HPTLC-denzitometriás szűrés és a fluoreszcens fehérítőszerekkel való szennyeződés tömeges azonosítása a gabonalisztben

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yisheng Chen1,2 és Caihong Huang1,2 és Xueming Xu

Absztrakt

Az elmúlt években egyre nagyobb aggodalomra ad okot a kapcsolódó élelmiszer-biztonsági kérdésekfluoreszcens fehérítő szerekcsomagolóanyagoktól. Itt egy olyan egyszerű és megbízható módszer kifejlesztéséről számoltunk be, amely alkalmas két általánosan elterjedt fluoreszcens fehérítőszer (FWA 184 és FWA 367) nagy áteresztőképességű mennyiségi meghatározására és azonosítására gabonatermékekben (búza- és rizsliszt), amelyeket nagy teljesítményű hígítóval alapoznak meg. rétegkromatográfia. Először is, a minta előkészítése és tisztítása gyorsan megtörtént egy optimalizált szilárd-folyadék extrakcióval. Az extraktumokat és a referencia standardot egyidejűleg választottuk el szilikagél lemezeken, mozgófázisként toluol és etil-acetát (10/0,3, v/v) elegyét használva. Ezután gyors számszerűsítést végeztünk denzitometriával fluoreszcens módban (365HPTLCsokoldalú analitikai platformként ideális egyensúlyt érhet el az áteresztőképesség, az egyszerűség és a detektálhatóság között, ezért különösen alkalmas képernyőorientált élelmiszerelemzésre.

Kulcsszavak HPTLC. Denzitometria.Fluoreszcens fehérítő szerek

A Cistanche fehérítő hatással bír a bőrre

Bevezetés

Az elmúlt évek tanúi voltak az élelmiszer-csomagolóanyagok fellendülésének. Másrészt a csomagolási anyagokkal kapcsolatos élelmiszerbiztonsági kérdések világszerte is felkeltették a figyelmet. Az ezekből az anyagokból származó veszélyes vegyi anyagok közülfluoreszcens fehérítő szerek(FWA-k) különösen nagy érdeklődésre tettek szert. Az FWA-k molekulái képesek voltak elnyelni a sugárzást és egyidejűleg látható fényt bocsátani ki. Az ilyen átalakulások ellensúlyozhatják az anyagok sárga színét, ami fokozott fehér benyomást eredményez. Ennek megfelelően az élelmiszer-csomagolások esetében intenzíven figyelembe vették az FWA-kkal beépített anyagokat. Különösen a gabonatermékek esetében alkalmaztak ilyen csomagot a fogyasztók vonzerejének és elfogadottságának növelésére. Például a szokatlanul magas szintFWA-kpattogatott kukorica és instant tészta papírtábláján találtak (Jiang et al. 2015). Ennek eredményeként az FWA-k bevándoroltak a gabonaételekbe, és szennyeződést eredményeztek, ami újabb kihívást jelent a közegészségügy számára.

Évtizedekkel ezelőtt a kiemelkedően magas stabilitásFWA-kNoha az FWA-k valódi hatása az emberi egészségre még mindig nem volt meggyőző, fejlődési toxicitásukat és a génexpresszió megváltoztató hatását modellállatokban kísérletileg igazolták (Belliveau és mtsai 1990; Jung et al. 2012). .Tekintettel ezekre a lehetséges kockázatokra, az élelmiszer-biztonsági hatóságok szerte a világon korlátozásokat és korlátozásokat írtak elő az élelmiszerekkel érintkezésbe kerülő anyagokban a formálódó FWA-k tekintetében.

E törvényi szabványok végrehajtása érdekében analitikai módszerek széles skáláját javasolták az FWA-k kimutatására, elsősorban UV-fluoreszcencia vizsgálatra vagy oszlopkromatográfiára (HPLC és kapilláris elektroforézis) (Jiang és mtsai. 2015; Wu et al. 2018). . A gyakorlat szempontjából azonban mindezen létező módszereket nem a költséghatékony és megbízható szűrés elvéhez igazították. Például az UV-fluoreszcencia vizsgálati módszer nagymértékben szenvedett a gyenge szelektivitástól. Eközben az oszlopkromatográfiás rendszereken alapuló elemzések jelentős hiányosságokat mutattak az egyszerűség és a költséghatékonyság terén. Éppen ellenkezőleg, a nagy teljesítményű vékonyréteg-kromatográfia (HPTLC) új távlatot nyitott az élelmiszer-szűrési módszertanban. Rengeteg szűrésre orientált módszer alapul.HPTLCKülönféle élelmiszer-összetevők elemzésére fejlesztették ki és alkalmazták, páratlan rugalmasságot mutatva, miközben ideális esetben pótolják az egyszerűség, a specifikusság és a megbízhatóság szempontjai közötti űrt (Galarce-Bustos et al. 2019; Li et al. 2018; Micropoulou et al. 2019). Pedan és munkatársai 2018; Premarathneet társai 2018; Stanek és munkatársai 2019; Sun és munkatársai 2018). Ily módon sok minta (legfeljebb 40) elemezhető egyidejűleg, szinte korlátlan mátrixtoleranciával, mivel mindegyik tányér eldobható volt (Li et al. 2019). Ez azt jelentette, hogy a mintatisztítás és a műszerek karbantartási igénye jelentősen megtakarítható. A vizuális ellenőrzés végrehajtásaként a denzitometria lehetővé tette az elválasztási eredmények pontos és pontos mérését HPTLC lemezen (Lebot et al. 2020). Az elválasztási technológiák gyors fejlődésével a HPTLC legnagyobb érdeme az volt, hogy olyan platformként használható, amely hatékonyan egyesíti a hatékony analitikai eszközök használhatóságát, mint például a felületnövelt Raman-spektroszkópia (Kang et al. 2019; Qu et al. 2018; Wang). et al. 2018a, b), bioszenzor (AgatonovicKustrin et al. 2020; Chen és mtsai 2020a, b; Choma és Grzelak2011; Galarce-Bustos és mtsai 2019), kép/kemometriai elemzés (Rejšek et al. 2016; Xu és Liu 2021; Xu et al. 2019), és tömegérzékelés (Wang et al. 2018a, b). Mint ilyen, a HPTLC sokoldalú eszköztár volt, különösen alkalmas szűrési feladatokra.

Ennek fényében ennek a munkának az volt a célja, hogy egy egyszerű és érzékeny szűrési módszert dolgozzon ki a különböző gabonaliszt mintákban az FWA-k esetében, aHPTLCfluoreszcens denzitometria (FLD) és tömegspektrometria (MS). A módszer kidolgozása után teljesítményét mennyiségileg és minőségileg is validálták, ami lényegében bizonyítja, hogy a szűrés egyszerű eszközeként valós fölénye.

Anyagok és metódusok

Anyagok

Standards of FWA184 (2,5-bis(5′-tert-butyl-2-benzoxazolyl) thiophene, CAS 7128-64-5, > 99% purity) and FWA367 (1,4-bis(2-benzoxazolyl) napthalene, CAS 5089-22-5, >98 százalékos tisztaságú) az Aladdintól (Sanghaj, Kína) vásároltuk. Az analitikai minőségű szerves oldószerek és vegyszerek a Sigma Aldrich-től (Sanghaj, Kína) származnak. A szilikagél lemezek60 F254 (analitikai minőségű, rétegvastagság 0,1 mm, 10 × 20 cm-es méret, sorozatszám: 1.05729.0001) a Mercktől származtak (Darmstadt, Németország). Hat vak gabonamintát, köztük három búzaliszt- és három rizslisztmintát vásároltak a helyi szupermarketben. Ezen kívül a Shenzhen Customs Food Center biztosította a megerősített FWA-szennyezettségű búza- és rizslisztmintákat.

cistanche tubulosa kivonat

Szabványos megoldások

Az FWA 184 és FWA 367 törzsoldatait ({0}},01 mg/ml) etil-acetátban külön-külön vagy keverékben készítették el, és hűtőszekrényben (4 fokos) tárolták. A kalibrációs görbék felállításához szükséges munkaoldatokat további törzsoldatok 0,0001 mg/ml koncentrációra történő hígításával állítottuk elő.

Minta előkészítés

Analitok kivonására gabonamintákból, etil-acetátból, acetonból és ezek keverékéből (keverési arány, v/v, 10/0, 6/4, 4/6 és 0 /10) extrakciós oldószerként teszteltük. Röviden összefoglalva, egy 5 g-os gabonaliszt mintát összekevertünk 20 ml extrakciós oldószerrel; szükség esetén 100 vagy 50 µl FWA standard törzsoldatot (0,01 mg/ml) csepegtettünk a vakminták extrakciós keverékébe, így 200 vagy 100 ug/kg mesterséges anyagot kaptunk. szennyeződés. 30 fokos ultrahangos fürdő 5 perces kezelését követően a szuszpenziót 5 perces 4 fokos centrifugálással választottuk el. Ezt követően 1 ml felülúszót óvatosan pipettáztunk egy 5 ml-es fecskendőbe, és 0{23}}μmnylon membránon szűrtük át a szilárd részecskék eltávolítása érdekében, hogy elkerüljük a tű eltömődését.

HPTLC lépések

A mintakivonatokat és a referenciastandardokat 6-mm-es sávok formájában permeteztük ráHPTLClemezeket egy Linomat 5 félautomata mintavevővel (CAMAG, Svájc), amely 100-μL-es fecskendővel van felszerelve, 100 nL/s és 0,2 μL szállítási sebességgel pre-adagolás.A szalagtömb kezdetben 15 mm-re volt a bal széltől és 10 mm-re alulról, az automatikusan számított intervallumokkal egymástól. Az alkalmazási térfogat 10 μL volt vak és tüskés mintakivonatokhoz; A kalibrációs görbe felállításához 1, 5, 10, 15 vagy 20 μl munkaoldatot (0,0001 mg/ml) alkalmaztunk, ami 100, 500, 1000, 1500 és 2000 pg/sávonkénti gradiens koncentrációt eredményezett. A mintavétel során a fecskendőt kézzel öblítették ki tiszta etil-acetáttal az egyes alkalmazások között kétszer a keresztszennyeződés elkerülése érdekében. A felhordás után a bevonatot egy TLC-heater III (CAMAG, Svájc) 2 percig melegítettük 60 fokon, hogy eltávolítsuk az oldószer maradékot az alkalmazási sávokban. A kromatográfiát automatikusan ADC{25}} (CAMAG, Svájc) segítségével végeztük el, hogy reprodukálható elválasztást megvalósítani. Először az előhívó kamra mindkét árkát megtöltöttük állófázissal, amely 10 ml toluolt és 0,3 ml etil-acetátot tartalmazott. Mielőtt a lemez alját a mozgófázisba merítettük, 5 percig szárazságot ellenőriztünk telített vizes MgCl2-oldat buborékoltatásával 33%-os végső relatív páratartalomig, 10 perces tartálytelítettségig és 10 perces lemezelőfeltételig. Az oldószerfront vonal migrációs távolságát 50 mm-ben rögzítettük.

Lemezdokumentáció és denzitometria

A fejlesztés után a kifejlesztett lemez digitális képeit egy DD70 képalkotó rendszer (Biostep, Németország) dokumentálta, amely egy Sony EOS700D digitális fényképezőgéppel volt integrálva, 366 nm-es UV lámpákkal. Ezután az elválasztási eredményeket denzitometriásán kiértékeltük egy TLC szkenner 3 (CAMAG, Svájc) segítségével. A denzitometria munkahullámhosszának meghatározásához a szilikagél lemezre felvitt analit gerjesztési spektrumát folyamatosan profiloztuk 220-400 nmuszig a D2 & W lámpával, K400 optikai szűrővel. A kvantitatív szkennelés általános beállításokkal történt: fluoreszcens mód, higanylámpa, gerjesztési hullámhossz 365 nm, K400 optikai szűrő, 3,00 × 0,30 mm-es mikrorés dimenzió, szkennelési sebesség 100 μm/s, adatfelbontás 100 μm/st. A műszeres működést és az adatfeldolgozást a winCATS szoftver 1.4.4-es verziója vezérelte.

hasznacistanche tubulosa kivonat

HPTLC-MS

Az FLD méréseket követően a pozitív sávokat a TLC-MS interfész (CAMAG) közvetítésével MS ujjlenyomataik alapján azonosították. Kvaterner pumpával vezérelve a 366 nm-es megvilágítás mellett látható célzott sávokat 0,1% hangyasavat tartalmazó acetonitril áramlásával eluáltuk, 0,2 ml/perc sebességgel 60 másodpercig. Az eluenst közvetlenül egy elektropermetezési forrásba fecskendeztük, és egyidejűleg hármas kvadrupólus tömegspektrométerrel (Quattro Premier XE, Waters) analizáltuk. A teljes letapogatású MS adatgyűjtés ESI plus módban a következő beállításokkal történt: a kapilláris feszültség 3,5 kV, a kúpfeszültség 50 V, az ionforrás hőmérséklete 100 fok, a deszolvatációs hőmérséklet 400 fok, a deszolvatációs gáz áramlási sebessége 700 l/h, és kúpos gázáram 50 L/h. A spektrumokat 50-1000 m/z tartományban vettük fel.

Eredmények és megbeszélés

Kromatográfia optimalizálás

A célvegyületek alacsony polaritását illetően a mozgófázis optimalizálását különböző hidrofób oldószerekkel (többek között acetonnal, toluollal, hexánnal és petroléterrel) és ezek keverékeivel végzett próbakísérletekkel kezdtük meg. A kezdeti szűrésből azt találták, hogy a toluol önmagában elegendő felbontást biztosít a megcélzott vegyületeknek a zavaró mintamátrixokból, amelyek többnyire a pálya alsó részén maradtak. Az analitok felbontásának további növelésére különböző mennyiségű (1-10 százalék) etil-acetátot adtunk hozzá. Összehasonlításból a mozgó fázis (folyékony), a kamraatmoszféra (gáz) és az állófázis (szilárd) közötti törékeny egyensúlynak tulajdonítható. Más szóval, a fázisegyensúly hirtelen megbomlik, ha a lemezt kézzel mozgatják. Ez erősen igazolta a műszerezettség fontosságát az ismételhetőség szempontjábólHPTLCelemzés. Ezen túlmenően az optimalizált elválasztási feltételek alkalmazhatóságát a mesterségesen szennyezett gabonaminták elemzésével tovább értékeltük. Az 1a. ábrából megállapítható, hogy a mintamátrixok jelenléte nem vezetett a kromatográfiás eredmények jelentős eltéréséhez. Ezért a toluol/etil-acetát (10/0,3, v/v) elegyet rögzítettük mozgófázisként ebben a munkában.

Vizuális szűrés és FLD kvantifikáció

A teljes lemez képfelvétele volt az egyik jellemző előnyeHPTLC, amellyel szemrevételezéssel könnyen elkészíthető az elválasztás félkvantitatív profilja. Itt az analitok intenzív natív fluoreszcenciája lehetővé tette a kromatográfiás eredmények közvetlen leolvasását 366 nm-es besugárzás mellett, 100 pg/sáv érzékenységgel. Ezt követően csak a nyomvonalak közötti vízszintes összehasonlítás vezethetett a minta szennyezettségi fokának egyértelmű becsléséhez, ami a szűrési feladatokban nagy előnyben volt. Továbbá denzitometriát fluoreszcens módban alkalmaztunk a sávok szkenneléséhez. Ez a lépés is nagyon hatékony volt, ami 2-3 perc alatt elvégezhető. A denzitometriás méréshez optimális gerjesztési hullámhossz meghatározása céljából a szilikagél rétegre lerakódott analit gerjesztési spektrumát (220-400 nm) vizsgáltuk. ábrán látható módon. Az 1b. ábrán látható, hogy az analit spektrumai különböző körülmények között nagy hasonlóságot mutattak, és a legintenzívebb emissziót mutatták 365 nm-es gerjesztésnél. Ezért a higanylámpa 365 nm-es fényét egy 400-nmedge szűrővel (K400) kombinálva használták. Amint az 1d. ábrán látható, ezen optikai paraméterek alkalmazhatóságát az analitsávok tiszta jelcsúcsai igazolják még koextrahált mintamátrixok jelenlétében is.

A mennyiségi meghatározás optimalizálása és érvényesítése

Linearitás és érzékenység

A megállapított denzitometriás detektálás kvantitatív kapacitását először a linearitás és az érzékenység tekintetében validálták. Ennek érdekében 100-2000 pg/sáv koncentrációkon belül 5 szinten alapuló kalibrációs grafikont állítottunk fel. Az 1. táblázatban foglaltak szerint az eredményeket az 1. táblázat tartalmazzaHPTLC-FLD jó linearitást mutatott kielégítő korrelációs együtthatókkal (R2=0.9999). A kalibrációs görbe alapján a módszerek érzékenységét, beleértve a kimutatási határt (LOD) és a kvantitációt (LOQ), a DIN 32645 módszer szerint számították ki, 95 százalékos statisztikai megbízhatósággal (Deutsches Institut für Normung 2013). A számításból az aspg/sáv kifejezett LOD 45 és 52 volt az FWA 184 és az FWA 367 esetében. Az alkalmazási térfogatot 10 μL-re rögzítve ez a kimutathatóság 18, illetve 21 ug/kg volt, ami körülbelül 30-szeresen maradt el az EU által előírt tűréshatár (600 ug/kg) alatt (Európai Unió, 2002).

Helyreállítás és pontosság

A kidolgozott pontosságának felmérése előttHPTLC-FLD a gabonamintákba kevert analitok visszanyerési arányának meghatározásával megfelelő extrakciós módszert kell optimalizálni. ForFWA extrakció gabonalisztben, Wu et al. diklór-metán és aceton keverékének (3/2, v/v) használatát javasolják (Wu et al. 2018). A diklór-metán környezeti és karcinogén toxicitását illetően itt alternatív módon etil-acetát és aceton keverékét teszteltük extrakciós oldószerként. Amint azt a 2. ábra példaszerűen bemutatja, nyilvánvaló volt, hogy a tiszta etil-acetát a legjobb választás a célvegyület mindkét gabonamintából történő extrahálására, összehasonlítva a Wu és munkatársai (2018) módszerével. Alkalmazhatóságának garantálása érdekében az optimalizált extrakciós módszert kiterjesztettük 6 gabonamintára, köztük 3 búzalisztre és 3 rizslisztre, a tüske-visszanyerési kísérlethez. A 2. táblázatban foglaltak szerint a számított visszanyerési arányok 88,7–108,4 százalék között mozogtak. Eközben a kvantifikáció reprodukálhatósága a relatív szórás (százalékos RSD) tekintetében a hármas példányok esetében 10,5 százaléknál kisebbnek bizonyult. Ezen túlmenően figyelemre méltó, hogy a kapott adatok elhanyagolható mértékben függtek a felhasznált mintáktól és a spiking szinttől, ami azt mutatja, hogy a kifejlesztett a kvantitatív elemzés hatékony szűrési eszköz lehetFWA-kgabonamintákban, elfogadható pontossággal és precizitással.

FWA-k meghatározása csomagolt gabonamintákban

Az optimalizált extrakciós feltételek alkalmasságának további értékelésére ésHPTLC-FLD kimutatás, a módszert példaszerűen alkalmazták két olyan gabonaminta mennyiségi meghatározására, amelyek csomagolása FWA-kat tartalmaz. Egyszerűen a 3a. ábrán látható lemezkép szemrevételezése alapján nagyon könnyű volt arra a következtetésre jutni, hogy mindkét gabonaminta szennyezett volt FWA-maradékokkal. Ezután a számszerűsítést FLDscanning segítségével végezték el. Amint a 3b. ábra mutatja, a detektálás jó szelektivitása figyelhető meg a kapott dendrogramon. A 3. táblázatban foglaltak szerint az analit-maradékok mindkét gabonatermékben az ug/kg határon belül voltak (maximum 262,8 ug/kg), ami jelentősen a specifikus kioldódási határérték (600 ug/kg) alatt volt. Ennek ellenére az ilyen szennyeződések lehetséges negatív hatásai is riasztóak maradtak, mivel a krónikus expozíció okozta káros hatások még nem voltak elegendőek.

hasznacistanche tubulosa kivonat

Molekuláris azonosítás MS ujjlenyomatokkal

Az ebből eredő sávok kémiai azonosítása érdekébenHPTLCAz in situ MS detektálást megerősítési eszközként beépítették a szűrési megközelítésbe, amelyet egy elúciós fej alapú TLC-MS interfész segített. A kérdéses sávokon belüli vegyületeket lemostuk a szilikagél rétegről, és közvetlenül mértük elektrospray MS-sel. A 4. táblázat a szilikagél rétegből rögzített analitok diagnosztikai jelét foglalta össze. Nyilvánvaló volt, hogy az FWA 184 esetében a 363,1 m/z volt a leggyakrabban előforduló ionjel az FWA 184-nél, míg az FWA 367-nél 431,2 m/z. Jól egyetértve a protonált formában lévő elméleti molekulaionokkal, ezek a specifikus jelek magától értetődőek voltak, ezért használhatók ujjlenyomat bizonyíték a megerősítéshez. Ezen túlmenően ennek a módszernek az alkalmazhatóságát példaszerűen validálták valós minták pozitív eredményeivel. Amint a 4. ábrán látható, a kapott jelek jó hasonlóságot mutattak az analit ujjlenyomatával, ami azt mutatja, hogy a feltételezett sávok egyértelműen hozzárendelhetők a célvegyületekhez.

hasznacistanche tubulosa kivonat

Következtetések

Ebben a munkában,HPTLCsikeresen alkalmazták rugalmas platformként, amely hatékonyan összeszereli az elválasztást és a spektroszkópiai elemzést, a gabonaminták FWA-szennyezettségének egyszerű mennyiségi meghatározására és megerősítésére. Optimalizált extrakciós módszerrel a búza- és rizsliszt mintákban az analitokat szelektíven és pontosan kvantifikáltuk HPTLC-FLD-vel, a jó linearitás és a LOD jelentősen a tűréshatár alatt voltak. Ezen túlmenően, a bevonórétegen maradó elválasztott eredményeket tovább kapcsolták az in situ MS analízishez, lehetővé téve a pozitív sávok gyors molekulaazonosítását elkülönített sávokban, így egyértelműen biztosítva a szűrési eredmények megbízhatóságát. Az élelmiszer-szűrési elemzés valósága által támasztott kihívásokkal szemben A HPTLC-t egyre inkább elismerték. A munka bebizonyította, hogy a HPTLC mint sokoldalú platform, amely kiemelkedően költséghatékony módon integrálja a kvantitatív és minőségi detektálást, hatékony eszköz lehet az analitikai kémiában.

hasznacistanche tubulosa kivonat kiegészítők