Hogyan lehet megakadályozni és csökkenteni a vesekő kialakulását?

további információ:ali.ma@wecistanche.com

Ⅰ Ⅱ rész: A TGF-1/Smad jelátvitel által aktivált foszfolipid scrambláz által szabályozott foszfatidilszerin-everzió a vesekőképződés korai szakaszában

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

további információ:ali.ma@wecistanche.com

Bevezetés

Az urolithiasis az egyik leggyakoribb embert érintő betegség, amely számos urológiai szövődményhez kapcsolódik [1]. A kalcium-oxalát (CaOx) állítólag károsítja a tenyésztett vesetubuláris sejteket, ami után a sejtmembrán foszfatidil-szerin (PS) in vitro a belső rétegből a külső rétegbe csap át, és fontos szerepet játszikvesekőformáció [2]. Hasonló eredményekről számoltak be különböző, sejtszinten [3-6] végzett tanulmányok. Azonban a CaOx által közvetített károsodás által okozott PS-externalizáció hátterében álló mechanizmus a vesetubulussejtekben továbbra is tisztázatlan. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a kalcium-oxalát magas koncentrációja a reaktív oxigénfajták (ROS) túltermeléséhez vezet[7], ami ezt követően hozzájárul a PS-externalizációhoz a vesetubulusok sejtjeiben, ami magképződéshez és CaOx-kristályok növekedéséhez vezet [8]. A ROS és a lipid-peroxidáció erősen aktiválja a foszfolipid scramblázt (PLSCR)[9], míg a ROS-megkötő anyagok, például a glutation, a Q10 koenzim vagy az idebenon (a Q10 szintetikus koenzim homológja) csökkenti a PLSCR aktiválódását policisztás vesebetegségben [10] . A PLSCR, amely a sejtmembránhoz van rögzítve[11], a három foszfolipid-átforgató enzim egyikeként működik, amely képes katalizálni a PS gyors, kétirányú mozgását a membrán mindkét oldalán egy koncentrációgradiens mentén [12]. Fiziológiás körülmények között a sejtmembrán aszimmetrikus állapotban van, és a PLSCR nincs hatással a membránra [13]. Az eukarióta sejtek sérülését követően azonban a PLSCR aktiválódik, és a PS-t a belső rétegből a külső rétegbe mozgatja [14,15]. Ezen túlmenően, a kínai hörcsög petefészek K1-sejtek PLSCRin túlzott expressziója serkenti a PS-externalizációt, fokozva a PS kifelé irányuló mozgását a sejtfelszín felé az apoptózis során [16]. Ezért azt feltételeztük, hogy a PLSCR a vesetubulus sejtmembránjában a PS-externalizációban is részt vesz a ROS aktiválása révén.

Az oxalát által kiváltott ROS termelés potenciális molekuláris mechanizmusa a TGF- 1/Smad jelátvitel indukcióján keresztül megy végbe, ami szerepet játszhat a ROS képződésében [17,18]. A jelentések szerint a TGF- 1/Smad jelátvitel számtalan vesebetegségben, például glomerulonephritisben, vese intersticiális fibrózisában és nephrolithiasisban játszik szerepet[19]. Ezen túlmenően a TGF- 1-mal kezelt mononukleáris sejtek PSexternalizációt mutatnak a sejtmembránban azáltal, hogy a PS belső rétegből a külső rétegbe való átbillentését idézik elő [20]. Tudomásunk szerint azonban a TGF- 1/Smad jelátvitel és a vesetubulusok sejtmembránjaiban előforduló PS-széverzió közötti kapcsolat továbbra sem ismert. Feltételeztük, hogy a TGF{10}} részt vesz a vesetubulusok sejtmembránjaiban a PLSCR aktiválásával a patkány korai szakaszában.vesekőkialakulását a ROS közvetíti.

Ezért megvizsgáltuk, hogy a TGF- 1/Smad jelátvitel stimulálja-e a PS-externalizációt a ROS aktiválásán keresztül, és hogy a TGF aktiválja-e a PLSCR-t a vesetubulus sejtmembránjában a betegség korai szakaszában.vesekőin vitro és in vivo fejlesztése, ezáltal elméleti alapot teremtve az etiológiáhozvesekőképződés.

Kattintson a Cistanche DHT vesebetegségre

Anyagok és metódusok

A korai stádiumú CaOx vesekőképződés patkánymodellje

Hatvan tiszta, 3-hónapos hím Wistar patkányt, amelyek súlya 200±20 g, a Harbin Orvostudományi Egyetem Kísérleti Állatközpontja biztosított, és szobahőmérsékleten (22 fok ±2 fok) és 50-70 százalékos páratartalom mellett tartották őket. 3 napos adaptív tenyésztés után véletlenszerűen három csoportra osztották őket (20 patkány/csoport) – kontroll,vesekő, ésvesekőplusz SB431542 (a TGF- 1/Smad jelátviteli útvonal gátlója).

VesekőA képződés korai patológiás elváltozásként indul be a vesetubuláris sejtkárosodás után [21,22]. Ennek a sérülési folyamatnak a tanulmányozására egy korai stádiumú patkánymodellvesekőformáció jött létre, mivel standardizált megközelítésről még nem számoltak be. A vesetubuláris sejtkárosodást követő korai változások megfigyelésére a Liet al. által leírt módszert alkalmaztuk. [23]. Röviden, a kontrollcsoport patkányainak naponta 2 ml desztillált vizet adtak szájszondán keresztül, míg a patkányoknak avesekőcsoportnak naponta 2 ml 1%-os etilénglikol oldatot és 1%-os NHCl oldatot adtak szájon át. A patkányok avesekőplusz SB431542 csoportot intraperitoneálisan injektáltak SB431542 társoldószerrel (5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Shanghai, Kína) 7 naponta [24]. Élelmiszert és vizet ad libitum biztosítottak. A 14. napon a patkányokat érzéstelenítő túladagolással (pentobarbitál-nátrium, 200 mg/kg, intraperitoneális injekcióval) elaltattuk, és veséiket kivágtuk. A bal veséket azonnal folyékony nitrogénben konzerváltuk a későbbi fehérje kimutatáshoz. A jobb veséket rögzítettük, majd dehidratáltuk és paraffinviaszba ágyaztuk. Az összes állatkísérletet a National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) szerint végezték. A kísérleti eljárásokat a Harbin Orvostudományi Egyetem Első Társult Kórházának Állatkísérleti Felhasználási Etikai Bizottsága hagyta jóvá (jóváhagyási szám: 2020005, Harbin, Kína).

Kristályképződés a veseszövetben

A szövetmintákat Pizzolato módszerrel [23] megfestettük, és a CaOx kristályokat polarizált fényű optikai mikroszkóp alatt (Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, Kína) figyeltük meg. A pizzolato-pozitív régiókat az ImageJ 1.49v (National Institutes of Health, USA) segítségével a keresztmetszetek teljes szövetterületének permill-koraként fejeztük ki.

PS kimutatása a vese tubuláris sejtmembránjában in vivo áramlási citometriával

A vesehámsejtek PS-expozícióját fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) jelölt Annexin V festési vizsgálattal értékeltük, a korábban leírtak szerint [2]. A sejteket (minden csoportban) konfokális lézermikroszkóp alatt (Olympus, Tokió, Japán) figyeltük meg. A PS-externalizáció mennyiségét az Annexin V-pozitív sejtek százalékában határoztuk meg. A minták Annexin V fluoreszcenciáját áramlási citométerrel mértük (488 nm gerjesztés/530 nm emisszió; Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

TGF- 1 és Smad7 szintek mérése a vese tubuláris sejtmembránjában Western blottal

A fagyasztott szövetminták kinyerése után a fehérjét a ProteoExtract(M-PEK) természetes membránfehérje extrakciós kittel (MERCK Co., Kenilworth, NJ, USA) extraháltuk, majd a fehérjekoncentrációt Bio-Rad protein assay segítségével határoztuk meg. készlet (Hercules, CA, USA) a gyártó utasításai szerint. Ezt követően 40 ug fehérjét töltöttünk 8 százalékos SDS-poliakrilamid géllel (100 V-os halmozógél, 200 V-os rezolválógél) 1 órára 300 mA állandó elektródaárammal. A gélben lévő fehérjéket nitrocellulóz membránra vittük (Kexing Co., Peking, Kína), blokkoltuk 1 órán át 37 °C-on 5 százalékos sovány tejporban, és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk birka anti-patkány TGF 1-gyel. ab208466; Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) és Smad7 (66 478; Proteintech, Wuhan, Kína) antitestek [25]. Torma-peroxidázzal jelölt nyúl anti-birka másodlagos antitestet adtunk hozzá (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Peking, Kína), és 37 fokon 1 órán át inkubáltuk. A jelet fokozott kemilumineszcenciás reagenssel (Abcam) detektáltuk. A pozitív sávokat Gel-Pro 4.0 gél optikai sűrűségelemző szoftverrel elemeztük, és megmértük a kumulatív optikai sűrűséget (IOD-értéket), ahol az R-érték a relatív fehérjetartalmat jelenti a következőképpen: R=referencia IOD-érték PLSCR(cél)/a GAPDH (referencia fehérje) IOD referenciaértéke.

Sejtkultúra és RNS interferencia

Egy vese epiteliális sejtvonalat (MDCK sejtek, CCL34, passzázsok 53-90; ATCC, Manassas, VA, USA) növesztettünk Dulbecco módosított Eagle táptalajban, amelyet antibiotikumokkal egészítettünk ki (10{{1{{14} }}} U/ml penicillin, 100 mg/ml sztreptomicin; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) és 10% magzati szarvasmarha-szérum (Life Technologies Co.) 37 fokos hőmérsékleten 5 százalékos CO-t tartalmazó atmoszférában és 0,25 százalékos szubkultúrával tripszin és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav (Life Technologies Co., CA, USA). A sejteket CaOx-szal (0,5 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 2 órán át, majd 0,5 mM CaOx-szal és 100 ug/ml semlegesítő anti-TGF- 1 antitesttel (R&D Systems, Minneapolis) kezeltük. , MN, USA) 2 órán keresztül. Minden kísérletet három párhuzamosban végeztünk.

A PLSCRin PS-everzió szerepének meghatározásához a vese tubuláris epiteliális sejtjeit PLSCR siRNS-sel transzfektáltuk [26]. Az siRNS-t az Anhui General Biological System (Anhui, Kína; lásd: 1. táblázat) tervezte és szintetizálta. A LipofectamineTM 2000 (Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Sanghaj, Kína) a gyártó utasításai szerint történt a transzfekcióhoz. . 24 órás transzfekció után a sejteket tripszinnel emésztettük, 1000 x g-vel centrifugáltuk 5 percig, kétszer mostuk PBS-sel, és ismét centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük, és a pelletet PBS-ben szuszpendáltuk, hogy 1×10 fokos sejt/ml sűrűségű egysejtű szuszpenziót kapjunk. A FAM (karboxifluoreszcein) expressziójának pozitív aránya áramlási citometriával meghatározva 93% ±5% volt. A TGF 1 és a PLSCR közötti kapcsolat további felmérésére a sejteket 0,5 mM CaOx-szal vagy 10 ng/ml TGF{15}}-val kezeltük 2 órán át, majd PLSCR siRNS-sel transzfektáltuk.

PLSCR szint mérése vesetubuláris sejtmembránokban Western blottal

A fehérjét ProteoExtract (Chemical Book Co., Peking, Kína) természetes membránfehérje extrakciós készlettel extraháltuk, és a fehérjekoncentrációt Bio-Rad protein assay kit (Noble-Ryder Co., Peking, Kína) segítségével határoztuk meg. Ezt követően 40 ug fehérjét töltöttünk fel egy 8 százalékos SDS-poliakrilamid gélen (100 V-os halmozógél, 200 V-os rezolválógél) 1 órán át 300 mA állandó áram mellett. A gélben lévő fehérjéket nitrocellulóz membránra vittük át (Kexing Co., Shenzhen, Kína), és 5 százalékos sovány tejjel blokkoltuk 1 órán át 37 °C-on, majd egy éjszakán át 4 fokon inkubáltuk juh anti-patkány PLSCR monoklonális antitesttel (1:200, PAB781HuO1; Abcam, Guangzhou, Kína). Ezután torma-peroxidázzal jelölt nyúl birka elleni másodlagos antitestet adtunk hozzá (1:400), és az elegyet 37 °C-on 1 órán át inkubáltuk. A membrán mosása után a jelet fokozott kemilumineszcenciás reagenssel (Abcam, Guang-zhou, Kína) detektáltuk. A pozitív sávokat Gel-Pro 4.0gel optikai sűrűségelemző szoftverrel elemeztük, és megmértük az IOD értéket, ahol az R-érték a relatív fehérjetartalmat képviseli a fent leírtak szerint.

1. táblázat: siRNS-szekvenciák a PLSCR-hez

A membrán foszfatidilszerin eloszlásának mérése

A sejtmembrán PS-everziójának mennyiségét a Kim és munkatársai által leírt fluoreszcencia kioltási módszerrel határozták meg.[27] és kutatócsoportunk [2], nitrobenzol-2-oxa-1,3-diazol (NBD, Shanghai, Kína) fluoreszcens szondával. Miután a sejtmembrán külső rétegében lévő PS-t NBD-vel jelöltük, a sejteket 5 mM diizopropil-fluor-foszfátot tartalmazó PBS-ben tenyésztettük. Ezt követően kalcium-oxalátot (10 mM) tartalmazó PBS-t adtunk hozzá, és a sejteket 37 °C-on inkubáltuk. 10 percenként azonos mennyiségű sejtszuszpenziót ürítettünk ki, és a fluoreszcencia intenzitását RF-5000 spektrofluorométerrel (Shimadzu, Kyoto, Japán) rögzítettük. A spektrofluorométer beállításai a következők voltak: 10 nm résszélesség 530 nm emissziós hullámhossz esetén; és 5 nm-es résszélesség 470 nm gerjesztési hullámhosszhoz. Ezután az átlagos fluoreszcencia értéket (FT) rögzítettük az 50-es években. Az átlagos csökkent fluoreszcencia intenzitást (FD) is feljegyeztük, miután ditionit oldatot használtunk az NBD fluoreszcenciának a sejt külső rétegéből való kioltására. Ezt követően 1% (w/v) Triton X{17}}-t adtunk a sejtmembrán permeabilizálására. A sejtmembrán belső rétegéből származó NBD fluoreszcenciát ezután leállítottuk, és feljegyeztük a fluoreszcencia intenzitást (FO). Az NBD-PS százalékos arányát a belső lebenyekben később a következő egyenlettel számítottuk ki: az internalizált NBD-PS százalékos kora=100×[(FD-FO)/(FT-FO)].

A PS-externalizáció százalékos arányát az NBD-PS internalizáció mérésére használt elv szerint határoztuk meg. Az NBD-PS százalékos arányát a külső lebenyekben szintén a következő egyenlettel számítottuk ki: NBD-PS százalékos aránya a külső lebenyekben =100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

Statisztikai analízis

A folytonos változókat átlag±szórásként fejezzük ki. Nem-paraméteres páros rang-összeg tesztet, t-próbát és khi-négyzet tesztet használtunk. Minden elemzést az SPSS 19-es szoftverrel végeztünk.{5}}(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Eredmények P-vel<0.05 were="" considered="" statistically="">

Eredmények

A TGF- 1/Smad jelátvitel in vivo stimulálja a PS-externalizációt

Kristályképződés patkánymodell veseszövetében

Korai stádiumú patkánymodell létrehozásavesekőpatkányok gyomrába etilénglikolt és ammónium-kloridot adagoltunk 2 hétig, majd minden vesemetszetet digitális mikroszkóppal megvizsgáltunk. A kontrollcsoport mintáiban a 14. napon normál vesetubuláris struktúrákat figyeltek meg kristályképződés nélkül (1A. ábra). Amikor a veseszövet avesekőcsoportot mikroszkóppal figyeltük meg, a vesetubulusok látható mikrokristályokkal kitágultnak tűntek; esetenként CaOx kristályok felhalmozódását figyelték meg néhány vesetubulusban, ami a korai stádiumú patkánymodell sikeres létrehozását jelzi.vesekővesetubulus sejtkárosodás kialakulását és kialakulását.

PS jelenléte a vese tubuláris sejtmembránjában

Az Annexin V-FITC, egy fluoreszcens molekula, amely a sejtfelszínen kötődik a PS-hez, széles körben használatos a PS újraeloszlásának kimutatására. Vizsgálatunkban az MDCK sejteket a normál kontrollban,vesekő, ésvesekőplusz SB431542 csoportokat figyeltünk meg konfokális lézermikroszkóp alatt (1B. ábra). A PS-verziós arány nőtt avesekőa kontrollcsoporthoz képest (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">vesekőplusz SB431542 csoport alacsonyabb alapszintű PS-externalizációt mutatott, mint a csoportbanvesekőcsoport (P<0.05, fig.="" 1c,="">

TGF{0}} és Smad7 szintek mérése

A TGF{0}} szint avesekőcsoportot Western blottal határoztuk meg. Egy tipikus Western-blot a 2A. ábrán a TGF- 1 szint denzitometriás elemzésével együtt. Az értékeket a kontrolléhoz normalizáltuk, és a TGF- 1 és a tubulin arányaként fejeztük ki. Az etilénglikol és NH Cl hozzáadása szignifikánsan növelte a TGF- 1 szintet és csökkentette a Smad7 szintet a kontrollsejtekhez képest (2A. ábra); az SB431542 plusz etilénglikollal és NH-val végzett kezelés azonban szignifikánsan csökkentette a TGF- 1 szintet és növelte a Smad7 szintet az etilénglikollal és NH-val, Cl-mal kezelt sejtekhez képest.

A TGF in vitro aktiválja a PLSCR aktivitást a vesetubulus sejtmembránban

PLSCR

A PLSCR szintjét Western blottal értékeltük ki. A sejteket CaOx-szal kezeltük 2 órán át. A PLSCR szint elhanyagolható volt a kontroll sejtekben, de szignifikánsan emelkedett a CaOx csoportban (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Károsodott NBD-PS befelé mozgás

Meghatároztuk a PS befelé és kifelé irányuló mozgását a vese tubuláris epiteliális sejtmembránjában, hogy értékeljük a PLSCR aktivitást. Annak felmérésére, hogy a PLSCR befolyásolja-e a PS mozgását a külső szórólapról a plazmamembrán belső szórólapjára, fluoreszcensen jelölt PS-t (NBD-PS) integráltunk a plazmamembrán külső szórólapjába, és figyeltük annak internalizációját (3. ábra). Az MDCK-sejtek által internalizált NBD-PS mennyisége a kontroll- és a CaOx-csoportban körülbelül 46,2%, illetve 17,8% volt. Ezért a PS internalizáció sebessége a CaOx csoport sejtjeiben szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontrollcsoport sejtjeiben (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

1. ábra Kristályképződést és PS-externalizációt figyeltünk meg a kontroll, a vesekő és a vesekő plusz SB431542 csoportban.

(A) Kristályképződés a veseszövetben a 14. napon; a nyíl mikrokristályos szerkezeteket jelöl. (B) Az MDCK sejteket konfokális lézermikroszkóppal figyeltük meg.

(C) Áramlási citometrikus görbék az everziós sebességről. (D) Lefordítási arány ( százalék). A háromszög P-t jelöl<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">vesekőcsoport

Továbbfejlesztett NBD-PS kifelé mozgás

Annak meghatározására, hogy a PS kifelé irányuló transzportját befolyásolja-e az oxalát, az MDCK sejteket intracellulárisan NBD-PS-sel jelöltük, és meghatároztuk a példa-mikrofonos szórólapra való mozgásának mértékét. Az inkubációs közeg szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazott (1 tömeg/térfogat%), amely gyorsan extrahálta a felületen expresszált NBD-PS-t. Az NBD-PS megközelítőleg 34,5 százaléka vándorolt ​​a külső szórólapra a kontrollsejtekben, míg a kifelé irányuló PS-transzfer aránya a CaOx-csoport sejtjeiben 75,3 százalékra nőtt a teljes belső jelölt NBD-PS-hez képest, ami szignifikánsan nagyobb volt, mint a hogy a kontrollcsoport celláiban (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

2. ábra: TGF- 1/Smad expresszió a kontroll, vesekő és vesekő plusz SB431542 csoportban, valamint PLSCR expresszió a vesetubulus sejtmembránjában.

(A)TGF- 1/Smad kifejezés. (B) Relatív foszfolipid scrambláz (PLSCR) szintek és reprezentatív blot a GAPDH.P expressziójára normalizálva<>

A háromszög P-t jelöl<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

A RÉSZÉHEZ KATTINTSON IDE Ⅱ