A magas foszfortartalmú étrend fokozza a Bmp2 és Spp1 MRNS expresszióját a patkányvesében

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

A magas foszfortartalmú (P) diéta által kiváltott nephrocalcinosis kialakulásának mechanizmusának tisztázása érdekében a csontokhoz kapcsolódó fehérjékre összpontosítottunk, mint például a csont morfogenetikus protein 2 és az osteopontin. Ez a tanulmány a magas P-tartalmú étrend hatásait vizsgálta a Bmp2 és Spp1 mRNS expressziójára patkányban.vese. A Wistar patkányokat két csoportra osztották, és kontrolltáppal (kontrollcsoport) vagy magas P-tartalmú diétával (magas P csoport) etették.Vesea kalcium- és P-koncentráció szignifikánsan megemelkedett a magas P csoportban a kontrollcsoporthoz képest. Mind a Bmp2, mind az Spp1 mRNS expressziója szignifikánsan megnövekedett a magas P csoportban a kontroll csoporthoz képest. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a magas P-tartalmú diéta a Bmp2 és Spp1 mRNS felszabályozását idézi elővese.

Kulcsszavak: magas foszfortartalmú étrend, nephrocalcinosis, Bmp2, Spp1,vese, patkány

További információért forduljon:emily.li@wecistanche.com

cistanche vesebetegség kezelésére

Bevezetés

A nephrocalcinosis egy olyan rendellenesség, amelyet a vese parenchyma kalcium (Ca) lerakódása jellemez. Különösen az étrendi foszfor (P) kulcsfontosságú tényező e rendellenesség kialakulásában. Kimutatták, hogy a magas P-tartalmú diéta megnövekedett Ca-koncentrációt eredményez aveseés Ca-lerakódások a veseparenchymában1-6）. Bár a magas P-tartalmú étrendnek a nephrocalcinosis kialakulására gyakorolt ​​hatása a folyamatban lévő tanulmányok középpontjában áll, keveset tudunk a betegség kialakulásáért felelős mechanizmusról. Ezért a probléma időben történő megoldására van szükség.

Beszámoltunk arról, hogy transzmissziós elektronmikroszkópos szövettani vizsgálat során hidroxiapatitszerű tű alakú kristályokat figyeltek meg magas P-tartalmú táplálékkal etetett patkányok vesetubulusaiban6, 7）. A röntgen-mikroanalízis azt mutatta, hogy a magas P-tartalmú étrend által kiváltott Ca-lerakódások főként Ca-ból és P7-ből állnak. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a magas P-tartalmú étrend által kiváltott Ca-lerakódások a hidroxiapatit egyik formája. Ennek alapján feltételezzük, hogy a nephrocalcinosis kialakulását a csontképződéshez hasonló mechanizmus szabályozza. Ezért a jelen tanulmány a csonthoz kapcsolódó fehérjékre, például a csont morfogenetikai fehérjére 2 (BMP2) összpontosított. A BMP2 egy oszteogén faktor, amely oszteogenezis-indukáló aktivitást mutat8, 9）. Figyelemre méltó, hogy a BMP2-t méhen kívüli indukáló tényezőként azonosítottákcsontképződés10, 11). Feltételeztük tehát, hogy ha a BMP2 fontos szerepet játszik a nephrocalcinosis kialakulásában, akkor ennek a fehérjének a kifejeződése avesefelszabályozná a magas P-tartalmú étrend. Jelen tanulmány célja annak meghatározása volt, hogy a magas P-tartalmú étrend befolyásolja-e a Bmp2 mRNS expresszióját avese.

Eközben korábbi tanulmányunk arról számolt be, hogy a magas P-tartalmú diéta immunhisztokémiai elemzéssel növeli az osteopontin (OPN) expresszióját a vesetubulusokban, ami arra utal, hogy az OPN szerepet játszhat a magas P-tartalmú étrend által kiváltott Ca-lerakódások kialakulásában12）. Ezért megvizsgáltuk az Spp1 mRNS expressziójának változásait aveseis.

A jelen tanulmány eredményei értékes betekintést nyújthatnak a magas P-tartalmú étrend által kiváltott nephrocalcinosis kialakulásáért felelős mechanizmusba.

Anyagok és metódusok

Állatok és étrendek.

A jelen vizsgálatot a Tokiói Mezőgazdasági Egyetem Állathasználati Bizottsága hagyta jóvá, és minden állatot az egyetem laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó irányelveinek megfelelően tartottak (jóváhagyási szám: 300049).

Fontos megjegyezni, hogy a nőstény patkányokban könnyebben alakul ki nephrocalcinosis, mint a hím patkányoknál13, 14）. Ezenkívül beszámoltunk arról, hogy a magas P-tartalmú étrend növeli az OPN expresszióját nőstény patkányok vesetubulusaiban12）. A jelen tanulmány ezután nőstény patkányokat használt kísérleti állatokként. Négy hetes nőstény Wistar patkányokat (Clea Japan, Tokió, Japán) egyedi rozsdamentes acél dróthálós ketrecekben helyeztünk el. A kísérleti időszakban a ketreceket szabályozott világítású helyiségben helyezték el, 12-h fény: sötét ciklus (világos, 0800-2000 h), 22 ± 1 fok hőmérséklet és 60 relatív páratartalom mellett. százalékról 65 százalékra.

A kísérleti étrendek összetételét aTable 1. A kísérleti diétákat az AIN{{0}}G diéta15 alapján készítették el. A kísérleti diéták két különböző P-koncentrációt tartalmaztak (kontroll diéta, 0,3%; magas P-tartalmú étrend, 1,5%). A magas P-tartalmú étrendben a P-koncentrációt 1,5 százalékra állítottuk, mivel korábbi vizsgálataink azt figyelték meg, hogy az étrend 1,5 százalékos P-koncentrációja indukálja

súlyos nephrocalcinosis6, 7, 12, 14）és magas OPN expresszió12）. Minden kísérleti étrendben azonos Ca-koncentráció volt (0,5 százalék). A kísérleti étrendek elemzésével meghatározott P- és Ca-koncentrációkat az alábbi ábrán mutatjuk beTable 1. A vizsgálat megkezdése előtt az összes patkányt 7 napig akklimatizálták, ezalatt szabad hozzáférést kaptak a kontrolltáphoz és ionmentesített vízhez. Az akklimatizációs periódus után a patkányokat véletlenszerűen két, hasonló átlagos testtömegű csoportra osztották, és 14 napon át vagy a kontroll étrenddel (kontrollcsoport) vagy a magas P-tartalmú diétával (magas P-csoport) etették őket. A kísérleti időszak alatt a patkányok szabad hozzáférést kaptak a hozzárendelt kísérleti étrendekhez és ionmentesített vízhez. A kísérleti időszak végén a patkányokat érzéstelenítő keverék (medetomidin, midazolam és butorfanol) intraperitoneális injekciójával, valamint vérrel, ill.vesemintákat gyűjtöttünk elemzés céljából. A vérmintákat centrifugáltuk, és a felülúszókat szérummintaként használtuk. A veséket eltávolították, és a vesekapszulát eldobták. A szérum ésvesea mintákat -80 fokon tároltuk, amíg szükségük volt az elemzéshez. A jobb vesét használtuk a Bmp2 és Spp1 mRNS kvantitatív analíziséhez, a bal vesétveseCa- és P-koncentrációk elemzésére használtuk.

Ásványelemzés.

Minták a kísérleti étrendekből ésvese550 fokon 48 órán át tokos kemencében hamvasztottuk, és az ásványokat 1 mol/l sósavval extraháltuk elemzés céljából. Ca koncentrációk a kísérleti étrendekben ésveseatomabszorpciós spektrofotometriával határoztuk meg16）. P koncentrációk a kísérleti étrendekben ésveseGomori17) módszerével elemeztük.

A Bmp2 és Spp1 mRNS kvantitatív elemzése.

A homogenizált veséből a teljes RNS-t izoláltuk TRIzol reagenssel (Life Technologies, CA, USA) a gyártó előírásai szerint. Az RNS mennyiségét és tisztaságát NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) segítségével értékeltük. A cDNS-t a SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix segítségével szintetizáltuk qRT-PCR-hez (Life Technologies), majd kvantitatív valós idejű RT-PCR-nek vetettük alá a SYBR Select Master Mix (Life Technologies) segítségével. Specifikus primereket18-20) használtak a Bmp2 (előre, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; fordított, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (előre, 5'-) elemzésére A }'). A valós idejű PCR reakciót StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) segítségével hajtottuk végre, és az mRNS expressziós szinteket a Gapdh mRNS szintekre normalizáltuk. A kontrollcsoport értékét 1,00-nak tekintettük.

Statisztikai analízis.

Az eredményeket átlag ± SEM formában mutatjuk be minden 6 patkányból álló csoportra. A varianciák homogenitásának meghatározására F-próba végrehajtása után Student-féle t-próbát alkalmaztunk a két csoport közötti szignifikáns különbségek meghatározására. Ha a varianciák homogenitása nem volt egyenlő, a Student-féle t-próba helyett Welch-tesztet alkalmaztunk. A különbségeket p ＜ 0,05 értéknél tekintettük szignifikánsnak

Eredmények

Testsúly, táplálékfelvétel és szérumelemzés.

A végső testsúly és a táplálékfelvétel szignifikánsan csökkent a magas P csoportban a kontroll csoporthoz képest (asztal 2). Vesetömeg és ásványianyag-koncentráció.Vesea nedves és száraz tömegek szignifikánsan megnövekedtek a magas P csoportban a kontroll csoporthoz képest (asztal 3). VeseA Ca és P koncentrációk is szignifikánsan megemelkedtek a magas P-tartalmú csoportban a kontroll csoporthoz képest.

Vese Bmp2 és Spp1 mRNS expressziója.

A Bmp2 mRNS szintje a magas P csoportban szignifikánsan megemelkedett a kontroll csoporthoz képest (Ábra.1A). Az Spp1 mRNS expressziója szintén szignifikánsan megnövekedett a magas P csoportban a kontroll csoporthoz képest (Ábra. 1B).

Vita

A magas P-tartalmú étrend egyik jól ismert élettani hatása a nephrocalcinosis kialakulása. Jelen vizsgálatban a vese Ca- és P-koncentrációi megemelkedtek a magas P-csoportban a kontrollcsoporthoz képest, ami összhangban van a korábbi vizsgálatok eredményeivel1-6）. Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy a nephrocalcinosis szövettani pontszáma pozitívan korrelált a vese Ca- és P-koncentrációival4, 21）. Így, bár jelen vizsgálatban nem végeztek vese szövettani megfigyelést, a megnövekedett vese Ca- és P-koncentrációi azt jelzik, hogy a nefrokalcinózist a magas P-tartalmú étrend váltotta ki.

Mivel a magas P-tartalmú étrend által kiváltott Ca-lerakódásokat általában a hidroxiapatit egyik formájának tekintik6, 7), feltételeztük, hogy a nephrocalcinosis kialakulását az oszteo-genezishez hasonló mechanizmus szabályozza. Így megvizsgáltuk a magas P-tartalmú étrend hatásait a Bmp2 mRNS expressziójára a vesében. Az eredmények

kimutatták, hogy a vese Bmp2 mRNS expressziója megnövekedett a magas P csoportban, és hogy a magas P-tartalmú étrend a Bmp2 mRNS expressziójának felszabályozását indukálja a vesében. Ez a megállapítás segíthet a magas P-tartalmú étrend által kiváltott nephrocalcinosis kialakulásának mechanizmusában. Bár a hipotézisünket alátámasztó végleges bizonyítékok hiányoznak, az egyik lehetőség az, hogy az osteogén transzkripciós faktorok expressziója megemelkedett a vese meszesedő régióiban. A BMP2 az oszteogén transzkripciós faktorok, például az Osterix, a Runx2 és az Msx28, 9) szabályozásával oszteoblasztok differenciálódását és csontképződését idézi elő; így a BMP2 elősegítheti a nefrokalcinózist az ilyen osteogén transzkripciós faktorok szabályozásán keresztül. Jelenleg a BMP2 részletes szerepe a nephrocalcinosis kialakulásában továbbra is tisztázatlan. Ezenkívül, mivel ebben a vizsgálatban csak a Bmp2 mRNS expresszióját mérték, nem ismert, hogy van-e különbség a BMP2 fehérje expressziójában. Eredményeink azonban egy lehetséges mechanizmusra utalnak, amellyel a BMP2 expressziójának változásai jelentős szerepet játszanak a magas P-tartalmú étrend által kiváltott nephrocalcinosis patogenezisében.

Jelen tanulmány a Bmp2 mRNS expressziója mellett az Spp1 mRNS expressziójára összpontosított. Korábbi, immunhisztokémiai analízissel végzett vizsgálatunk magas OPN-expressziót mutatott magas P-tartalmú étrenddel táplált patkányok vesetubulusaiban12）. A jelen tanulmány azt találta, hogy az Spp1 mRNS expressziója körülbelül 10--szeresére nőtt a magas P csoportban. A jelenlegi és korábbi vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a magas P-tartalmú étrend OPN expressziót vált ki a vesében. Másrészt más kutatók kimutatták, hogy az OPN mint kőmátrix fontos tényező a húgykövek képződésében22, 23）; így korábbi jelentésünk azt sugallta, hogy az OPN mátrixkomponensként szerepet játszhat a magas P-tartalmú étrend által kiváltott Ca-lerakódások kialakulásában12）. Azonban Paloian et al. nemrégiben arról számoltak be, hogy az OPN szerepet játszik a magas P-tartalmú étrend által kiváltott nephrocalcinosis megelőzésében OPN KO egerekben24). Nevezetesen úgy tűnik, hogy az OPN fiziológiai szerepe a magas P-tartalmú diéta által kiváltott nephrocalcinosisban a meszesedés elnyomása, nem pedig elősegítése avese. Ezenkívül korábbi jelentések szerint az OPN szintje megemelkedik, hogy ellensúlyozza a további kóros méhen kívüli meszesedést.veseés az érrendszer, mivel az OPN felszabályozott a patológiás meszesedés helyén.

Amint fentebb említettük, a jelen tanulmány a BMP2 és az OPN fontosságát sugallta a magas P diéta által kiváltott nephrocalcinosisban. Figyelemre méltó, hogy a BMP2 és az OPN nephrocalcinosis kialakulására gyakorolt ​​hatásait különböző mechanizmusok szabályozzák. Ezek a mechanikai különbségek arra utalhatnak, hogy a nephrocalcinosis mögött meghúzódó mechanizmus bonyolult. A következő szempont az, hogy a növekedés gátlása befolyásolhatta a Bmp2 és az Spp1 mRNS expresszióját avesemert a jelen tanulmány a végső testtömeg csökkenését figyelte meg egy magas P csoportban. Korábbi12) és jelenlegi tanulmányaink megfigyelései segíthetnek ennek megértésében. Korábban megnövekedett OPN fehérje expresszióról számoltunk be olyan patkányok vesetubulusaiban, amelyek növekedése

nem gátolta a magas P-tartalmú étrend12). Ezenkívül a jelen vizsgálat növekedésgátlást mutatott a magas P-csoportban, de magas szintű Spp1 mRNS expressziót a vesében. Ezen megfigyelések alapján úgy tűnik, hogy jelen tanulmánynak csekély hatása van a Bmp2 és Spp1 mRNS expressziójának növekedési gátlására. A növekedésgátlás, valamint a Bmp2 és Spp1 génexpresszió közötti kapcsolat részletei azonban továbbra is tisztázatlanok. Ezért ennek tisztázásához további vizsgálatokra van szükség.

Összefoglalva, a magas P-tartalmú diéta által kiváltott nephrocalcinosis kialakulásának mechanizmusának tisztázása érdekében a jelen tanulmány meghatározta a magas P-tartalmú étrend hatásait a Bmp2 és Spp1 mRNS expressziójáravese. A vese Ca és P koncentrációja szignifikánsan megemelkedett a magas P csoportban a kontroll csoporthoz képest. Továbbá a Bmp2 és Spp1 mRNS expressziója szignifikánsan megnövekedett a magas P csoportban a kontroll csoporthoz képest. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a magas P-tartalmú diéta elősegíti a Bmp2 és Spp1 mRNS expressziójának felszabályozásátvese.

Hivatkozások

1) Hitchman AJ, van bármilyen SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: Foszfát által kiváltott vese meszesedés patkányban. Can J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

2) Parker HE: A magnézium és a foszfor kölcsönhatása a túlzott étrendi foszforszint mellett. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

3) Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: Foszfor-indukált nephrocalcinosis és veseműködés nőstény patkányokban. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

4) Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: Az étrendi kalcium és foszfor koncentrációja és aránya befolyásolja a nephrocalcinosis kialakulását nőstény patkányokban. J Nutr 132: 252-256, 2002

5) Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K: Az étrendi kalcium-kiegészítés hatása a csontanyagcserére, a vese ásványianyag-koncentrációjára és a veseműködésre magas foszfortartalmú táplálékkal etetett patkányoknál. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

6) Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu QL, Sato S, Kanke Y, Goto S: A magas foszfortartalmú étrend gyorsan nefrokalcinózist és proximális tubuláris sérülést okoz patkányokban. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu QL, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: A hagyományos kínai orvoslás hatékonysága, Wulingsan, a magas foszfortartalmú étrend által kiváltott nephrocalcinosis kialakulásának visszaszorításában fiatal patkányokban. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

8） Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: Az egérsejtek célzott megzavarása feltárja a Smad4 változó követelményeit a növekedési faktorral kapcsolatos jelátvitelben. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

9） Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: A BMP2 szabályozza az Osterixet az Msx2-n és Runx2-n keresztül az oszteoblasztok differenciálódása során. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10) Urista MR: Csont: Autoindukcióval képződés. Science 150: 893-899, 1965

11) Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: A csontképződés új szabályzói: Molekuláris klónok és tevékenységek. Science 242: 1528-1534, 1988

12) Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: magas foszfortartalmú étrend indukálja a vesetubulusok oszteopontin expresszióját patkányokban. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

13） Cousins ​​FB, Geary CPM: Nemtől meghatározott vese meszesedés patkányokban. Nature 211: 980-981, 1966

14） Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: Nemek közötti különbségek a vese ásványianyag-koncentrációjában és a vizelet albumin kiválasztásában magas foszfortartalmú takarmányt kapó patkányokban. Biosci Biotechnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

16 . J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16) Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: Kalcium és magnézium meghatározása szérumban, vizeletben, étrendben és székletben atomabszorpciós spektrofotometriával. Clin Chem 13: 204-214, 1967

17）Gomori G: A kolorimetriás foszformeghatározás módosítása a fotoelektromos koloriméterrel való használatra. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: A prenilcsoport hozzájárul a fitoösztrogén 8-prenynaringenin aktivitásához a csontképződés fokozásában és a csontreszorpció gátlása in vitro. Endokrinológia 154: 1202-1214, 2013

19) Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: A folyadékáramlás időfüggő módon stimulálja az osteopontin és a csont szialoprotein expresszióját a csontvelő stromasejtekben. Bone 36: 1047-1055, 2005

20) Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: A patkány onkosztatin M receptor komplex jellemzése, amely hasonlít az emberre, de különbözik az egér citokin receptorától. PLoS One 7: e43155, 2012

21) Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: Az étrendi kalcium: foszfor arány hatása az ásványi anyagok kiválasztására és a nefrokalcinózisra nőstény patkányokban. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: Az oszteopontinnal azonos húgykőfehérjét kódoló cDNS molekuláris klónozása és szekvenálása. Biochem Biophys Res Commun 184: 859-864, 1992

23) Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: A húgykő fehérjét (Osteopontin) kódoló mRNS szerkezete és expressziója. J Biol Chem 268: 15180-15184, 1993

24) Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Az Osteopontin védekezik a magas foszfát által kiváltott nephrocalcinosis és az erek meszesedése ellen. Kidney Int 89: 1027-1036, 2016

25) Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: Az osteopontin szintje megemelkedik a patkány artériákban a neointima kialakulása során, és az emberi ateroszklerotikus plakkok új komponense. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993