan 12,67 nap után ( sd=2.85 nap). A teljesítményt 100%-kal számítottuk ki.

A képzés következő fázisa a kéttónusú megkülönböztetés (2TD) feladat volt (1a. ábra), amelyben a patkányokat két spektrálisan eltérő hangfrekvencia megkülönböztetésére tanítottuk. Az S+ hangra (50 kHz; 70 dB SPL) történő ütések vízjutalmat, míg a Stone-ra (11,5 kHz; 70 dB SPL) hibajelzést (villogó ház) eredményeznek. fény) és egy "időtúllépés" (további 6 másodperc várakozás a következő próba kezdetéig). Az S+ és S-S-próbákat randomizáltuk, és 8 másodpercig tartottak. A kísérletek közötti intervallumok (ITI-k) átlagosan 15 másodpercek voltak (tartomány: 5-25 s, randomizált). A néma ITI alatti ütőnyomások jelentéktelenek voltak (nincs időtúllépés, nincs hibajelzés, sem vízjutalom). A napi foglalkozások 45 percesek voltak. Minden állat végrehajtotta a 2TD-feladatot összesen három egymást követő napon. A patkányokat képzett megfigyelő párosította, így az eljárási feladatot hasonló arányban teljesítő állatokat a 2TD fázisban különböző kezelési feltételekhez rendelték. A teljesítménnyel egyező párok mindegyik után azonnal szisztémás injekciót kaptak vagy az I. farmakológiai osztályú HDAC3 gátló RGFP966-ból (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg;sc; N=12), vagy a vivőanyag-oldatból (N=9). 2TD munkamenet. A 2TD feladat teljesítményét a korábban leírtak szerint számítottuk ki: 100% (Shang, Bylipudi és Bieszczad, 20).

).Szövetgyűjtés és az RNS izolálása: Egy órával azután, hogy az állatok megkapták a harmadik és egyben utolsó RGFP966 injekciót a 2TD harmadik szakaszát követően, az agyakat gyorsan kimetszettük, és egy szárazjégre helyezett 2-metil-butános főzőpohárban gyorsan lefagyasztottuk. A gyorsfagyasztott agyakat ezután -80˚ C-on tároltuk a jövőbeli feldolgozásig. Ahhoz, hogy az agyat felkészítsék a kriometszésre, az agyakat inoptimális vágási hőmérsékletű vegyülettel (OCT) burkolták, és -20˚ C-on 12-24 órán át tárolták, hogy az agyszövet elérje a -20˚ C-ot a vágáshoz. Az OCT-be burkolt agyakat ezután vízszintesen felszeleteljük egy kriosztátban (Leica CM 3050S) 250 µm vastagságban. 1 mm-es kerek szövetű mikrolyukasztóval 2 mm3 hallókérgi szövetből vettünk mintát minden féltekéből (egy mintába egyesítve, összesen 4 mm3 agyterületenként) RNS extrakcióhoz. A hallókéreg-lokációt Paxinos és Watson The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (6. kiadás) segítségével azonosították referenciaként (körülbelül A/P=-3,6 és -5,8 mm, M/L {{20} } ±6,4 mm D/V=-4,2–-5,8 mm; és a hippokampusz használata iránypontként

Mindegyik mintából a teljes RNS-t a PureLinkTM RNA Mini Kit (ThermoFisher) segítségével izoláltuk a gyártó protokollja szerint. Az RNS-mintákat ezután az RNA Clean andConcentratorTM -25 Kittel (Zymo Research) tisztítottuk.

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), a szekvenáló könyvtárakat az Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit segítségével állítottuk elő a gyártó által javasolt protokollok szerint. A könyvtárakat egyesítettük, és a szekvenálást egy Illumina NovaSeq 6000 készüléken végeztük, amely 100 bp-os páros végű SBSchemistry-t futtatott. A beolvasásokat a „bcbio-nextgen.py” nyílt forráskódú informatikai csővezetékkel dolgozták fel, amelyet elsősorban a Harvard Chan Bioinformatics (v.1.2.4) fejlesztett ki, és az Argon HPCresource-on fut az Iowai Egyetemen. Ez a folyamat az olvasási minőség-ellenőrzés, az olvasási igazítás és a mennyiségi meghatározás „bevált gyakorlatait” tartalmazza. A „bcbio-nextgen.py” folyamat „RNA-seq” módban futott, az „rn6” kulccsal a kiválasztott genom felépítéseként (belső hivatkozással az Ensembl összeállításra és az „Rnor_6.0” genebuildre). Az igazított folyamat az Rnor_6.0 genomhoz olvassa be a splice-tudatos, ultra-gyors hisat2 illesztőt (2.2.1), és ezzel párhuzamosan számszerűsíti a transzkriptomot a „lazac” (1.4.0) igazító segítségével. A Qualimap (2.2.2), egy számítási eszköz, amely a hisat2 BAM igazítási fájlokat vizsgálja, az olvasott adatok minőségellenőrzési vizsgálatára szolgált. A szekvencia minőségi pontszámai megfeleltek az alapvető ellenőrzéseknek, és a szekvencia-másolatok aránya az elfogadható paramétereken belül volt. Minden minta átment a minőségellenőrzésen az exonikus régiókhoz való olvasási igazításhoz. A lazacból származó transzkriptum mennyiségi meghatározásokat (TPM vagy "transzkriptumok per millióan") importáltuk, és a génszinten becsült számokra összegeztük az Rstudioban található tximport (1.12.3) használatával, a legjobb gyakorolja a DESeq2 matricát(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Az 5-nél kevesebb becsült számmal rendelkező géneket az összes mintában előszűrtük a downstream elemzésből, az ajánlott eljárás szerint. A differenciális génexpressziós analízist DESeq2-vel (v.1.24.{5}}) végeztük becsült génszintű számok alapján. 5%-os FDR és X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

RNS-seq adatok validálása qRT-PCR-rel: Az RNS-seq adatokat qRT-PCR-rel validáltuk különböző patkánycsoportokból kivont mRNS-eken. Öt átiratot választottunk ki az új DEG-ek listájáról, amelyeket minden régióban dúsítottak az alapvonalon. A gének közül három hipotézisvezérelt halláskérgi fiziológiai és viselkedési irodalom alapján, másik három gén pedig újszerű gének, amelyeket génszintű és DEG-elemzések alapján azonosítottak a Gyógyszer és Vehicle csoportok összehasonlítása során. Az összes primer szekvenciát vagy a patkányok agyszövetére vonatkozó korábbi irodalomból választottuk ki (a szekvenciákat az alábbi táblázat tartalmazza), vagy az NCBI Primer Blast segítségével terveztük, és validáltuk a célpont specifitását az olvadási görbék és a PCR amplikon termék szekvenálásának értékelésével. A qRT-PCR elemzéseket QuantStudio 3-ban (Applied Biosystems) végeztük SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) segítségével. Minden mintához 500 ng cDNS-t amplifikáltunk egy iScriptTM cDNS Synthesis Kit (Bio-Rad) segítségével.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők szeretnének köszönetet mondani Dr. Andrea Shangnak, Sean Tsaurnak és Sooraz Bylipudinak a viselkedési eljárásokban és elemzésekben nyújtott segítségükért; Dr. Mimi L. Phan az RNS-kivonásban és a mintagyűjtési protokollokban nyújtott segítségéért; Dr. Troy A. Roepke, Ali Yasrebi és ChristopherO'Brien az RNS-minta tisztítási elemzésében nyújtott segítségükért; és Alisa Ray technikai segítségért. Szeretnénk köszönetet mondani a CLEF Lab minden jelenlegi és korábbi munkatársának a segítségükért és támogatásukért.

Ezt a munkát a National Institutes of Health, a National Institute of Defness and Communication Disorders [R{0}}DC014753 a KMB-nek] támogatta; a Rutgers Egyetem Művészeti és Tudományos Iskolája; az Aresty Alapítvány a Rutgers Egyetemen, kis összegű támogatással egyetemi kutatásokhoz; és a Project SUPER program a Rutgers Egyetemen, kis támogatással egyetemi kutatásokhoz.

Referenciák:

Alberini, CM és Kandel, ER (2014). Az átírás szabályozása a memóriakonszolidációban. ColdSpring Harbor Perspectives in Biology, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z. és Lee, C. (2001). Az MPer1 és mper2 elengedhetetlenek a cirkadián óra normál visszaállításához. J Biol Rhythms, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D. és Rumpel, S. (2016). A szenzoros neokortex és az asszociatív memória. BehavioralNuroscience of Learning and Memory, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM és Weaver, DR (2001). Az mPer1, mPer2 és mPer3 differenciálfüggvényei az SCN cirkadián órájában. Neuron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS és Weinberger, NM (1996). Fiziológiai memória indukálása az agykéregben a nucleus basalis stimulálásával. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(20), 11219-11224. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC, & Ressler, KJ (2017).Perineuronális hálók a felnőtt szenzoros kéregben szükségesek a félelem tanulásához. Neuron, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Barta, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . Ő, DZ (2018). Felnőtt zebradán belsőfül szőrsejtek RNS-seq transzkriptomikai elemzése. Scientific Data, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G. és Kreutz, MR (2018). Az aktivitásfüggő DNS-demetiláció szerepe a felnőttagyban és a neurológiai rendellenességekben. Frontiers in Molecular Neuroscience, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). A hiszton dezacetiláz gátlása az RGFP966-on keresztül felszabadítja a szenzoros agykérgi plaszticitás fékjeit és a memória kialakulásának specifikusságát. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.{2}}.2015

Brown, MR és Kaczmarek, LK (2011). Káliumcsatorna moduláció és hallásfeldolgozás. Halláskutatás, 279(1-2), 32-42. doi:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Bychkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP, & Lyukmanova, EN(2018). A Lynx1 megakadályozza az A 1-42 és a JNK aktiválása által okozott neuromodulátorkifejezés hosszú távú blokádját és csökkentését. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com