Hogyan játszanak neuroprotektív szerepet a fenil-etanol-glikozidok, a Cistanche hatóanyaga?
Feb 27, 2022
Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baid, Chunhong Zhanga
ABSZTRAKTEbben a tanulmányban nyolcat különítettünk elfeniletanoidglikozidoka Paraboea martini-ből először, és értékelték a mögöttes mechanizmustneuroprotektívhatásokPC12 sejtekben a H2O2- által kiváltott sérülések ellen. Az MTS módszert alkalmaztuk a szűrésrefeniletanoidglikozidokvédőképességért. Ezután qRT-PCR és Western blotting analízist alkalmaztunk a HO-1 és a GCLC transzkripciós szintjének kimutatására, amelyeket az Nrf2 szabályoz. A ZnPP inhibitort használtuk a Nrf2 HO-1 expresszióban való részvételének elemzésére. Az elemzések kimutatták, hogy a kaleolariozid B, parabozid B és parabozid II szintén fokozta a HO-1 expresszióját, de nem mutattak nyilvánvaló hatást a GCLC-re. A ZnPP-vel végzett előkezelés jelentősen csökkentette aneuroprotektívhatások. Így a P. martini-ből izolált fenil-etanol-glikozidok megvédték a PC12 sejteket a H2O2-indukált károsodástól a HO-1 fokozásával. Az eredmények bizonyítékot szolgáltattak arra vonatkozóan, hogy a P. martini potenciális terápiás szer lehet a betegség kezeléséreneurodegeneratívbetegségek.
CIKKTÖRTÉNETÉrkezett 2019. április 8. Elfogadás: 2019. július 30
KULCSSZAVAKParaboea martini;feniletanoid glikozidok; neuroprotektív hatások; cink protoporfirin; HO-1
Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Az oxidatív stresszről ismert, hogy számos betegség patogenezisében alapvető szerepet játszik. Az etiológiához kapcsolódikAlzheimer kór(AD), Parkinson-kór (PD), epilepszia és más betegségek [1–3]. Jelenleg folyamatos előrelépés történt az AD, PD és más betegségek patogenezisének tanulmányozásában. Az AD, PD és más betegségek hátterében álló molekuláris mechanizmusok korlátozott ismerete miatt azonban ezekre a betegségekre nem valósítottak meg hatékony megelőző vagy gyógyító stratégiákat [4]. A H2O2 a reaktív oxigénfajták (ROS) fontos összetevője. Ennek megfelelően a H2O2-indukált PC12 sejtsérülés az oxidatív stressz leggyakrabban használt modellje, és széles körben használják a neuroprotektív hatások kísérleti vizsgálataiban [5]. A hem-oxigenáz 1 (HO-1) és a glutamát-cisztein-ligáz-katalitikus alegység (GCLC) fontos celluláris antioxidáns enzimek, és mindkét gén a nukleáris faktor eritroid 2-től (Nrf2) lefelé szabályozódik, amely ígéretes terápiás szerként jelenik meg. neuroprotekció célpontja [6,7].Fenil-etanolglikozidok, amely a C-6-C-3 egységből származik, sok fenolos hidroxilcsoportot tartalmaz, és jelentős antioxidáns és öregedésgátló hatással bír. Az elmúlt néhány évben a vizsgálatok kimutatták, hogy sok gyógynövény tartalmaz fenil-etanol-glikozidokat, amelyek jelentős antioxidáns hatást mutatnak. Például a Herba cistanche-ból származó fenil-etanol-glikozidokról ismert, hogy védő hatást fejtenek ki az AD kognitív hiányosságaira. Ez a tanulmány a kapcsolódó védőmechanizmust egy AD öregedéssel gyorsított hajlamos egér 8 (SAMP8) modell segítségével vizsgálta. Az eredmények azt mutatták, hogy a fenil-etanoid-glikozidok azon képessége, hogy enyhítsék a SAMP8 egerek kognitív hiányosságait, összefügghet a szinaptikus plaszticitás elősegítésével, amely antioxidáns folyamatokat is magában foglal [8]. Ebben a vizsgálatban két fenil-etanol-glikozidot választottak el és tisztítottak meg a Tectona grandis (teak) fa csomóiból; ezek a vegyületek jelentős antioxidáns hatást mutattak, amelyeket amperometriás módszerrel határoztak meg [9]. Ezenkívül a Lindernia ruellioides-ból származó koffeoil-fenil-etanoid-glikozid-vegyületek dózisfüggő antioxidáns és szuperoxid-anion-szabadgyök-fogó hatást fejtenek ki in vitro [10]. A fenil-etanoid glikozidok hatásmechanizmusa az Nrf2/ARE jelátviteli útvonal szabályozásával függ össze, amely befolyásolja a SOD, CAT, GSH-PX és más antioxidáns enzimek szintézisét [11]. A Gesneriaceae család, amely 150 nemzetséget és körülbelül 3700 fajt tartalmaz, elsősorban Kelet- és Dél-Ázsia, Óceánia, Dél-Amerika, Afrika, Dél-Európa és Mexikó trópusi és mérsékelt övi vidékein terjedt el [12]. Kínában 54 nemzetség és körülbelül 463 faj tartozik a Gesneriaceae-hoz. Beszámoltak arról, hogy körülbelül 100 faj rendelkezik gyógyászati hatékonysággal, és ezek többsége főként Guangxi és Guizhou tartományokban van elterjedve [13]. Az elmúlt években a Gesneriaceae növényekkel kapcsolatos kutatások fokozatosan bővültek a világ különböző területein, és néhány új, fiziológiai aktivitással rendelkező összetevőt találtak [14]. A Paraboea martinii (Levl.) Burtt a parabolafélékhez (Gesneriaceae) tartozik, és lágyszárú növény. A "The Chinese Traditional Medicine Resource Records" alapján feljegyezték, hogy az egész növényt gyógyszerként használják. Ezenkívül számos farmakológiai hatást fejthet ki olyan állapotok esetén, mint a vérömleny, ödéma, vérhas, traumás sérülés és törés [15]. Bai ezt bizonyítottafeniletanoidglikozidoka Gesneriaceae növények egyik fő kémiai összetevője [16]. Egyes kutatók azt is megállapítottákfeniletanoidglikozidokhave significant antioxidant activities [17]. Li demonstrated that phenylethanoid glycosides of Cistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>Nyolc fenilpropanoid-glikozid 98%-át HPLC csúcsterület-normalizációs módszerrel mértük. Példaként a parabozid B és parabozid II kromatográfiás diagramja látható az 1. ábrán, és relatív tartalmuk 98,23%, illetve 99,20% volt. A rosszul differenciált patkány mellékvese feokromocitóma sejtvonalat (PC12) a Kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína) Sejtbankjától vásároltuk. A Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajt (DMEM) és a lószérumot a Gibco-tól (Gaithersburg, MD, USA) vásároltuk. A magzati szarvasmarha-szérumot (FBS) a Thermo Fisher Scientific-től (Hyclone, Waltham, MA, USA) vásároltuk. A H2O2-t a Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd.-től (Tianjin, Kína) szereztük be. A Trizolt az Invitrogentől (Carlsbad, CA, USA) vásároltuk. A PrimeScriptTM RT reagenskészletet (Perfect Real Time) a TaKaRa Biotechnology Co.-tól (Dalian, Kína) szereztük be. A HO-1, a GCLC és a GAPDH alapozóit a Sangon Biotech (Sanghaj, Kína) szintetizálta. A CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay készletet (MTS) a Promega Corp.-tól (Madison, USA) szereztük be. A HO-1 cink-protoporfirin (ZnPP) inhibitorait a Sigma Chemical Co.-tól (St. Louis, MO, USA) vásároltuk. Egy Thermo311 CO2 inkubátort (Thermo, USA), StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument Thermal Cycling Blockot (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC-t (Thermo) és xCELLigence RTCA DPlus Analyzert és E-Plate 16-ot (ACEA Biosciences, USA) is használtak. .
Sejttenyésztés és kezelés
A PC12 sejteket 5% FBS-t és 5% lószérumot tartalmazó DMEM-ben tenyésztettük 37 °C-on, párásított 5% CO2-atmoszférában. A PC12 sejteket három csoportra osztották az alábbiak szerint: egy kontrollcsoport, egy modellcsoport és egy kezelési csoport. Nyolc fenilpropanoid glikozidot oldottunk fel DMSO-ban (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">
H2O2 meghatározása
modell, Valós idejű celluláris analízis (RTCA) segítségével határoztuk meg a H2 O2 megfelelő koncentrációját. A PC12 sejteket CIM-plate{5}} mikrolemezre oltottuk 100 µl térfogatban, majd 12 órán át 37 fokon inkubáltuk 5 százalékos CO2 atmoszférában. A PC12 sejteket kontroll- és modellcsoportokra osztottuk. Ezt követően 10 μL H2O2-t (50, 100, 200 és 400 μM) adtunk a modellcsoportokhoz, és a kontrollcsoportokat 10 µl komplett DMEM-mel kezeltük, három komplex lyukban elhelyezve. Az E-Plate 16-ot az xCELLigence RTCA-ba helyeztük, 15 percenként ellenőriztük, és az eredményeket 32 órán keresztül rögzítettük. A H2O2 PC12 sejtekre gyakorolt hatását az xCELLigence RTCA adatelemző szoftverrel elemeztük. A sejtindex (CI) értéket használtuk az optimális H2O2 koncentráció és hatástartam meghatározására.
Vegyület extrakciója és izolálása
A frakciókat polaritásuk alapján választottuk szét a korábban leírt módszerekkel. A levegőn szárított, porított P. martinii-t (4 kg) egymást követően háromszor extraháltuk 75%-os vizes etanolos oldattal [20]. A kapott extraktumokat ezután rotációs bepárlóban bepároljuk az etanol eltávolítása céljából, és nyers extraktumokat kapunk. A mintákat ionmentes vízben oldottuk, majd egymást követően petroléterrel, etil-acetáttal, n-butanollal és vízzel extraháltuk. Az n-butanol-kivonatot (400 g) AB-8 makropórusos gyanta oszlop és etanol-H2O2 oldat (0, 1{{47}) segítségével frakcionáltuk. }, 30, 50, 70 és 95 százalék). Végül hat frakciót (1-6. frakció) kaptunk. A 3. és 4. frakciót egy MCI oszlopon választottuk szét MeOH-H2O2 fokozatos gradienssel (10-100%). Ezután a termékeket Sephadex LH-20 alkalmazásával izoláltuk, eluensként 50% metanolt. Az 1. (41,0 mg) és a 6 (15,6 mg) vegyületet a 3. frakcióból izoláltuk. A 2. (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) és 8 (26,0 mg) vegyületet a 4. frakcióból kaptuk Sephadex alkalmazásával. LH-20 kromatográfia 50% MeOH-val eluensként. A végső izolálást félpreparatív, fordított fázisú HPLC-vel (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) végeztük 50 százalékos MeOH-val és UV-detektálással 280 nm-en, így a 4. számú vegyületet kaptuk. (39,0 mg) és 5 (9,0 mg) [20].
Sejtéletképességi vizsgálat
A PC12 sejteket 96-lyuklemezekre oltottuk 2 × 1{{10}}4 sejt/lyuk sűrűséggel, 100 µl végtérfogat mellett. . A PC12 sejteket 37 °C-on 5% CO2-vel 12 órán át inkubáltuk. Ezt követően a sejteket különböző koncentrációjú nyers kivonatokkal (0,025, 0,05, 0,1, 0,2 és 0,4 mg/ml) és az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. és vegyülettel kezeltük. 8, öt koncentrációban (3,125, 6,25, 12,5, 25 és 50 μM). 24 órás előkezelés után a sejtek életképességét MTS-vizsgálatokkal határoztuk meg. A PC12 sejteket HO-1 inhibitorral vagy anélkül ZnPP nélkül (15 μM) 30 percig előinkubáltuk, majd caleolarioside B-vel, parabozid B-vel és parabozid II-vel (3,125 μM) vagy anélkül 12 órán át, végül inkubáltuk. 400 μM H2O2-vel további 6 órán át. A kezelés után a túlélő sejtek számát MTS vizsgálattal határoztuk meg [6].
Nyers kivonatok és monomer vegyületek védő hatása H2O2-kezelt PC12 sejtekre
A sejteket egy {{0}}lyukú lemezen tenyésztettük 100 µL végső térfogattal. A nyers kivonatok sorozathígításait (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 és 0,4 mg/ml) hozzáadtuk a kezelt csoporthoz. 12 órás előkezelés után 400 μM H2O2 oldatot (optimális koncentráció) adtunk a kezelt csoporthoz és mindegyik lyuk H2O2 csoportjához 6 órára. Ezután mindegyik lyukba MTS-oldatot adtunk, és a lemezeket 3 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A lemezeket alacsony sebességgel oszcilláltuk 5 percig szobahőmérsékleten, amíg az összes kristály teljesen fel nem oldódott. A sejtvédelmet az MTS vizsgálati eredmények alapján határoztuk meg a gyártó 2204 X. GONG ET AL szerint. A vendég 2021. augusztus 27-én letöltötte a https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 oldalról. Az optikai sűrűséget 490 nm abszorbancia hullámhosszon határoztuk meg. Tovább követtük a 3. és 4. frakcióból izolált 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. és 8. vegyületek aktivitását. Az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. és 8. vegyületek sorozathígításai (3,125, 6,25, 12,5, 25 és 50 μM) adtunk a kezelt csoporthoz, hogy meghatározzuk a megfelelő védőhatásukat a H2O{57}}indukált PC12 sejtekre.
Kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR)
A PC12 sejteket 12 órával gyűjtöttük össze a 3,125 μM caleolarioside B-vel, paraboside B-vel és paraboside II-vel végzett kezelés után. A teljes RNS-t TRIzol-reagenssel extraháltuk, és a teljes RNS alikvotjait Primescript RT Master Kit segítségével fordítottuk át a gyártó utasításai szerint. A következő primereket alkalmaztuk a kísérletekhez egy korábbi jelentésnek megfelelően [21]. HO-1: előre 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, hátrafelé 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: előre 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, hátrafelé 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: előre 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, hátrafelé 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. A kapott cDNS-ek alikvotjait ezután PCR-rel amplifikáltuk. A reakciókörülmények a következők voltak: kezdeti denaturálás 95 fokon (30 s), majd 40 ciklus 95 fokon (5 s), 60 fokon (34 s) és 72 fokon (35 s). Minden primert teszteltünk, és az FL fluoreszcens jelet detektáltuk; majd kiszámítottuk a △Ct értéket, és a relatív értékeket összehasonlítottuk a kontrollcsoportéval a következő egyenlet segítségével: △Ct=Ct (minta) − Ct (endogén kontroll), △△Ct {{36} } △Ct (minta) −△Ct (kezeletlen), és hajtásváltozás=2−△△Ct. Belső kontrollként gliceraldehid{38}}foszfát-dehidrogenázt (GAPDH) használtunk.
Fehérje kivonás
A PC12 sejteket 100- mm-es edényekre oltottuk 1 × 107 sejt/tál mennyiségben. A kötődés után a sejteket rendre caleolarioside B-vel, paraboside B-vel és parabozid II-vel (3,125 µM) kezeltük 12 órán át. A glikozidokat ezután eltávolítottuk, és a sejteket további 6 órán át H2O2-vel inkubáltuk. Inkubálás után a sejteket kétszer mostuk hideg PBS-sel, és 1 ml PBS-sel lekapartuk az edényekről. A sejthomogenizátumokat 1500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 10 percig. A kezelés után a sejtfehérjéket 1 mM PMSF-et tartalmazó Beyotime RIPA sejtlízis pufferrel extraháltuk a gyártó utasításai szerint. Ezenkívül citoplazmatikus és nukleáris fehérjéket izoláltunk a Beyotime nukleáris és citoplazmatikus extrakciós kit protokolljában leírtak szerint. A minták fehérjekoncentrációját Beyotime BCA protein assay kit segítségével határoztuk meg, és az összes mintát –80 fokon tároltuk Western blot analízishez [6].
Western blot analízis
Az SDS-PAGE elektroforézist a különböző csoportokból származó összes fehérje extrakciója és ezt követő denaturálása után végeztük. Elektroforézis után a fehérjét PVDF membránokra vittük át, amelyeket ezután 5 százalékos sovány tejporral blokkoltunk 4 órán át. Mosás után primer antitest (nyúl poliklonális antitest GAPDH (1:10,{5}} hígítás), nyúl poliklonális antitest HO-1 (1:1000 hígítás) vagy nyúl poliklonális antitest GCLC (1:1000 hígítás) A membránokhoz egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk, másnap a PVDF membránokat háromszor mostuk TTBS-ben, majd tormával jelölt másodlagos antitestet (konjugált affinitású tiszta kecske anti-nyúl IgG (1:1000 hígítás)) peroxidázt adtunk a membránokhoz, majd szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáltuk A PVDF membránokat mostuk és ECL kemilumineszcenciás detektáló reagensnek vetettük alá a röntgenfilmen történő expozíció jelzésére, amelyet ezután rögzítettek és szkenneltek [22].
Statisztikai analízis
Az adatokat SPSS 19.{1}} segítségével elemeztük, és az eredményeket három független kísérlet standard deviációjának (SD) átlagaként mutatjuk be. A p < 0,05="" értékeket="" statisztikailag="" szignifikáns="" különbségeknek="">
Eredmények H2O2 modell felállítása
A 2. ábrán látható módon a H2O2 50, 100 és 200 µM-os koncentrációban nem okozza a megfelelő szintű sejthalált. 400 μM H2O2 azonban 2–6 órán belül hatott a PC12 sejtekre, és a sejtek oxidatív károsodása általában stabil volt. Ezért úgy gondoltuk, hogy a H2O2-val 400 μM koncentrációban 6 órán keresztül történő indukció megfelelő a PC12 sejtek oxidatív stressz által kiváltott károsodásának imitálására.
Nyers kivonatok védő hatása H2O2-vel kezelt PC12 sejtekre
A H2O2 modellcsoporthoz képest (3. ábra) n-butanol kivonat 0.05, 0.1, {{10} koncentrációban. },2 és 0,4 mg/mL koncentrációfüggő módon szignifikánsan javította a H2O2 által kiváltott PC12 sejtek oxidatív károsodását (p < 0.05).="" ezek="" az="" adatok="" arra="" utalnak,="" hogy="" az="" n-butanol-frakció="" erősebb="" védőaktivitást="" tartalmaz.="" a="" petroléteres="" és="" etil-acetátos="" kivonatok="" azonban="" csak="" nagy="" koncentrációban="" mutattak="" védőhatást="" (petroléter:="" 0,1="" és="" 0,2="" mg/ml,="" p="">< 0).{31}="" }5;="" etil-acetát:="" 0,2="" és="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" ezenkívül="" a="" vizes="" fázisú="" kivonatok="" különböző="" koncentrációi="" nem="" mutattak="" védőhatást="" (p=""> 0,05). Ezenkívül hozzáadtuk az SH-SY5Y humán neuroblasztóma sejtvonalakat (SH-SY5Y) végzett validációs vizsgálat adatait a kiegészítő fájlhoz. A 250 μM H2O2-val végzett kezelés csökkent sejtek életképességét eredményezte; azonban a kaleolariozid B, parabosid B és paraboside II (3,125, 6,25, 12,5, 25 és 50 μM) kezelés jelentősen csökkentette az SH-SY5Y sejthalált. A kísérleti eredmények bebizonyították, hogy a kaleolariozid B, parabozid B és parabozid II megvédte az SHSY5Y sejteket a H2O{52}}indukált sejtkárosodástól.
Az n-butanol frakcióból izolált vegyületek szerkezete
Annak igazolására, hogy az n-butanol kivonat tartalmazott aktív komponenseket, további nyolc vegyületet frakcionáltunk az extrakcióból. Az 1-es, 2-es, 3-as, 4-es, 5-ös, 6-os, 7-es és 8-as vegyületek szerkezetét különböző spektrális adatok (1H-NMR, 13C-NMR és ESI-MS) alapján azonosították a parabozid A-ra vonatkozó publikált adatokkal való összehasonlítás alapján. , parabozid B, parabozid I, parabozid II, parabozid III, nuomiozid A, kaleolariozid B és izonuomiozid A [20]. Például a parabozid B adatai a következők voltak: barna gumi; ½ 20 D -55,7 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (loge): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm-1: 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm-1 [20] 1H és 13C NMR spektroszkópiai részletes adatok a 20. hivatkozásban; HR-ESI-MS (negatív) m/z 741,2231 [MH]− (C33H41O19-re számítva 741,2242) [20]. A parabozid II adatai a következők voltak: fehér amorphus porok; ½ 20 D -80,5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (loge): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr max cm-1: 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm-1 [20]; 1H és 13C NMR spektroszkópiai részletes adatok a 20. hivatkozásban; ESI-MS (negatív) m/z 637
Izolált vegyületek védő hatása a H2O{1}}indukált toxicitás ellen PC12 sejtekben
Az izolált vegyületek H2O2- által kiváltott toxicitásnak kitett PC12 sejtek életképességére gyakorolt hatásának vizsgálatára MTS vizsgálatokat használtunk. Amint az 5. ábrán látható, a kontrollcsoporthoz képest a PC12 sejtek öt különböző koncentrációjú kaleolariozid B-vel, parabozid B-vel, parabozid II-vel vagy parabozid A-val előkezeltek (3,125, 6,25, 12,5, 25 és 5)0 μM) 24 órán keresztül nem mutatott szignifikáns különbséget a sejtek életképességében (p > 0,05). Így a PC12 sejtek caleolarioside B-vel, paraboside B-vel és paraboside II-vel végzett előkezelése nem eredményezett citotoxicitást. A 6. ábrán látható módon a 400 µM H2O2 szignifikánsan csökkentette a sejtek életképességét a kontrollcsoporthoz képest. Ezenkívül a H2O2--val kezelt PC12 sejtek sejtéletképessége jelentősen megnőtt a PC12 sejtek különböző koncentrációjú kaleolariozit B-vel, parabozid B-vel és parabozid II-vel történő előkezelését követően; továbbá a sejtek életképessége 50 µM kaleolariozid B-vel, 50 µM parabozid B-vel és 12,5 µM parabosid II-vel végzett kezelés után volt a legmagasabb. A másik öt vegyület nem mutatott jelentős védőhatást a H2O{30}}kezelt PC12-sejteken. Ennek szemléltetésére ezek közül az egyiket példaként tárgyaljuk, míg a többit a kézirat nem írja le.
A HO-1 és a GCLC átírási szintjei
Ezután a HO-1 és a GCLC transzkripciós szintjét teszteltük caleolarioside B-vel, parabozid B-vel és parabozid II-vel kezelt PC12 sejtekben. A teljes mRNS-t a kezelt és a kezeletlen PC12 sejtekből 12 órán át gyűjtöttük, majd qRT-PCR-rel expressziós elemzésnek vetettük alá. Ahogy a 7(a,c,e) ábrán látható, a HO-1 transzkripciós szintjei jelentősen megnőttek
A PC12 sejteket 12 órán keresztül előkezeltük a megadott koncentrációjú kaleolariozid B-vel, parabozid-B-vel és parabozid-II-vel (p < 0.{{10}}5).="" amint="" a="" 7(b)="" ábrán="" látható,="" a="" gclc="" transzkripciós="" szintjei="" is="" szignifikánsan="" megemelkedtek="" azokban="" a="" pc12="" sejtekben,="" amelyeket="" 12="" órán="" át="" a="" megadott="" koncentrációjú="" kaleolariozid="" b-vel="" előkezeltek.="" azonban="" a="" 12="" órán="" keresztül="" parabozid="" b-vel="" előkezelt="" pc12="" sejtekben="" a="" gclc="" szintje="" szignifikánsan="" csökkent="" a="" modellcsoporthoz="" képest="" (p="">< 0,05;="" 7(d)="" ábra).="" ezenkívül="" a="" parabozid="" ii="" kezeléssel="" a="" pc12="" sejtekben="" a="" gclc="" szintje="" nem="" különbözött="" szignifikánsan="" a="" modellcsoportban="" mért="" szintektől="" (p=""> 0,05; 7(f) ábra).
A HO-1 és a GCLC kifejezése
A HO{{0}} és a GCLC fontos celluláris antioxidáns enzimek, és mindkettő Nrf2-szabályozott downstream gének. A kezelést követően a HO-1 és a GCLC fehérje expresszióját is megfigyelték [6]. A 8. ábra a HO-1 és a GCLC fehérjeszintjét mutatja PC12 sejtekben 400 μM H2O2-val történő kezelés után; az eredmények azt mutatták, hogy a HO-1 FL fluoreszcens intenzitása a kaleolariozit B és parabozid B csoportokban nagyobb volt, mint a H2O2- kezelt csoportokban (8(a, c) ábra). A GCLC expresszióját azonban a vegyületek nem változtatták meg szignifikánsan, kivéve a kaleolariozid B-t (8(b) ábra). Ezt követően a HO-1 kémiai inhibitorait alkalmazták az antioxidáns enzimek szerepének további értékelésére a kaleolariozid B, parabozid B vagy parabozid II által kifejtett védőhatások szabályozásában a H2O2-indukált citotoxicitás ellen. A kaleolariozid B, parabozid B és parabozid II (3,125 µM) megakadályozta a H2O2- által kiváltott citotoxicitást, de ezeket a védőhatásokat a HO-1 inhibitor ZnPP (p < 0,01)="" megfordította="" 15="" µm-nál="" (8.="" ábra).="">
Vita
A népesség elöregedése súlyos globális probléma. Sok betegség a szenilitáshoz kapcsolódik, mint például az AD és a PD, amelyek komoly veszélyt jelentenek a közegészségügyre. Az AD és a PD a harmadik leghalálosabb betegségnek számítanak világszerte a szív- és érrendszeri betegségek és a rák után. Ezért a neurodegeneráció világszerte sürgető kutatási témává vált. Az AD és a PD, a központi idegrendszer neurodegeneratív betegségeinek patogenezise azonban a mai napig tisztázatlan. Ezen túlmenően, összetett patogén mechanizmusuk miatt csak néhány gyógyszer képes hatékonyan kezelni az AD-t vagy a PD-t [23]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a ROS, például a szuperoxid anion (O2−) és a H2O2 a fő tényezők, amelyek hozzájárulnak a neurodegeneratív betegségekhez. A PD során fellépő kóros elváltozások közé tartozik az idegsejtek degenerációja, valamint a substantia nigra és a striatális dopamin halála [24,25]. Ennek megfelelően fontos hatékony antioxidáns gyógyszerek kifejlesztése a PD kezelésére, és az ilyen gyógyszerkutatás fontos kutatási irányvonal lett [26]. Jelenleg az Nrf2/ARE jelátviteli útvonal tűnik a legfontosabb endogén antioxidáns stresszútvonalnak [27]. Az ARE-k a gének 5′-flanking régióiban találhatók, mint például a HO-1 és a GCLC [28,29]. A HO-1 és a GCLC Nrf{15}}rokon gének, amelyek ettől a fehérjétől lefelé szabályozódnak [6]. Az ARE-k ezt követően befolyásolhatják az antioxidánsok szintjét, és aktiválhatják a HO-1 és más védőgének downstream expresszióját, ami fokozhatja a sejtvédő aktivitást [30,31]. Ezen túlmenően az eredmények azt sugallják, hogy a resveratrol védő hatása az A 1-42- által kiváltott toxicitás ellen a PC12 sejtekben a HO-1 expressziójának az Nrf2 intracelluláris jelátviteli útvonal aktiválása révén történő fokozásán keresztül jelentkezik [32].
A PC12 sejtek az idegsejtek elfogadott modelljei, és széles körben használják neuroprotektív hatásvizsgálatokban [33]. A H2O2 könnyen átjut a sejtmembránon, és a vassal kombinálva rendkívül aktív szabad gyököket képez, amelyek oxidatív stresszt és sejtkárosodást okoznak [34]. A H2O2 fontos ROS, a szabad gyökök könnyen keletkeznek és viszonylag stabilak, ezért általában PC12 sejtek felhasználásával oxidatív stressz modell felállítására használják [5]. Ebben a vizsgálatban a PC12 sejtek előkezelése nem toxikus koncentrációjú növényi kivonattal megvédte a sejteket a H2O2- citotoxicitástól azáltal, hogy csökkentette a ROS képződését. A fenil-etanoid-glikozidok számos fenolos hidroxilcsoportot tartalmaznak, amelyek antioxidáns és öregedésgátló hatással rendelkeznek. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy az n-butanol extrakció jobb védelmet eredményez, mint a többi polaritású frakció (3. ábra). Így tovább szűrtük az n-butanol frakcióból izolált nyolc vegyület védőaktivitását. Az eredmények először mutatták meg, hogy 8. ábra: HO-1 és GCLC fehérjeszintek elemzése PC12 sejteken. (a) Betöltési kontrollként a HO-1 és a GCLC és a GAPDH expressziójának Western-blot analízisét alkalmaztuk. (b) Western blot analízis GCLC fehérje expressziója. (c) Western blot analízis HO{{20}} fehérje expressziója. (d) A HO-1 gátló ZnPP csökkentette a neuroprotektív hatást. Az adatok átlag ± SD, n=3. ***p < 0.001="" kontra="" kontrollcsoport;="" #p="">< 0.05="" a="" h2o2="" csoporttal="" szemben="" (znpp="" nélkül),="" ##p="">< 0,01="" a="" h2o2="" csoporttal="" szemben="" (znpp="" kezelés="" nélkül),="" ###p="">< 0,001="" a="" h2o2="" csoporttal="" szemben="" (znpp="" nélkül)="" kezelt);="" és="" p="">< 0,01,="" szemben="" a="" h2o2="" csoporttal="" (znpp-vel="" kezelt),="" és="" &p="">< 0,001,="" szemben="" a="" h2o2="" csoporttal="" (znpp-vel="" kezelt).="" (kontrollcsoport;="" modellcsoport:="" h2o2;="" znpp="" negatív="" csoport:="" kaleolariozid="" b="" plusz="" h2o2,="" parabozid="" b="" plusz="" h2o2,="" parabozid="" ii="" plusz="" h2o2;="" znpp="" pozitív="" csoport:="" znpp="" plusz="" kaleolariozid="" b="" plusz="" h2o2,="" znpp="" plusz="" parabosid="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" paraboside="" ii="" plusz="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" egy="" vendég="" által="" 2021.="" augusztus="" 27-én="" letöltött="" kaleolariozit="" b,="" parabozid="" b="" és="" parabozid="" ii="" jelentős="" védőhatással="" bír="" a="" h2o2-="" által="" kiváltott="" oxidatív="" károsodás="" ellen="" a="" pc12="" sejtekben.="" az="" eredmények="" azt="" is="" jelezték,="" hogy="" a="" h2o2="" kezelés="" jelentős="" pc12="" sejtkárosodást="" és="" csökkent="" sejtek="" életképességét="" idézte="" elő,="" míg="" a="" kaleolariozid="" b,="" parabosid="" b="" és="" paraboside="" ii="" kezelés="" jelentősen="" mérsékelte="" ezeket="" a="" hatásokat="" (6.="" ábra).="" egy="" korábbi="" tanulmány="" arról="" számolt="" be,="" hogy="" a="" nrf2/are="" útvonal="" az="" egyik="" legfontosabb="" endogén="" antioxidáns="" útvonal,="" és="" a="" sejtek="" védelme="" érdekében="" képes="" felszabályozni="" a="" downstream="" markerek,="" például="" a="" ho-1="" expresszióját="" [7].="" a="" qrt-pcr="" és="" western="" blot="" analízis="" eredményei="" azt="" mutatták,="" hogy="" a="" kaleolariozid="" b,="" parabozid="" b="" és="" parabozid="" ii="" szignifikánsan="" megnövelte="" a="" ho-1="" szintjét.="" a="" gclc="" transzkripciós="" szintje="" azonban="" szignifikánsan="" megemelkedett="" a="" kaleolariozid="" b-vel="" előkezelt="" pc12="" sejtekben,="" de="" csökkent="" a="" parabozid="" b-vel="" előkezelt="" sejtekben,="" mint="" a="" modellcsoportban.="" továbbá="" az="" arabinozid="" ii="" nem="" változtatta="" meg="" ennek="" a="" markernek="" az="" expresszióját="" a="" modellcsoporthoz="" képest="" (7.="" és="" 8.="" ábra="" (a–c)).="" ezenkívül="" a="" kaleolariozit="" b,="" parabozid="" b="" és="" parabozid="" ii="" védőhatását="" a="" h2o2-indukálta="" pc12="" sejtsérüléssel="" szemben="" a="" ho-1="" inhibitor="" znpp="" megfordította="" (8(d)="" ábra).="" összefoglalva,="" a="" feniletanoid-glikozidok,="" a="" caleo="" larioside="" b,="" arabinozid="" b="" és="" paraboside="" ii="" hatékonyan="" védték="" a="" pc12="" sejteket="" a="" h2o{84}}indukált="" oxidatív="" károsodástól.="" ennek="" megfelelően="" ezek="" a="" p.="" martini-ből="" izolált="" vegyületek="" potenciális="" gyógyszerjelöltek="" lehetnek="" neurodegeneratív="" betegségek="">
Szerzői hozzájárulásokAz LM és a ZC tervezte és tervezte a kísérleteket. GX, RK és BX végezte a kísérleteket. GX és XY írta a dolgozatot. GX, XY, RK, BX, ZC és LM megbeszélte az eredményeket, kommentálta a kéziratot. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végső kéziratot.
Közzétételi nyilatkozatA szerzők nem számoltak be potenciális összeférhetetlenségről. Finanszírozás Ezt a munkát a Baotou Medical College kutatási alapjai támogatták [a támogatás száma: BYJJ-YF 201727], valamint a 2018-as kínai orvoslás közegészségügyi támogatása, a „4. kutatás a kínai materia medica erőforrásról” [a támogatás száma: Finance Society [2018] ] 43].
Hivatkozások
[1] Butterfield DA. Az oxidatív stressz perspektívái az Alzheimer-kórban és a jövőbeli kutatási hangsúlyok előrejelzései. J Alzheimers Dis. 2018;64:1–11.
[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Oxidatív stressz és az amiloid-béta peptid az Alzheimer-kórban. Redox Biol. 2018;14:450–464.
[3] Guo JD, Zhao X, Li Y és mások. A dopaminerg neuronok oxidatív stressz által okozott károsodása Parkinson-kórban (áttekintés). Int J Mol Med. 2018;41:1817–1825.
[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH és mások. Az rs823128, rs1572931 és rs823156 polimorfizmusok társulása csökkent Parkinson-kór kockázatával. Neuroreport. 2017;27:936–941.
[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX és társai. A 7,8-dihidroxiflavon antioxidáns hatása megvédi a PC12 sejteket a 6-hidroxidopamin által kiváltott citotoxicitástól. Neurochem Int. 2014;64:18–23.
[6] Li MQ, Xu T, Zhou F és mtsai. Négy feniletanoid-glikozid neuroprotektív hatása a H2O2-indukált apoptózisra PC12 sejteken a Nrf2/ARE útvonalon keresztül. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.
[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Nrf2-ARE útvonal: új célpont az oxidatív stressz és a neurodegeneratív betegségek neurogyulladása ellen. Pharmacol Therapeut. 2016;157:84–104.
[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP és mások. A Herba cistanche-ból származó fenil-etanoid glikozidok hatása a kognitív hiányosságokra és az antioxidáns aktivitásra hím SAMP8 egerekben. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.
[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, et al. Tíkfa csomókból származó feniletanoid glikozidok és antioxidáns hatásuk. J Biol Active Prod Nat. 2016;6:272–281.
[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ és társai. A Lindernia ruellioides-ból származó caffeoil-fenil-etanoid-glikozid vegyületek antioxidáns hatása in vitro. Cent South Pharm. 2017;15:1687–1690.
[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L és mások. Az Nrf{1}}ARE útvonal szerepe az oxidatív stressz sérülésekben és kapcsolata más jelátviteli útvonalakkal. Anim Husbandry Feed Sci. 2016;37:42–48.
[12] Zheng XK, Li J, Feng WS et al. Előrelépések a Gesneriaceae tanulmányozásában. Chin J Új gyógyszer. 2003;12:261–263.
[13] Wen F, Li ZD. A Gesneriaceae növény kutatásának előrehaladása. Chin Wild Plant Resource. 2006;25:1–6.
[14] Yan WY, Chen L, Wang JM és mások. A Gesneriaceae növények triterpenoidjainak kutatása. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698–701.
[15] Kínai gyógynövény-gyártó cég. A hagyományos kínai orvoslás forrásfeljegyzései. Kína: Science Press; 1994.
[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG és mások. A feniletanoid-glikozidok eloszlása a Gesneriaceae gyógynövényekben. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267–4270.
[17] He ZD, Lau KM, Xu HX és társai. A Brandisia hancei fenil-etanol-glikozidjainak antioxidáns hatása. J Ethnopharmacol. 2000;71:483–486.
[18] Li L, Shi DF, Gui YG és mások. Tanulmány a Cistanche deserticola fenil-etanol-glikozidjainak antioxidáns hatásáról. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835–15836.
[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y és mások. A cisztanche glikozidjainak védő hatása a PC12 sejtek károsodására PARABOLA MARTINI PROTECT PC12 SEJTEK A VÍZTŐL
