Guy JM Cameron és társai

Akut vese sérülés(AKI) végzetes lehet, és jól körülhatárolható kockázati tényező a kialakulásábankrónikusvesebetegség. A 2. csoportba tartozó veleszületett limfoid sejtek (ILC2-k) a -2 típusú citokinek veleszületett termelői, és a perifériás szervek homeosztázisának kritikus szabályozói. Azonban tudásunk a funkciójukról aveseviszonylag korlátozott. A legújabb bizonyítékok arra utalnak, hogy az ILC2 számának rekombináns interleukin (IL)-25 vagy IL-33 szisztémás adagolásával történő növelése megvéd a vesekárosodástól. Míg az ILC2-k indukálhatók az ischaemiás vagy kémiailag kiváltott AKI elleni védelem érdekében, az ILC2 hiányának vagy kimerülésének hatása a vesekárosodás súlyosságára nem ismert. Először is, az ILC2 fenotípusa és elhelyezkedése avesehomeosztatikus körülmények között értékelték.VeseAz ILC2-k konstitutívan magas IL-5 szintet fejeztek ki, és a vese érrendszerének közvetlen közelében helyezkedtek el. Az ILC2 funkcionális szerepének tesztelése avese, a vese ischaemia-reperfúziós sérülésének (IRI) kísérleti modelljét használták, és a sérülés súlyosságát vad típusú, ILC2-csökkentett, ILC2-hiányos és ILC{{4} esetén értékelték. }kimerült egerek. Meglepő módon nem volt különbség a sérüléssel összefüggő (Lcn2), gyulladásos (Cxcl1, Cxcl2 és Tnf) vagy extracelluláris mátrix (Col1a1, Fn1) kórszövettani, kollagénlerakódási vagy mRNS-expressziójában az IRI-t követően ILC2-k hiányában. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az ILC2-k hiánya nem változtatja meg a betegség súlyosságátvesekárosodás, ami esetleges redundanciára utal. Ezért az 2- típusú, közvetített immunsejtaktiváció egyéb mechanizmusai valószínűleg kompenzálnak ILC2-k hiányában. Ezért az ILC2-k elvesztése nem valószínű, hogy növeli az AKI-re való érzékenységet vagy annak súlyosságát.

Kulcsszavak:ILC2, 2. csoport veleszületett limfoid sejt, IL-5, IL-13,vese, vese-, IRI, ischaemia-reperfúziós sérülés

További információért forduljon:emily.li@wecistanche.com

A Cistanche tubulosa megelőzi a vesebetegséget, kattintson ide a mintaért

BEVEZETÉS

Akut vese sérülés(AKI) és a kapcsolódó patológiák mélyreható hatással vannak az emberi egészségre (1). Az AKI gyakori oka a vese ischaemia, amely elsősorban a tubuláris epitéliumot érinti, mivel ezekben a sejtekben magas a mitokondriális sűrűség és a metabolikus aktivitás (2); áttekintette: Devarajan (3) és Bonventre és Yang (4). Az akut tubuláris nekrózis rontja a salakanyagok kiválasztását, megváltoztatja a víz- és elektrolitegyensúly felborulását, és erőteljes gyulladásos reakciókat okoz; áttekintette: Bonventre és Yang (4). A neutrofilek és monociták beáramlása hozzájárul a sérüléshez, azonban más veleszületett immunsejtek elősegíthetik a homeosztázisba való visszatérést (5); Friedewald és Rabb (6) ismertette. A veleszületett limfoid sejtek (ILC) nemrégiben bővültek ebbe a családba, és 3 csoportba sorolhatók a fejlődésükhöz szükséges transzkripciós faktorok és az általuk termelt effektor citokinek alapján (7). A 2. csoportba tartozó ILC-k (ILC2-k) a 2-es típusú citokinek, elsősorban az interleukin (IL)-5 és IL-13 erős termelői (8, 9). Ezek a sejtek elősegítik a szövetek felépülését is több szervben bekövetkezett sérülést követően, és in vivo sokrétű funkciójuk van (10). Például az influenzavírus okozta légúti vírusfertőzést követően az ILC2-k koordinálják a légúti hám helyreállítását az amfiregulin növekedési faktor (AREG) termelésével (11). A közelmúltban az ILC2-ket a vesekárosodás modelljein vizsgálták, beleértve az ischaemia-reperfúziós károsodást (IRI), valamint a doxorubicin vagy ciszplatin által okozott nefrotoxikus kémiai károsodást (12–16). A vese IRI-t általában úgy érik el, hogy ideiglenesen korlátozzák a vese véráramlását 20–30 percre, modellezve a transzplantációból vagy sebészeti beavatkozásból származó traumát (17–21). Ezek a vizsgálatok összességében azt mutatják, hogy az ILC2-ket aktiváló rekombináns egér citokinek, nevezetesen az IL-25 vagy az IL-33 in vivo beadása elegendő a tubuláris hámsejt sérülés súlyosságának csökkentéséhez (12–16). Hasonló eredményeket értek el az ex vivo aktivált ILC2-k adoptív átvitelével (12, 15). Míg az ILC2-ket mesterségesen el lehet indukálni, hogy elszaporodjanak, és megvédjék a kísérleti vesekárosodás káros következményeitől, az ILC{38}hiány hatása továbbra sem teljesen ismert. Valójában más immunsejtek, amelyek összetett kölcsönhatásban állnak az ILC2-vel, mint például a szabályozó T-sejtek (Treg) és az alternatív módon aktivált makrofágok (AAM; más néven M2), kritikusak ehhez a renoprotektív hatáshoz (22–25). Ebben a tanulmányban a vesében lévő ILC2-k további jellemzésére, a szerven belüli elhelyezkedésükre, valamint az IRI-ben betöltött funkcionális szerepük meghatározására törekedtünk a funkcióvesztés megközelítésével. Íme, ezt találtukveseAz ILC2-k konstitutívan expresszálják az IL- 5-ot, és elsősorban a vese érrendszerének közvetlen közelében, az adventitián belül helyezkednek el. Ezenkívül bemutatjuk, hogy az ILC2-k csökkenése, hiánya vagy kimerülése minimális hatással volt az IRI súlyosságára. Míg az ILC2-ek aktiválása és a helyi 2-es típusú immunitás ezzel összefüggő erősödése korábban kimutatták, hogy csökkenti az AKI káros következményeit, eredményeink azt mutatják, hogy hasonló sérülések fordulnak elő ILC2-k hiányában, ami arra utal, hogy az ILC2-k redundánsak lehetnek az IRI-ben, ha más kompenzáló immunrendszer. sejtek, például T-sejtek vannak jelen.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Egerek

Nyolc-tizenkét hetes hím vad típusú (WT; C57BL/6JAusb), hordozó (sóoldattal kezelt Icosdtr/ plusz Cd4cre/ plus ), ILC2-csökkentett (Roraflfl/ plus Il7rcre/ plus ), ILC{{ 8}}hiányos (Roraflfl/flfl Il7rcre/ plus), ILC{10}} kimerült (Diptheria toxoid-kezelt [DTx] Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ), és IL-5/IL-13 A kettős riporter egereket (Il5venus/ plusz Il13td tomato/ plus) az Australian Bioresources-tól (Moss Vale, Ausztrália) szereztük be. Il5td tomatoCre; A Rosa26-CAG-RFP riporter-nyomkövető egereket a Jackson Labs-tól szereztük be (hiv. szám: 030926 és 007914). Valamennyi műtéten átesett egeret specifikus kórokozó-mentes, fizikai elzárás 2 körülmények között helyeztük el, egyedileg szellőztetett ketrecekben. Az egereket normál szobalevegőnek tették ki sterilizált környezetben a műtét során. Az egereket 1 hétig hagyták akklimatizálódni a kísérletek megkezdése előtt, és 12- órás nappali/éjszakai ciklusban tartották őket, és ad libitum hozzáfértek standard laboratóriumi táphoz és vízhez.

Áramlási citometria és t-SNE analízis

Veseés a tüdőt riporter egerektől gyűjtöttük össze. Az egysejtű szuszpenziókat az "Egértüdőből származó egysejt-szuszpenziók készítése kollagenáz D-kezeléssel" című részben leírtak szerint állítottuk elő (Miltenyi Biotec GmbH, 2008; Bergisch Gladbach, Németország). A sejteket Fc blokkal (tisztított anti-egér CD16/32; Biolegend, San Diego, USA) blokkoltuk 30 percig, és fluoreszcensen konjugált antitestekkel festettük a célsejt felszíni antigének ellen (1. kiegészítő táblázat). A festési és mosási lépéseket BSA festési pufferrel (BD Biosciences, North Ryde, Ausztrália) végeztük. A mintákat BD LSR Fortessa X20 áramlási citométerrel vettük. Az áramlási citometriai adatokat a FlowJo v10.5.3 (Tree Star, Ashland, USA) segítségével elemeztük. A t-eloszlású sztochasztikus szomszéd beágyazást (t-SNE) ILC2-ken (CD45 plusz Lineage [TCR [TCR TCR δ CD8 CD4 ]CD11b GR-1 B220 TER-119 CD3 NK-1 .1 ] IL7R plusz CD90.2 plusz ST2 plusz FSClowSSClow egysejtű). A véletlenszerű lefelé mintavételező bővítmény használatával az egyes mintákban lévő események számát normalizáltuk a legalacsonyabb értékre, lefelé kerekítve a legközelebbi 10 eseményre. Az összes populációt egyetlen .fcs fájlba egyesítettük a lemintázott populációk összefűzésével. A t-SNE analízist az összes vese- és tüdőmintából származó kapuzott populációkat tartalmazó összefűzött mintán végeztük. Ehhez a kapuzáshoz nem használt kompenzált csatornákat a következő t-SNE beállítások mellett értékeltük: Iteration 1000, Perplexity 20, Eta 224. A hisztogramok segítségével kimutattuk a sejtfelszíni antigének és citokinek eltérő expresszióját a tüdőben, ill.vese

Immunfluoreszcencia Il5td tomatoCre; Rosa26-CAG-RFP riporter-nyomkövető egereket elaltattunk, és intrakardiálisan perfundáltuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), majd 4 százalékos paraformaldehiddel (PFA) PBS-ben. A veséket eltávolítottuk és friss 4%-os PFA-ban tartottuk 24 órán át 4°C-on, majd PBS-ben mostuk. Háromszáz mikrométeres metszeteket készítettünk vibratom segítségével. Ezt követően a szövetmetszeteket permeabilizációs pufferben (PBS/0,2 százalék Triton X-100/0,3 M glicin) inkubáltuk, majd PBS/0,2 százalékos oldatban blokkoltuk. Triton X- 100/5 százalék szamárszérum 4 ◦C-on egy éjszakán át. A mintákat egyszer mostuk PBS/0,2 százalék Tween-20 oldatban, majd PBS/0,2 százalék Tween-20/3 százalék szamárszérumban hígított elsődleges antitestekkel inkubáltuk. szobahőmérsékleten másnapig. Ezt követően a mintákat PBS/0,2% Tween-20 oldatban mostuk 30 percig, 3-4 alkalommal, majd PBS/0-ben hígított másodlagos antitestekkel inkubáltuk. 0,2% Tween-20/3% szamárszérum szobahőmérsékleten 6–8 órán keresztül. A mintákat PBS/0,2% Tween-20 oldatban mostuk 1 napig, majd növekvő etanolos sorozatban (20, 30, 50, 70, 95, 100 százalék) dehidratáltuk, lépésenként 10 perccel. . Végül a vesemetszeteket metil-szalicilátba (M-2047; Sigma-Aldrich, Castle Hill, Ausztrália) való áztatással tisztítottuk, majd friss metil-szaliciláttal egy homorú fedőlemezre vagy kamrára rögzítették. A képeket Nikon A1R lézeres konfokális szkennerrel rögzítettük, beleértve a 405, 488, 561 és 650 lézervonalat a gerjesztéshez és a 16X/0.8 vagy 25X1.1, NA Plan Apo nagy munkatávolságú vízbemerítési objektívekkel történő képalkotáshoz. A Z lépéseket 6 µm-enként vettük fel. A képeket ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) és Bitplane Imaris v8 (Andor Technology PLC, Belfast, N. Írország) szoftverrel dolgoztuk fel. Az alfa-simaizom aktinnal jelölt erek felszíni rekonstrukcióját Imaris-szal végeztük, és pszeudoszínezést végeztünk jellemző felépítésük és térfogatuk alapján a nagy artériák és vénák megjelenítéséhez. A következő antitesteket és hígításokat használtuk: Living Colors anti-DsRed Rabbit Polyclonal Pan Antibody (1:500; TaKaRa, Mountain View, USA), kecske poliklonális anti-alfa-simaizom aktin antitest (1:200; Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) ), eFluor 660 LYVE1 monoklonális antitest (1:300, ALY7 klón, eBioscience), örmény hörcsög anti-egér CD3 antitest (1:100, klón 145-2C11, Biolegend), Alexa Fluor R 488 szamár anti-kecske IgG (H plusz L), Alexa Fluor R 555 szamár anti-nyúl IgG (H plus L) Alexa Fluor R 647 kecske anti-hörcsög IgG (H plus L) keresztben adszorbeálva (1:400, ThermoFisher Scientific).

Egyoldali ischaemia-reperfúziós sérülés

A sebészi érzéstelenítést 4 százalékos izoflurán inhaláció váltotta ki, és folyamatos 1-1,5 százalékos izoflurán inhalációval tartottuk fenn az orrkúpon keresztül. Az eljárás során az egereket egy sebészeti platformon tartottuk, amelyet 37 ± 1 °C-on tartottak digitális termosztáttal vezérelt hőszőnyeggel. A jobb vese nefrektómiáját minden állatnál elvégezték. Az egyoldali ischaemia előidézésére a bal vese ereit a vesepedikula közelében 29- percre szorították egy nem traumás, steril érbilincs (Coherent Scientific; Hilton, Ausztrália) segítségével, elegendő erővel, hogy megakadályozzák a vért aveseaz edények visszafordíthatatlan károsodása nélkül. Egységes és gyors reperfúzió aveseminden egérnél megfigyelték az érbilincs eltávolítása után. Az izom- és bőrsebeket 5/0-os vikrilvarrattal lezárták (Johnson & Johnson Medical, North Ryde, Ausztrália), majd a bőrt dermális ragasztóval (Provet, Charlestown, Ausztrália) lezárták a seb védelmére és megelőzni a fertőzést. A kontroll állatokat álműtétnek vetettük alá azonos érzéstelenítési idővel, és csak ellenoldali nefrektómiát kaptak. A hatékony fájdalomcsillapítás érdekében az egerek 0,1 mg/kg buprenorfint kaptak szubkután 30 perccel a műtét előtt, majd 0,05-0,1 mg/kg 8-12 óránként, szükség szerint. Az állatokat jellemzően a műtétet követő 4. napon elválasztották a fájdalomcsillapítástól, fájdalom vagy szorongás jelei nélkül, amint azt az arc jellemzői határozták meg a standard egérfintor skála használatával; leírtak szerint (26). Minden egér túlélte az előre meghatározott végpontot.

Az ILC2-k kimerülése in vivo

Az ILC2-ket kimerítettük az Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus egerekben 0,025 mg/kg DTx (Sigma-Aldrich) intraperitoneális injekciójával a korábban leírtak szerint (27). A DTx-et 30 perccel a műtét előtt, majd naponta adták be a végpontig. Az ILC2- kimerülésének megerősítésére a naiv állatok egy része DTx-et kapott 3 napig. A kontroll Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus egerek intraperitoneális sóoldat injekciót kaptak.

Szövettan

Kimetszettékveseazonnal kettévágták hosszirányban a hilumon keresztül. A felét 10%-os pufferolt formalinban fixáltuk, amely 4% formaldehidet tartalmazott, 24 órán át, majd 10%-os etanolban ideiglenesen tárolták, paraffinba ágyazták és metszettek. Négy mikrométeres, hosszirányban metszett metszeteket perjodsav-Schiff-el (PAS) és Masson-féle trikrómmal festettünk. A hisztopatológiát a tubulusok tágulásának, az apoptózisnak vagy a gipszképződésnek a vizualizálásával határozták meg, egy jól bevált szemikvantitatív módszerrel (28), kisebb változtatásokkal a leírtak szerint (15). Az egyes állatokból származó ismétlődő PAS-festett metszetekből átlagot vettünk. A tubulusok 0=0 százalékát érintették a fenti kórszövettani jellemzők; 1=1–10 százalék ; 2=11–25 százalék ; 3=26–50 százalék ; 4=51–75 százalék ; 5=76–100 százalék . A kollagén lerakódását Masson-féle trikróm segítségével határoztuk meg, és a kollagént metilkék tartalomként azonosítottuk a szomszédos tubulusok között.

RNS extrakció, reverz transzkripció és qPCR

Az egyik vese felét megtartottuk a génexpressziós elemzéshez. A szövetet 400 µl PBS-ben homogenizáltuk TissueLyser LTTM (Qiagen, Chadstone Centre, Ausztrália) segítségével, másodpercenként 50 oszcillációval 2 percig. A mintából 200 mikrolitert vettünk ki további elemzésekhez. Egy milliliter TRI Reagent R-t (Sigma-Aldrich) adtunk a maradék 200 µl mintához, amely további 50 oszcillációt kapott másodpercenként 1-2 percig, amíg teljesen homogenizálódott. 5 perces szobahőmérsékleten végzett inkubálást és 10 perces 12 xg-vel végzett centrifugálást követően a felülúszót extraháltuk, és 250 µl kloroformmal (Sigma-Aldrich) vortexeltük. 10 perces szobahőmérsékleten végzett inkubálás és 15 perces 12,{16}}xg-vel végzett centrifugálás után a felülúszót extraháltuk, és 500 µl 70%-os izopropanollal (Sigma-Aldrich) vortexeltük. A mintát ismét 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd 10 percig 12,{23}}xg-vel centrifugáltuk. A felülúszót eldobtuk anélkül, hogy az RNS-ben gazdag pelletet megzavartuk volna. A pelletet kétszer mostuk 1 ml 75%-os RNS-minőségű etanollal (Sigma-Aldrich), centrifugáltuk 10,{31}}xg-vel 5 percig, és a felülúszót minden alkalommal eldobtuk. A pelletet szobahőmérsékleten rövid ideig levegőn szárítottuk, majd 80–100 µl UltraPureTM DNáz/RNáz-mentes kétszer desztillált vízben (ddH2O; Thermo-Fisher Scientific) újraszuszpendáltuk, majd a reverz transzkripció előtt 80 ◦C-on tároltuk. . Közvetlenül a reverz transzkripció előtt az RNS-hozamot spektrofotometriás értékeléssel határoztuk meg Nanodrop2{46}}TM (Thermo-Fisher Scientific) segítségével. Minden mintából 5 mikrolitert hígítottunk ddH2O-val úgy, hogy mintánként 1000 ng RNS-t töltsünk be. A DNSse (Sigma-Aldrich) kezelést követően a cDNS-t az M-MLV (Thermo-Fisher Scientific, North Ryde, Ausztrália) enzim standard műveleti eljárásaival állítottuk elő T100TM hőciklusos berendezés (BioRad Laboratories, Gladesville, Ausztrália) alkalmazásával. A qPCR-t SYBR alapú módszertan segítségével CFX384 TouchTM (BioRad Laboratories) segítségével végeztük a szabványos működési eljárások szerint. Minden primer készletet gradiensen teszteltünk, hogy meghatározzuk az amplifikáció optimális hőmérsékletét (2. kiegészítő táblázat). A ciklus számszerűsítését minden egyes célpont regressziójával értelmeztük, a génexpressziót a hipoxantin-guanin foszforiboziltranszferázhoz (Hprt) képest normalizáltuk. Az olvadási görbéket a primer dimerizáció és a nem specifikus amplifikáció jelei szempontjából értékeltük. Minden lemezen legalább egy negatív kontrollt és egy templát nélküli kontrollt használtunk minden egyes célponthoz, hogy biztosítsuk, nincs szennyeződés az egyes mesterkeverékekben vagy az alkalmazott ddH2O-ban.

RT2 Profiler Array

Az RT² ProfifilerTM PCR Array Mouse Extracellular Matrix & Adhesion Molecules (Qiagen) a gyártó utasításai szerint történt, és az adatokat feltöltötték, majd a https://dataanalysis webhelyről elérhető online eszközzel elemezték. qiagen.com/pcr/arrayanalysis.php. Ez a tömb 84 gén profilozását teszi lehetővé legfeljebb 4 mintában, ezért egy csoportban minden replikátumhoz azonos mennyiségű cDNS-t gyűjtöttek össze WT egerekből az IRI-t követő 1., 3. vagy 7. napon, és minden egyes replikátumból ál-poolt gyűjtöttek össze. ezekből az időpontokból. Mindegyik célpont esetében az IRI-t követő hajtásváltozást összehasonlítottuk az ál-expresszióval.

Statisztikai analízis

Az összes adatot a Graphpad Prism v8.{6}}2 szoftverrel elemeztük, nem-paraméteres párosítatlan t-teszttel (Mann-Whitney U-teszt). P < 0,05="" volt="" a="" küszöb="" a="" statisztikailag="" szignifikáns="" különbségek="" meghatározásához.="" ∗p="">< 0,05,="" ns="" nem="" szignifikáns.="" minden="" adatot="" átlag="" ±="" sem-ben="" fejeztünk="" ki.="" mindegyik="" elemzésben="" n="4–8" ismétlés="" volt="" csoportonként,="" és="" az="" eredmények="" legalább="" két="" kísérletet="" reprezentáltak.="" az="" egyes="" kísérletek="" mintanagyságát="" a="" megfelelő="" ábra="" magyarázata="" írja="">

EREDMÉNYEK

A vese ILC2-k konstitutívan expresszálják az IL-t-5, és homeosztatikus körülmények között a vese érrendszerében lokalizálódnak

Részletes elemzést végeztünk a vese ILC2 fenotípusáról és elhelyezkedéséről homeosztatikus körülmények között. Szignifikánsan több ILC2 volt (CD45 plusz Lineage IL- 7R plusz CD90.2 plusz ST2 plusz FSClowSSClow egysejt) a vesében, mint a tüdőben, ha az összes CD45 plusz egysejt százalékában adjuk meg (1A. ábra; Kiegészítő 1A, B) ábra). A vese és a tüdő ILC2-einek t-SNE elemzése egyedi klaszterezést mutatott, bár ezek a klaszterek nem különböztek teljesen egymástól (1B. ábra). A vese ILC2-einek azonban jelentősen alacsonyabb volt a CD25 expressziója, az ICOS és a KLRG1 konzisztens expressziója, de magasabb volt az IL-5 expressziója a tüdő ILC2-eihez képest (1C. ábra). A vese ILC2-ekben magasabb volt az IL-5 konstitutív expressziója, mint az IL-13 (1D ábra; 1C, D kiegészítő ábra). Megállapították, hogy az ILC2-k a fő IL-5 termelő sejttípus a vesében, a T helper típusú -2 (TH2) sejtek elhanyagolható hozzájárulásával (1E. ábra, 1E., F. kiegészítő ábra). Ezért az IL-5-t helyettesítő markerként használták az ILC2-k helyének azonosítására az egérvesén belül, amint azt több perifériás szervnél leírták (29–31). Ezt IL-5-kapcsolt Cre-rekombinázt expresszáló egerek felhasználásával érték el Rosa-paradicsom vonalkövetővel keresztezve (30, 31). IL-5 plusz sejteket (főleg ILC2-ket) találtak az egészvesede elsősorban a fő érrendszerre lokalizáltak, amint azt az alfa-simaizom-aktin (-SMA) pozitív festéssel láttuk (2A ábra; 2A, B kiegészítő ábra), összhangban a legutóbbi jelentésünkkel (29). Úgy találták, hogy az ILC2-k az interlobuláris és az íves veseerekkel is kapcsolatban állnak a kéregben és a velőrégióban, amint azt a limfatikus endoteliális hialuronán receptor-1 (LYVE1) expressziója mutatja (2B. ábra). További képalkotó vizsgálatok kimutatták, hogy a CD3 plusz sejtekből (elsősorban TH2 sejtek) nagyon kevés járult hozzá az endogén IL-5 plusz jelhez (2C. ábra). Az ILC2-ket az ér adventitiájában azonosították az artériás -SMA pszeudoszínes felületi rekonstrukciójával.

Az ILC2-k csökkenése, hiánya vagy kimerülése nem változtatja meg a kísérleti vese ischaemia-reperfúziós sérülés súlyosságát egerekben

Given ILC2s were present in the kidney and localized to the renal vasculature, the impact of ILC2 reduction, deficiency, or depletion on the severity of experimental renal IRI was assessed. This was achieved by using ILC2-reduced (Roraflfl/+Il7rcre/+)-deficient (Roraflfl/flfl Il7rcre/+), and -depleted (DTx-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) mice compared to WT and vehicle (saline-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) controls. These mice have been previously described as appropriate tools for assessing ILC2 function in vivo in other organs such as the lung (27, 32). Here we show that these tools are also appropriate for assessing ILC2 function in the kidney. Indeed, kidney ILC2s were significantly lower in the ILC2-reduced, -defificient, and -depleted groups compared to WT or saline-treated controls (Figure 3A). Time-course analysis of IRI in wild-type mice identified day 7 as the most appropriate time point for the assessment of injury severity due to the presence of histopathological features of acute tubular necrosis, collagen deposition and increased mRNA expression of extracellular matrix, injury-associated, and inflflammatory factors (Supplementary Figures 3, 4). At day 7, 25/84 extracellular matrix factors were increased >2-szerese az álkontrollokhoz képest, míg 1/84 és 6/84 nőtt az 1. és 3. napon (4A. kiegészítő ábra). IRI által kiváltott akut tubuláris nekrózis, amelyet kitágult tubulusok és gipszképződés jellemez, összehasonlítva az álkontrollokkal (3B. ábra, 3A, 4B kiegészítő ábra). Ezt a tubuláris sérülés pontszámaként határoztuk meg, és a sérülés súlyossága minden genotípusban hasonló volt (3C. ábra). Az IRI kollagénlerakódást is indukált, amelyet a velő és a kéreg tubulusai közötti metilkék tartalom jellemez, összehasonlítva az álkontrollokkal (3D ábra; 3B kiegészítő ábra). A kollagén lerakódását nem befolyásolta az ILC2 hiánya. Az IRI a sérüléssel összefüggő faktorok, a kemokinek és a gyulladást elősegítő citokinek mRNS-expresszióját is növelte (3E–J. ábra, 4C–K. kiegészítő ábra). A neutrofil zselatinázzal asszociált lipokalint (Lcn2; NGAL), a vesekárosodás biomarkerejét (33, 34) megnövelte az IRI, és nem befolyásolta az ILC2 csökkenése, hiánya vagy kimerülése (3E. ábra). A CXC motívum kemokin ligandum 1 (Cxcl1) és Cxcl2 szintén szignifikánsan megemelkedett az IRI hatására minden genotípusban (3F, G ábra). Hasonlóképpen, a gyulladást elősegítő citokin tumor nekrózis faktort (Tnf) növelte az IRI, összehasonlítva az álkontrollokkal (3H. ábra). A látható kollagénlerakódásnak megfelelően az extracelluláris mátrix faktorok, az I. típusú kollagén alfa 1 lánc (Col1a1) és a fibronektin 1 (Fn1) mRNS expresszióját az IRI minden genotípusban megnövelte (3I., J. ábra).

VITA

Az ILC2-k a szöveti homeosztázis kritikus szabályozói, de a vesében betöltött szerepüket még teljesen tisztázni kell. Míg az ILC2-k szaporodásra ösztönözhetők, és megvédhetők a kísérleti vesekárosodás káros következményei ellen, még nem ismert, hogy mi történik e sejtek hiányában. Először azt vizsgáltuk, hogy az ILC2 számok a CD45 plusz hematopoetikus sejtek arányában különböznek-e a tüdőben és a vesében. Az ILC2-k nagyobb arányban tették ki a CD45 plusz sejteket a vesében, mint a tüdőben. A t-SNE analízis mindkét helyről eltérően csoportosította az ILC2-ket, azonban a klaszterek nem különböztek teljesen e szövetek között. Különbségek voltak a sejtfelszíni antigénjükben és a 2-es típusú citokin expressziójában, a vese ILC2-ek nagyobb mennyiségű IL-t expresszáltak{10}}. Valójában a vese ILC2-jei konstitutívan magas IL-5 szintet fejeztek ki homeosztatikus körülmények között. Az ILC2-k a vese IL-5 fő forrását is jelentették, a TH2-sejtek csak elhanyagolható mértékben járultak hozzá. Ezért az IL-5-t helyettesítő markerként használták e sejtek vesében való elhelyezkedésének meghatározására. Az ILC2-ket a vesén belül azonosították, és szinte kizárólag a vese érrendszerében helyezkedtek el. Ezekben a vizsgálatokban egy IL-5-kapcsolt Cre-rekombinázt használtak egy flox-stop-flox szekvenciával együtt egy CAG-RFP-WPRE kazetta előtt a konstitutívan expresszált ROSA26 lókuszban az ILC2-k lokalizálására. A vese nyirok endoteliális sejtjei által expresszált LYVE1-et használták e sejtek egérvesén belüli elhelyezkedésének további meghatározására (35). Amint az várható volt, a LYVE1 festődés a kéreg veseartériáinak kötőszövetébe ágyazódott be, de nem a velő belsejébe, mivel a vese ezen régiójában nem található észrevehető nyirokhálózat (35–37). Feltehetően az ILC2-k a vaszkuláris közelében helyezkednek el, mivel a vese endothel sejtek az IL-33 fő forrásai a vesében (38, 39). Megerősítve a FACS által az egysejtű veseszuszpenziókra vonatkozó megfigyeléseinket, ismét az ILC2-ket találtuk az IL-5 fő termelőjének a veseszöveti metszetekben, a CD3 plusz T-sejtek minimális hozzájárulásával. Míg ezek a vizsgálatok kimutatják az ILC2-k elhelyezkedését a vesében riporter egerek segítségével, azt még meg kell határozni, hogy az ILC2-k az emberi vese érrendszere mellett is találhatók-e, és hogy az ILC2-k elhelyezkedése megváltozik-e a vesekárosodás hatására. Bár számos jelentés azt találta, hogy az ILC2-számok változatlanok a vesekárosodás miatt, fenotípusuk és a sérülést követő aktiválási állapotuk további tisztázást igényel (12–16). Ezután jellemeztük az ILC2-k funkcionális szerepét a vesében a funkcióvesztési megközelítés segítségével. Ennek elérése érdekében kihasználtuk az ILC{48}}csökkentett és hiányos egereket, valamint azokat az egereket, amelyekből DTx beadása után feltételesen kimerültek az ILC2-k (27). Validáltuk ezeknek az eszközöknek a használatát az ILC2-k leütésére vagy ablációjára a vesében. Az IRI kísérleti modelljét választottuk, tekintettel az ILC2-k közelségére a vese érrendszeréhez. Bár a sérülés jellemzői láthatóan nyilvánvalóak voltak az IRI-t követően, az ILC2-k csökkenése, hiánya vagy kimerülése nem változtatta meg a vese bruttó hisztopatológiáját, és nem okozott halálozást sem. Valójában az IRI által kiváltott remodelling és a kollagén lerakódás az ILC2-től függetlenül történt. Bár lehetséges, hogy a sérülést követő korábbi időpont különbségeket azonosított a kórszövettani és a génexpresszióban, a vizsgálatunkban szereplő időpont lehetővé tette a kollagén lerakódás értékelését is, amely az ILC2-k által szabályozott remodelling fontos jellemzője (16, 32, 40). –44). Az is valószínű, hogy az ILC2-k csökkenése közben

Az AKI káros lehet a vese szerkezetére és működésére, ha későbbi időpontokban értékelik, az ILC2-k hiányában jelentkező esetleges maladaptív javító válaszok miatt. Ennek megoldása érdekében a jövőbeni tanulmányoknak meg kell vizsgálniuk az ILC2-k szerepét az AKI krónikus vesebetegséggé történő progressziójában (45, 46).

Összességében ez a tanulmány azt bizonyítja, hogy az ILC2-k csökkenése, hiánya vagy kimerülése nem változtatja meg egerekben a kísérleti AKI súlyosságát. Míg az ILC2-ek aktiválása és a helyi 2-es típusú immunitás ezzel összefüggő erősödése korábban kimutatták, hogy csökkenti az AKI káros következményeit, hasonló sérülések fordulnak elő, amikor az ILC2-k csökkennek, hiányoznak vagy kimerültek, ami arra utal, hogy más immunsejtek, például a Treg lehetséges redundanciát és kompenzációt okozhat. , AAM és TH2 sejtek. Ezt a koncepciót alátámasztják a Rag1 / vagy Rag2 / egerekkel végzett vizsgálatok, amelyekben hiányzik az érett T- és B-sejtek.vese sérülés(13, 15, 47, 48). Egy vizsgálatban anti-CD90.2 adagolást alkalmaztak az ILC2-k kimerítésére, azonban ezekben az állatokban Treg- és TH2-sejtek is hiányoztak (15). Ebben a modellrendszerben az ILC2-k anti-CD90.2-vel való kimerülése ellenére a T-sejt-kompartmentből történő kompenzáció nem lehetséges. Adataink azt mutatják, hogy az ILC2-k elvesztése, ha a T-sejt-kompartment sértetlen marad, minimális hatással van az IRI súlyosságára. Adataink alátámasztják azt az elképzelést, hogy az ILC2-k más immunsejteken kívül, mint például a Treg és az AAM, hozzájárulnak az AKI-hoz. Valójában a Treg-kimerülés rontotta az IRI-t követően a szövettani állapotot (15). Hasonlóképpen, a makrofágok AAM felé történő polarizációja elősegíti a sérülések feloldását (5, 12, 46, 49, 50). További vizsgálatokra van szükség az ILC2-k vesében való jelenlétének okának tisztázására, beleértve a felszálló húgyúti fertőzéseket és egyéb vesekárosodást, valamint a progressziójátkrónikus betegség.

ETIKAI NYILATKOZAT

Minden sebészeti eljárást jóváhagyott a Newcastle Egyetem Állatgondozási és Etikai Bizottsága az állatok tudományos célú gondozására és felhasználására vonatkozó ausztrál kódexnek megfelelően. Az immunfluoreszcens képalkotási eljárásokat az UCSF Animal Care and Use Committee és a Laboratory Animal Resource Center által megállapított irányelveknek megfelelően hagyták jóvá és hajtották végre.

SZERZŐI HOZZÁJÁRULÁSOK

A bemutatott mű minden szerzővel együttműködve készült. A GC elvégezte a sebészeti modellt, áramlási citometriát, szövettani értékelést, génexpressziós elemzést és elemezte az adatokat. KC és ABM végezte az immunfluoreszcens kísérleteket. Az SL állatfigyeléssel és áramlási citometriával segített. SJ és AD klinikai betekintést nyújtott a vizsgálat tervezésébe és a műtéti technikába. Az ANM létrehozta, szállította és tanácsot adott az ILC{0}}hiányos és kimerült és Il13td paradicsom egerek használatához. A PF szállította és tanácsot adott az Il5venus riportervonal használatához. A PF és a PH tanácsot adott a kísérleti tervezéshez. Az MS megtervezte, felügyelte és elősegítette a tanulmányok minden vonatkozását. Valamennyi szerző részt vett az adatok értelmezésében, a szellemi tartalom kéziratainak előkészítésében és szerkesztésében.

FINANSZÍROZÁS

Az MS-t az Australian Research Council (ARC) Discovery Early Career Researcher Award (DECRA) ösztöndíja, valamint az Országos Egészségügyi és Orvosi Kutatói Tanács (NHMRC), a Hunter Medical Research Institute és a Hunter Children's Research Foundation támogatásai támogatják.

IRODALOM

1. Susantitaphong P, Cruz DN, Cerda J, Abulfaraj M, Alqahtani F, Kouloururidis I és mások. Az AKI világméretű előfordulása: metaanalízis.Clin J Am Soc Nephrol. (2013) 8:1482–93.

2. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, Duchen MR. A többfoton képalkotás különbségeket tár fel a mitokondriális funkcióban a nefron szegmensek között.J Am Soc Nephrol. (2009) 20:1293–302.

3. Devarajan P. Frissítés az ischaemiás akut vesekárosodás mechanizmusairól.J Am Soc Nephrol. (2006) 17:1503–20. 

4. Bonventre JV, Yang L. Ischaemiás akut vesekárosodás sejtpatofiziológiája.J Clin Invest.(2011) 121:4210–21. DOI: 10.1172/JCI 45161

5. Lee S, Huen S, Nishio H, Nishio S, Lee HK, Choi BS stb. Az eltérő makrofág fenotípusok hozzájárulnak a vese sérüléséhez és helyreállításához.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:317–26. 

6. Friedewald JJ, Rabb H. Gyulladásos sejtek ischaemiás akut veseelégtelenségben.Kidney Int.(2004) 66:486–91. 

7. Spits H, Artis D, Colonna M, Diefenbach A, Di Santo JP, Eberl G és mások. Veleszületett limfoid sejtek - javaslat az egységes nómenklatúrára.NatRev Immunol.(2013) 13:145–9. 

8. Moro K, Yamada T, Tanabe M, Takeuchi T, Ikawa T, Kawamoto H és társai. A T(H)2 citokinek veleszületett termelése a zsírszövethez kapcsolódó c-Kit( plus )Sca-1( plus ) limfoid sejtek által.Természet. (2010) 463:540–4. 

9. Neill DR, Wong SH, Bellosi A, Flynn RJ, Daly M, Langford TKA és mások. A nuociták egy új veleszületett effektor leukocitát képviselnek, amely a -2 típusú immunitást közvetíti.Természet. (2010) 464:1367–70. 

10. Loering S, Cameron GJM, Starkey MR, Hansbro PM. A tüdő fejlődése és a 2-es típusú immunitás új szerepei.J Pathol.(2018) 247:686–96. 

11. Monticelli LA, Sonnenberg GF, Abt MC, Alenghat T, Ziegler CG, Doering TA és munkatársai. A veleszületett limfoid sejtek elősegítik a tüdőszövet homeosztázist az influenzavírussal való fertőzés után.Nat Immunol. (2011) 12:1045–54. 

12. Huang Q, Niu Z, Tan J, Yang J, Liu Y, Ma H és társai. Az IL-25 veleszületett limfoid sejteket és multipotens 2-es típusú progenitor sejteket vált ki, amelyek csökkentik a vese ischaemiás/reperfúziós károsodását.J Am Soc Nephrol.(2015) 26:2199–211. 

13. Riedel JH, Becker M, Kopp K, Duster M, Brix SR, Meyer-Schwesinger C és mások. A 2-es típusú veleszületett limfoid sejtek IL-33-közvetített expanziója megvéd a progresszív glomerulosclerosistól.J Am Soc Nephrol.(2017) 28:2068–80. 

14. Stremska ME, Jose S, Sabapathy V, Huang L, Bajwa A, Kinsey GR stb. Az IL233, egy új IL-2 és IL-33 hibrid citokin, javítja a vesekárosodást.J Am Soc Nephrol. (2017) 28:2681–93. 

15. Cao Q, Wang Y, Niu Z, Wang C, Wang R, Zhang Z és mások. A szövetben rezidens 2-es típusú veleszületett limfoid sejtek IL-33 általi potencírozása a vese ischaemia-reperfúziós sérülésének megelőzése érdekében.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:961–76. 

16. Sabapathy V, Cheru NT, Corey R., Mohammad S, Sharma R. Egy új hibrid citokin IL233 közvetíti a regenerációt doxorubicin által kiváltott nefrotoxikus sérülés után.Sci Ismétlés. (2019) 9:3215. 

17. Cameron GJM, Jiang SH, Loering S, Deshpande AV, Hansbro PM, Starkey MR. A 2. csoportba tartozó veleszületett limfoid sejtek új terápiás potenciálja akut vesekárosodásban.J Pathol. (2019) 2019:5242. 

18. Singh AP, Junemann A, Muthuraman A, Jaggi AS, Singh N, Grover K és mások. Az akut veseelégtelenség állatmodelljei.Pharmacol Ismétlés. (2012) 64:31–44. 

19. Ramesh G, Ranganathan P. Egérmodellek és módszerek emberi betegségek, akut vesekárosodás (AKI) tanulmányozására.Módszerek Mol Biol.(2014) 1194:421–36. 

20. Skrypnyk NI, Harris RC, de Caestecker képviselő. Az akut vesekárosodás és a sérülés utáni fibrózis ischaemia-reperfúziós modellje egerekben.J VisExp.(2013) 9:78. 

21. Wei Q, Dong Z. Ischaemiás akut vesekárosodás egérmodellje: technikai megjegyzések és trükkök.Am J Physiol Renal Physiol.(2012) 303:F1487–94? 

22. Starkey MR, McKenzie ANJ, Belz GT, Hansbro PM. A 2. tüdőcsoport veleszületett limfoid sejtek: meglepetések és kihívások.Mucosal Immunol.(2019) 12:299–311. 

23. Jang HR, Rabb H. Immunsejtek kísérletes akut vesekárosodásban.Nat Nephrol tiszteletes.(2015) 11:88–101. DOI: 10.1038/nrneph.2014.180

24. Turner JE, Becker M, Mittrucker HW, Panzer U. Tissue-resident lymphocytes in the vese.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:389–99. 

25. Jang HR, Rabb H. A veleszületett immunválasz ischaemiás akut vesekárosodásban.Clin Immunol. (2009) 130:41–50. 

26. Langford DJ, Bailey AL, Chanda ML, Clarke SE, Drummond TE, Echols S és mások. A fájdalom arckifejezéseinek kódolása laboratóriumi egérben.NatMód.(2010) 7:447–9.

27. Oliphant CJ, Hwang YY, Walker JA, Salimi M, Wong SH, Brewer JM és társai. Az MHCII által közvetített párbeszéd a 2. csoportba tartozó veleszületett limfoid sejtek és a CD4 plusz T sejtek között erősíti a 2-es típusú immunitást és elősegíti a parazita bélféreg kilökődését.Immunitás. (2014) 41:283–95. 

28. Shih W, Hines WH, Neilson EG. A ciklosporin A hatása az immunmediált intersticiális nephritis kialakulására.Vese Int. (1988) 33:1113–8.

29. Dahlgren MW, Jones SW, Cautivo KM, Dubinin A, Ortiz-Carpena JF, Farhat S és mások. Az adventitiális stromasejtek határozzák meg a 2. csoportba tartozó veleszületett limfoid sejtszövet réseit.Immunitás. (2019) 50:707–22. 

30. Molofsky AB, Nussbaum JC, Liang HE, Van Dyken SJ, Cheng LE, Mohapatra A és társai. A veleszületett 2-es típusú limfoid sejtek fenntartják a zsigeri zsírszövet eozinofiljeit és alternatív módon aktivált makrofágokat.J Exp Med.(2013) 210:535–49. 

31. Nussbaum JC, Van Dyken SJ, von Moltke J, Cheng LE, Mohapatra A, Molofsky AB és mások. A 2-es típusú veleszületett limfoid sejtek szabályozzák az eozinofil homeosztázist.Természet.(2013) 502:245–8. 

32. Donovan C, Starkey MR, Kim RY, Rana BMJ, Barlow JL, Jones B és társai. A T/B limfociták és az ILC2 szerepe kísérletes krónikus obstruktív tüdőbetegségben.J Leukoc Biol.(2019) 105:143–50. 

33. Mishra J, Ma Q, Prada A, Mitsnefes M, Zahedi K, Yang J és mások. A neutrofil zselatinázhoz kapcsolódó lipocalin azonosítása az ischaemiás vesekárosodás új korai vizelet-biomarkereként.J Am Soc Nephrol.(2003) 14:2534–43. 

34. Supavekin S, Zhang W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P. Differential geneexpression after early renal ischaemia/reperfusion.Kidney Int.(2003) 63:1714–24. 

35. Skorecki K, Chertow GM, Marsden PA, Taal MW, Alan SL, Luyckx V. A vese anatómiája: Nyirokrendszer. Ban ben:Brenner ésrektoriA vese e-könyv. 10. kiadás Amszterdam: Elsevier (2015). p. 80–1.

36. Banerji S, Ni J, Wang SX, Clasper S, Su J, Tammi R et al. A LYVE-1, a CD44 glikoprotein új homológja, a hialuronán nyirokspecifikus receptora.J Sejt Biol. (1999) 144:789–801. 

37. Lee HW, Qin YX, Kim YM, Park EY, Hwang JS, Huo GH és társai. A limfatikus endotélium-specifikus hialuronán receptor LYVE-1 expressziója a fejlődő egérvesében.SejtSzövetRes.(2011) 343:429–44.

38. Shelite TR, Liang Y, Wang H, Mendell NL, Trent BJ, Sun J és mások. Az IL- 33-dependens endoteliális aktiváció hozzájárul az apoptózishoz és a vesekárosodáshoz orientált tsutsugamushi-fertőzött egerekben.PLoS Negl Trop Dis.(2016) 10:e0004467.

39. Ferhat M, Robin A, Giraud S, Sena S, Goujon JM, Touchard G és mások. Az endogén IL-33 riasztóként hozzájárul a vese ischaemia-reperfúziós sérüléséhez.J Am Soc Nephrol. (2018) 29:1272–88. 

40. Mchedlidze T, Waldner M, Zopf S, Walker J, Rankin A, Schuchmann M és munkatársai. Az interleukin-33-dependens veleszületett limfoid sejtek közvetítik a májfibrózist.Immunitás. (2013) 39:357–71. 

41. Moretti S, Renga G, Oikonomou V, Galois C, Pariano M, Iannitti RG és társai. A hízósejt-ILC2-Th9 útvonal elősegíti a tüdőgyulladást cisztás fibrózisban.Nat Commun. (2017) 8:14017. 

42. Hams E, Armstrong ME, Barlow JL, Saunders SP, Schwartz C, Cooke G és társai. Az IL-25 és a 2-es típusú veleszületett limfoid sejtek tüdőfibrózist indukálnak.ProcNatlAcad Sci USA. (2014) 111:367–72.

43. Wohlfahrt T, Usherenko S, Englbrecht M, Dees C, Weber S, Beyer C, et al. A 2-es típusú veleszületett limfoid sejtek száma megnövekszik a szisztémás szklerózisban szenvedő betegeknél, és korrelál a fibrózis mértékével.Ann Rheum Dis.(2016) 75:623–6. 

44. Li D, Guabiraba R, Besnard AG, Komai-Koma M, Jabir MS, Zhang L és munkatársai. Az IL-33 elősegíti az ST2-dependens tüdőfibrózis kialakulását azáltal, hogy alternatív módon aktivált makrofágokat és veleszületett limfoid sejteket indukál egerekben.J Allergy Clin Immunol. (2014) 134:1422–32. 

45. Sharp CN, Doll MA, Megyesi J, Oropilla GB, Beverly LJ, Siskind LJ. Az ismételt ciszplatin beadása által kiváltott szubklinikai vesekárosodás progresszív krónikus vesebetegséghez vezet.Am J Physiol Renal Physiol.(2018) 315:F161–72? 

46. ​​Liu J, Kumar S, Dolzhenko E, Alvarado GF, Guo J, Lu C és munkatársai. Az akut vesekárosodásból a krónikusba való átmenet molekuláris jellemzése ischaemiát/reperfúziót követően.JCI Insight.(2017) 2:94716. 

47. Li L, Huang L, Sung SJ, Lobo PI, Brown MG, Gregg RK és társai. Az NKT sejtaktiváció közvetíti a neutrofil IFN-gamma termelést és a vese ischaemia-reperfúziós sérülését.J Immunol.(2007) 178:5899–911.

48. Chan AJ, Alikhan MA, Odobasic D, Gan PY, Khouri MB, Steinmetz OM és társai. A veleszületett IL-17A-termelő leukociták gyulladásos és Toll-szerű receptorok aktiválásával elősegítik az akut vesekárosodást.Am J Pathol.(2014) 184:1411–8? 

49. Cao Q, Wang C, Zheng D, Wang Y, Lee VWS, Wang YM és mások. Az IL-25 M2-makrofágokat indukál, és csökkenti a vesekárosodást proteinurikus vesebetegségben.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:1229–39.

50. Chung S, Overstreet JM, Li Y, Wang Y, Niu A, Wang S és mások. A TGF-béta elősegíti a fibrózist súlyos akut vesekárosodás után a vese makrofág-infiltrációjának fokozásával.JCI Insight.(2018) 3:123563.