A hidrogén-szulfid csillapítja a vese I/R által kiváltott gyulladásos válaszreakciót és apoptózist a szabályozó Nrf2 által közvetített NLRP3 jelátviteli útvonal gátlásán keresztül
Mar 14, 2022
Absztrakt. A vese ischaemia/reperfúziós (I/R) sérülése akuthoz vezethetveseelégtelenség, késleltetett graftfunkció és graftkilökődés. Nukleotidkötő oligomerizációs domén NOD-szerű receptor, amely a pirin 3-as domént (NLRP3) közvetítette, részt vesz a gyulladás kialakulásábanvese-sérülés. Az Nrf2 felgyorsítja az NLRP3 jelátviteli útvonal aktiválását és tovább szabályozza a gyulladásos választ. Ezenkívül a hidrogén-szulfid védő szerepet tölt bevesekárosodás; a részletes mögöttes mechanizmus azonban továbbra is kevéssé ismert. A jelen tanulmány azt vizsgálta, hogy az Nrf2 és NLRP3 útvonalak részt vesznek-e a hidrogén-szulfid által szabályozott folyamatokban.vese-A gyulladásos válasz és az apoptózis I/R által kiváltott aktiválása. A vad típusú és Nrf2-knockout (KO) egereken műtétet hajtottak végre az indukálás céljábólvese-I/R a kétoldali rögzítés révénvese-pedicles. Összesen 20 mg/ttkg MCC950-et (NLRP3 inhibitor) adtunk intraperitoneálisan naponta 14 napon keresztül a műtét előtt.Veseszövetet és vért vettünk az I/R modell egerekből, hogy elemezzük az NLRP3 és Nrf2 mRNS expressziós szinteket, az NLRP3, PYD és CARD domént tartalmazó, kaszpáz-1, IL-1, Nrf2 és hem oxigenáz 1 fehérje expressziós szinteket, sejt apoptózist, a tumor nekrózis faktor-, IL-1 és IL-6 citokinek szekrécióját ésvese-kórszövettan és funkció.VeseAz I/R aktiválta az NLRP3 és Nrf2 jelátviteli útvonalakat. Ezzel szemben az MCC950 kezelés gátolta az NLRP3 jelátviteli útvonal aktiválódását, és megakadályozta az I/R által kiváltottvesekárosodás, a citokinek felszabadulása és az apoptózisvese-I/R modell egerek. A nátrium-hidroszulfid (NaHS) nemcsak enyhítette az NLRP3 fehérje expressziós szintjének emelkedését, hanem enyhítette isvese sérülés,a citokinek felszabadulása és a vese I/R által indukált sejtapoptózis vad típusú egerekben, de nem a Nrf2-KO egerekben. A NaHS enyhítette az NLRP3 gyulladásos aktivációját,vese sérülés,gyulladásos válasz és sejt apoptózis a Nrf2 jelátviteli útvonalon keresztül vese I/R modell egerekben.
A CISTANCHE JAVÍTJA A vese-/veseelégtelenséget
Bevezetés
A vese ischaemia/reperfúzió (I/R) az akut kórképek vezető okavese sérülésalatt jellemzően előforduló (AKI).vese-műtét, és hajlamosítja az egyéneket több szervrendszer súlyos működési zavarára. I/R-indukált sejthalál és belső gyulladásvese-szövet összetett patofiziológiai folyamatokhoz kapcsolódik, és elősegíti a hanyatlástveseműködés,ezáltal az anyagcsere salakanyagok felhalmozódásához (1). Az ischaemia által kiváltottvese-szövetkárosodás esetén a reperfúzió egy összetett patofiziológiai kaszkádot is elindít, amely a szabad gyökök túlzott felszabadulásával és a gyulladásos sejtek felhalmozódásával jár, ami ezt követően elősegíti a gyulladást, és tovább súlyosbítja a helyi ischaemiát és sejtkárosodást (2).
A nukleotidkötő domén alcsaládjai és a leucinban gazdag ismétlődést tartalmazó család kulcsszerepet játszanak a gyulladásos válasz kialakulásában (3). Az NLR család pirindoménje 3 (NLRP3) gyulladásos domént tartalmaz (korábban NACHT, LRR és PYD doménként ismerték, amely protein 3-at és kriopirint tartalmaz) a mai napig a legjellemzőbb gyulladás. Egyre több tanulmány számolt be összefüggésről az NLRP3 és azrenal I/R. Az AKI-ban az NLRP3 részt veszvese-I/R sérülés (4,5). Például az NLRP3 és az adapter PYD és CARD tartományt tartalmazó (ASC) leütése enyhíti az I/R-indukáltvese-diszfunkció és a neutrofilek túlzott beáramlásaveseszövet(6). Ezenkívül az NLRP3 és/vagy a kaszpáz-1 leütése megvédi az egereket a szepszis vagy lipopoliszacharid által kiváltott AKI-től (7,8). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az NLPR3 gyulladás kulcsszerepet játszhat a patogenezisbenvesekárosodás.
A Nrf2 egy endogén antioxidáns gén, amely a citoszolban található, és a Kelch-szerű ECH-asszociált fehérjével 1 (Keap) kombinálódik. Aktiválása után az Nrf2 felszabadul a Keepből, és áthelyeződik a sejtmagba, ahol ezután kötődik az antioxidáns válaszelemekhez, hogy elindítsa a downstream antioxidáns és citoprotektív célgének, például szuperoxid-diszmutáz, kataláz, glutation-peroxidáz, glutation-S-transzferáz transzkripcióját. izoenzimek, a -glutamil-cisztein ligáz és a NADP(H) katalitikus és módosító alegységei: kinon-oxidoreduktáz (9). Korábban beszámoltak arról, hogy az Nrf2 környezeti inzultus, ischaemia vagy xenobiotikumok által kiváltott AKI-vel társul (10). A szövetkárosodásban betöltött védő szerepe mellett korábbi tanulmányok azt is kimutatták, hogy az Nrf2 túlzott expressziója elnyomja az NLRP3 gyulladásos aktivitását és javítja a szövetkárosodást (11-13). Azonban az Nrf2 jelátviteli útvonal mögött meghúzódó mechanizmus és annak hatása az NLRP3 gyulladásos aktiválódásáravese-Az I/R ismeretlen marad.A hidrogén-szulfid (H2S) elismerést nyert az emlősök homeosztázisának és alapvető sejtfolyamatainak szabályozására, mint például az autofágia (14). Számos tanulmány beszámolt arról, hogy a H2S védő szerepet tölt be az apoptózis, az oxidatív stressz és a gyulladás ellen.vesekárosodás(15-20). Ennek ellenére a H2S mögöttes védőmechanizmusa azvesekárosodásindukálta I/R továbbra is ismeretlen. Ezért a jelen tanulmány az NLRP3 és adaptere, az ASC expressziós szintjét vizsgálta vese I/R modell egerekben, majd meghatározta az Nrf2 hatását az NLRP3 expresszióra. A jelen tanulmány célja annak meghatározása is volt, hogy a H2S véd-eveseszövetellenvese sérülés,gyulladás és apoptózis a Nrf2 által közvetített NLRP3 gátláson keresztül.
Kulcsszavak:vese ischaemia/reperfúziós sérülés, Nrf2, hidrogén-szulfid, apoptózis, vesekárosodás; veseelégtelenség
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEBETEGSÉGET
Anyagok és metódusok
Vese I/R modell és kezelési csoportok kialakítása.Összesen 24 hím vad típusú egeret (súly, 20-25 g; életkor, 6-8 hetes) szereztünk be a Katonai Orvostudományi Akadémia Laboratóriumi Állatközpontjától (Peking, Kína). Ezenkívül kilenc Nrf2-knockout (KO) hím egeret (tömeg, 20-25 g; életkor, 6-8 hetes) szereztünk be a Junke Biological Co., Ltd.-től. Az összes állatkísérletet jóváhagyta az Állatgondozási és -használati bizottság A Tiencsin Orvosi Egyetem Általános Kórháza (jóváhagyási szám: IRB2020-DW-04; Tianjin, Kína), és minden erőfeszítést megtett az állatok szenvedésének és a felhasznált állatok számának minimalizálása érdekében. Az egereket a kísérlet előtt 3 napig 22°C-on 40-60 százalékos páratartalom mellett, 12 órás világos/sötét ciklussal, valamint vízhez és rágcsálótáphoz való szabad hozzáféréssel hozzászoktattuk a környezethez. Miután az egereket intraperitoneálisan (ip) 50 mg/kg nátrium-pentobarbitállal elaltattuk, a kétoldalivese-a kocsányokat 30 percig ligáljuk mikroaneurizma bilincsekkel. Ezt követően a mikroaneurizma kapcsokat eltávolítottuk. A kontrollcsoportban a műtétet ugyanazzal az eljárással végezték; azonban,vese-a kocsányokat nem kötözték le. A műtétet követően 0,9 százalékos nátrium-klorid-oldatot használtak az egerek felépülésének elősegítésére. Az egereket ezután 24 órás reperfúziót követően leöltük. Összesen 24 vad típusú egeret véletlenszerűen a következő hat csoportba osztottak: i) Kontroll (Con) csoport (n=9); ii) I/R csoport (n=9); iii) I/R plusz MCC950 csoport (n=3); és iv) I/R plusz NaHS csoport (n=3). Összesen kilenc Nrf2-KO egeret véletlenszerűen a következő három csoportba osztottak: i) Con-csoport (n=3); ii) I/R csoport (n=3); és iii) I/R plusz NaHS csoport (n=3).
Korábbi kutatások és előzetes kísérletek (21,22) szerint 20 mg/kg MCC950-et (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) injektáltak (ip) naponta 14 napon keresztül a műtét előtt az I/R plus MCC950-ben. csoport. Összesen 50 µmol/kg nátrium-hidroszulfid [NaHS; ip; normál (0,9 százalékos) sóoldattal hígítva; Sigma-Aldrich; Merck KGaA] injekciót kapott a műtét előtt az I/R plusz NaHS csoportban. Miután minden kísérleti eljárás befejeződött, az egereket nyaki diszlokációval leöltük, és szövetet és vért gyűjtöttünk a későbbi elemzéshez.
Western blot. VeseszövetI/R modell egerekből gyűjtöttük össze 24 órás reperfúziót követően a fehérje expressziós szintjének elemzésére. Röviden, a teljes és a nukleinsav fehérjét RIPA pufferrel (Thermo Fisher Scientific, Inc.) extraháltuk, és a fehérjekoncentrációt BCA Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.) segítségével határoztuk meg. Sávonként összesen 40 µg fehérjét választottunk el 10 százalékos SDS-PAGE-val, és polivinilidén-difluorid membránokra vittük át, majd 5 százalékos tejjel blokkoltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. A membránokat ezután a következő elsődleges antitestekkel inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on: Anti-NLRP3 (1:500; katalógusszám: ab214185; Abcam), anti-ASC (1:200; kat. sz. sc-514414; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-kaspáz-1 (1:200; kat. sz. sc-56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-IL-1 (1:1, 000; kat. . sz. ab200478; Abcam), anti-Nrf2 (1:1, 000; kat. sz. ab137550; Abcam), anti-hem oxigenáz (HO)-1 (1:2, 000 ; kat. sz. ab68477; Abcam), anti-aktin (1:2, 000; kat. sz. ab8227; Abcam) és anti-hiszton H3 (1:2, 000; kat. . sz. ab176842; Abcam). Az elsődleges antitest-inkubálást követően a membránokat a megfelelő HRP-vel konjugált másodlagos antitestekkel (1:5, 000; kat. sz. ab6721 és ab6728; mindkettő Abcam) inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A fehérjesávokat fokozott kemilumineszcenciás kittel (Thermo Fisher Scientific, Inc.) tettük láthatóvá Bio-Imaging rendszer (Bio-Rad Laboratories, Inc.) segítségével, és félig kvantifikáltuk Quantity One (V4.6) szoftverrel (Bio-Rad Laboratories). , Inc.). A fehérje expressziós szinteket citoplazmafehérje esetében -aktinra, nukleinsav fehérje esetében hisztonra normalizálták.
Fordított transzkripció – kvantitatív(RT-q)PCR.Veseszövet24 órás reperfúziót követően I/R modell egerekből gyűjtöttük össze az mRNS expressziós szintjének elemzésére. Röviden, a teljes RNS-t TRIzol® reagenssel (kat. szám: 15596026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) extraháltuk a szövetből. A teljes RNS-t reverz transzkripcióval cDNS-vé írtuk át RevertAid First Strand cDNS Synthesis készlettel (kat. szám: K1621; Thermo Scientific™; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a gyártó protokollja szerint. A qPCR-t ezt követően SYBR PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) segítségével hajtottuk végre egy 7500 Real-Time PCR rendszeren (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). A termociklusos körülmények a következők voltak: Denaturálás 95 °C-on 5 percig; 40 ciklus 95 °C-on 15 másodpercig; és hosszabbítás 60°C-on 20 másodpercig. A génspecifikus primer szekvenciákat az I. táblázat tartalmazza. A célgének relatív expressziós szintjeit a 2-ΔΔCq módszerrel (23) számítottuk ki, és a GAPDH expressziós szintekre normalizáltuk.
Immunhisztokémia (IHC). VeseszövetI/R modell egerekből gyűjtöttük össze 24 órás reperfúziót követően, hogy meghatározzuk az NLRP3 és Nrf2 expressziós szinteket. Röviden,veseszövetet szobahőmérsékleten fixáltuk 48 órán át 10 százalékos formalinban, paraffinba ágyaztuk és 5 µm-es metszetekre vágtuk. A metszeteket ezt követően 5 százalékos tejjel blokkoltuk 37 °C-on 30 percig, és anti-NLRP3-mal (1:100; katalógusszám: ab214185; Abcam) vagy anti-Nrf2-vel (1:200; katalógusszám ab137550); Abcam) elsődleges antitestek egyik napról a másikra. Az elsődleges antitest-inkubálást követően a metszeteket HRP-vel jelölt nyúl elleni másodlagos antitesttel (1:200; katalógusszám: ab214880; Abcam) inkubáltuk 37 °C-on 30 percig, amelyet diaminobenzidin oldattal fejlesztettek ki<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;="" keyence="">
Vesefunkció vizsgálat. Összesen 2-3 ml vért gyűjtöttünk 3,000 xg-vel 10 percig 4 °C-on végzett centrifugálást követően I/R modell egerekből 24 órás reperfúziót követően. A szérumot az elemzéshez vettükveseműködésELISA-val a kreatinin (kat. sz. C011; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) és a vér karbamid-nitrogénszintjének (BUN; kat. sz. C013; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) szintjének meghatározására a gyártó utasításai szerint.Vese sérülésA molekula-1 (KIM-1) szintjét a szérumban ELISA-val (kat. sz. EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) mérték a gyártó utasításai szerint.
Hematoxilin és eozin festés.Veseszövet24 órás reperfúziót követően I/R modell egerekből gyűjtöttük össze az értékeléshezvese-kórszövettani változások. A szövetet szobahőmérsékleten 48 órán át fixáltuk 10 százalékos formalinban, majd paraffinba ágyaztuk. A paraffinba ágyazott metszeteket 5 µm vastag metszetekre vágtuk, és szobahőmérsékleten (25 ˚C) 5 percig 0,5 százalékos hematoxilinnel és 3 percig eozinnal festettük. A vérzés, a tubuláris sejt nekrózis, a tubulus dilatáció és a citoplazmatikus vakuólumok szövetben való jelenlétét a következőképpen értékeltük: 0, normálvese;1, minimális sérülés; 2, közepes károsodás; és 3, súlyos károsodás (24).Vese sérülésa pontszámokat vak módszerrel számította ki két kutató fénymikroszkóp alatt (nagyítás, x200; Biorevo BZ-9000; Keyence Corporation).
A TNF-, IL-1 és IL-6 szintek ELISA elemzése. Vért vettünk (1 ml) I/R modell egerekből 24 órás reperfúziót követően. A szérumot 3, 000 xg-vel 10 percig 4 °C-on végzett centrifugálással nyertük. A TNF- (kat. sz. MTA00b), az IL-1 (kat. sz. MLB00C) és az IL-6 (kat. sz. M6000B) szérumszintjét elemezték kereskedelmi ELISA készletek (R&D Systems, Inc.), a gyártó protokollja szerint mikrolemez-leolvasón (kat. sz. CA94089; Molecular Devices, LLC).
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESE FERTŐZÉSÉT
TUNEL festés.VeseszövetI/R modell egerekből gyűjtöttük össze 24 órás reperfúziót követően, hogy kiértékeljük a sejt apoptózisát TUNEL festéssel. Röviden, a szövetet szobahőmérsékleten 48 órán át fixáltuk 10 százalékos formalinban, paraffinba ágyaztuk, és 5 µm vastag metszetekre vágtuk. A metszeteket TUNEL reagenssel inkubáltuk párásított kamrában 37 ˚C-on 60 percig, sötétben (Roche Diagnostics), és szobahőmérsékleten 5 percig DAPI-val festettük. Ezután 10 nagy teljesítményű mikroszkópmezőt véletlenszerűen kiválasztottunk, és mindegyik szakaszban megfigyeltük fluoreszcens mikroszkóppal (nagyítás, 10-szeres).Statisztikai analízis. Az adatokat három kísérlet átlag ± SD-jeként adjuk meg, és GraphPad Prism 5-tel (GraphPad Software, Inc.) elemeztük. A két csoport közötti statisztikai különbségeket páros Student-féle t-próbával elemeztük. A több mint három csoport közötti statisztikai különbségeket egyutas ANOVA-val, majd post hoc Tukey többszörös összehasonlító teszttel elemeztük. Minden adat normális eloszlású volt, és egyenlő szórással. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Eredmények
Az MCC950 kezelés megakadályozza az I/R által kiváltott NLRP3 jelaktiválástvesekárosodásegerekben. Az NLRP3 gyulladásos útvonal aktiválódik, és kulcsfontosságú szerepet tölt bevese sérülés(25,26). Egy korábbi tanulmány arról is beszámolt, hogy az NLRP3 jelátvitel aktiválódik az egerek veseszövetében 24 órával a reperfúzió után (4). Ezért a reperfúzió utáni 24 órát választottuk jelenlegi értékelési időpontnak. Az NLRP3 fehérje expressziós szintjét a vese I/R sérülése fokozta az I/R csoportban a kontroll (Con) csoporthoz képest (1A és B ábra). Hasonló tendenciát figyeltünk meg az NLRP3 mRNS expressziós szintjein (1C. ábra). Ezen túlmenően, az NLRP3-pozitív sejtek száma nőtt az I/R csoportban a Con csoporthoz képest, amint azt IHC festéssel határoztuk meg (1D és E ábra).
Az NLRP3 gyulladásos aktiválódásának mögöttes mechanizmusának és a vese I/R sérülését követő downstream jelátviteli útvonalra gyakorolt hatásának meghatározása érdekében az egereket NLRP3 inhibitor MCC950-el kezeltük. A Western-blot eredmények azt mutatták, hogy az I/R növelte az NLRP3 és adaptere ASC fehérje expressziós szintjét, és elősegítette a pro-kaszpáz-1-ből kaszpáz-1-vé és a pro-IL-1-ből IL-1-vé történő érést az I/R csoportban összehasonlítva a Con csoport (2A-E ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a vese I/R indukálhatja az NLRP3 gyulladásos útvonalat, és az MCC950 kezelés csökkentheti az NLRP3, ASC, kaszpáz-1 és IL-1 expressziós szinteket a vese I/R sérülését követően.
Az NLRP3 gyulladás hatása avesekárosodás, gyulladás és apoptózis vese I/R modell egerekben. Azért, hogy
Az NLRP3 vesekárosodásra gyakorolt hatásának meghatározására az I/R modell egereket az NLRP3 inhibitor MCC950-el kezeltük. A vese I/R modell egerekben szignifikánsan megnövekedett a BUN, a szérum kreatinin és a KIM-1 szintje, amely a vesekárosodás biomarkere (3A-C. ábra), ami a vese I/R károsodás sikeres kiváltását jelzi. Az I/R modell egerek veseszövetének szövettani vizsgálata megnövekedett szövettani pontszámot tárt fel, amit a tubuláris hám súlyos duzzanata, a tubulus dilatációja és intersticiális ödéma, a vakuoláris degeneráció és a kefeszegély elvesztése igazolt, ami arra utal, hogy a vese I/R elősegítheti jelentős veseszövetkárosodás és megnövekedett szövettani pontszám (3D és E ábra). Az NLRP3 MCC950-kezelés általi gátlása jelentősen csökkentette a BUN-, kreatinin- és KIM-1-szintek I/R-indukálta növekedését, és csökkentette a szövettani pontszámot, és a veseszövetben kevesebb súlyosan sérült tubulus volt (3A-E. ábra).
Ezenkívül elemeztük a gyulladásos faktorok és az apoptotikus sejtek szintjét MCC950 beadását követően vese I/R modell egerekben. A gyulladás indikátorai, köztük a TNF-, IL-1 és IL-6, szignifikánsan megemelkedtek az I/R csoportban a Con-csoporthoz képest (3F-H ábra). Ezenkívül a Con-csoporthoz képest az apoptotikus sejtek százalékos aránya szignifikánsan megnőtt a reperfúziót követő 24 órában az I/R csoportban (3I. és J. ábra). Az I/R csoporttal összehasonlítva a citokinek, a TNF-, IL-1 és IL-6 szekréciós szintje, valamint az apoptotikus sejtek százalékos aránya csökkent az MCC950 kezelés hatására az I/R plusz MCC950 csoportban (3F-J ábra). ). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az NLRP3 inflammaszóma gátlása megakadályozhatja a gyulladásos faktorok felszabadulását és a veseszövet I/R által kiváltott apoptózisát.
Az Nrf2 nélkülözhetetlen az NLRP3 gyulladásos aktivitásának vese I/R által kiváltott szabályozásához.Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy az Nrf2 aktiválódik, és az Nrf2 célgének expressziós szintje felfelé szabályozottveseszövetvese I/R sérülését követően (27). Hasonló eredményeket kaptunk a jelen kutatás során is. A Nrf2 nukleáris, összfehérje és mRNS expressziós szintjét a vese I/R sérülése után 24 órával elemeztük. Az eredmények azt mutatták, hogy a Con-csoporttal összehasonlítva az Nrf2 nukleinsav-, összfehérje- és mRNS-expressziós szintje az I/R-csoportban megemelkedett (4A-D. ábra). Ezenkívül az IHC elemzés azt találta, hogy a Nrf2 expressziós szintje a veseszövetben megemelkedett, amit a Nrf2-pozitívok megnövekedett száma igazolt.
az I/R csoportban megfigyelt sejteket (4E. és F. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az Nrf2 jelátviteli útvonal aktiválása védőreakciót indíthat el vese I/R modell egerekben. Annak igazolására, hogy az Nrf2 milyen hatással van az NLRP3 gyulladásos útvonalra a vese I/R-ben, Nrf2-KO egereket használtunk a következő kísérletekben. A Nrf2 fehérje expressziós szintje és célgénje, a HO-1 szignifikánsan lecsökkent a vese I/R után KO egerekben a vad típusú egerekhez képest (5A-C ábra). Ezzel szemben, az I/R vad típusú csoporttal összehasonlítva, az NLRP3 és adaptorának, az ASC-nek, a kaszpáz-1-nek és az IL-1-nek az expressziós szintje az I/R KO-csoportban megemelkedett (5A és D-G ábra). Ezek az adatok azt mutatták, hogy a vese I/R indukálhatja az NLRP3 gyulladást Nrf2-KO egerekben.
A NaHS enyhíti az NLRP3 fehérje expressziós szintjének I/R által kiváltott felszabályozását vad típusú egerekben, de nem az Nrf2-KO egerekben. A NaHS-ről kimutatták, hogy hatással van az Nrf2 expressziójára és az NLRP3 gyulladásos aktiválódására különböző betegségmodellekben (28-30). Jelen tanulmány az expressziós szintek elemzésével azt vizsgálta, hogy a NaHS hatása az NLRP3 útvonal aktiválására az Nrf2 jelátviteli útvonalon keresztül történik-e.Nrf2 és NLRP3 gyulladással összefüggő fehérjék vad típusú és KO egerekben.A vad típusú egerekben a Con-csoporttal összehasonlítva a Nrf2, NLRP3, kaszpáz-1 és IL-1 expressziós szintjeit a vese I/R sérülése szabályozta. Ezenkívül a NaHS-kezelés tovább növelte az Nrf2 expresszióját, és csökkentette az NLRP3, kaszpáz-1 és IL-1 expressziós szinteket az I/R plusz NaHS csoportban az I/R csoporthoz képest (6A-E ábra). Nrf2-KO egerekben nem figyeltek meg statisztikailag szignifikáns különbséget az Nrf2, NLRP3, kaszpáz-1 és IL-1 expressziós szintekben az I/R és I/R plusz NaHS csoportok között (6A-E ábra). Az I/R plusz NaHS csoportban az Nrf2 expressziós szintjei szignifikánsan lecsökkentek, míg az NLRP3, a kaszpáz-1 és az IL-1 expressziós szintjei szignifikánsan megemelkedtek a Nrf2-KO egerekben a vad típusú egerekhez képest. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a NaHS csökkentheti az NLRP3 gyulladásos aktiválódását az Nrf2 jelátviteli útvonalon keresztül vese I/R sérülésben
A NaHS enyhíti a vesekárosodást, a gyulladást és az apoptózist a Nrf2 jelátviteli útvonalon keresztül vese I/R modell egerekben. A NaHS fontos szerepet játszik a vesekárosodásban az AKI, I/R és más betegségmodellekben (31). A NaHS enyhítette a vese I/R-indukálta kórszövettani károsodást, amelyet a tubuláris epiteliális duzzanat csökkenése, a tubulusok tágulása és az intersticiális ödéma, valamintveseszövettani pontszámok az I/R plusz NaHS csoportban a vad típusú egerek I/R csoportjával összehasonlítva (7A és B ábra). A vesefunkció indikátorai, beleértve a kreatinint, a BUN-t és a KIM-1-et, szintén csökkentették a NaHS-kezelést az I/R plusz NaHS csoportban, összehasonlítva az I/R csoporttal a vad típusú betegekben.
egerek (7C-E. ábra). Azonban Nrf2-KO egerekben a NaHS nem tudta csökkenteni a megnövekedett mennyiségetveseszövettani pontszám és a vese I/R által kiváltott vesefunkciós mutatók szintjei. Ezenkívül az apoptotikus sejtek százalékos aránya és a citokinek, a TNF-, IL-1 és IL-6 felszabadulása mind csökkent NaHS-kezelést követően az I/R plusz NaHS-ben.a csoport az I/R csoporttal összehasonlítva vad típusú egerekben (7F-J ábra). A NaHS azonban nem tudott védőhatást kifejteni az apoptózissal és a gyulladásos faktorok túlzott felszabadulásával szemben a veseszövet reperfúzióját követően az I/R plusz NaHS csoportban, a Nrf2-KO egerekben, összehasonlítva az I/R plusz NaHS vad típusú egerekkel (1. 7F-J). Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a NaHS enyhítheti a vesekárosodást, a gyulladást és az apoptózist vad típusú vese I/R egerekben, de nem az Nrf2-KO egerekben.
Vita
A gyulladás az I/R által kiváltott AKI kulcsfontosságú patogén folyamata (4). Az NLRP3 gyulladásos és Nrf2 jelátviteli út részt vesz a gyulladás szabályozásábanvese sérülés(32). A jelen tanulmány kimutatta, hogy az I/R által kiváltott AKI aktiválta az NLRP3 gyulladást, adaptorja, az ASC pedig elősegítette a pro-kaszpáz-1 és a pro-IL-1 érését, valamint felgyorsította a citokinek túlzott felszabadulását és az apoptózist, ami súlyos következményekkel járt. veseműködési zavar. Az NLRP3 gyulladásos gátlása az MCC950 kezeléssel javította a vesefunkciót, a gyulladás szintjét és az apoptózist a veseszövetben. Az NLRP3 aktiválása mellett a vese I/R aktiválta az Nrf2 jelátviteli útvonalat is. Az Nrf2 hiánya azonban a Nrf2-KO egerekben az NLRP3 gyulladásos folyamatának és adapterének további felszabályozásához vezetett. Azt találták, hogy a NaHS-kezelés enyhíti az NLRP3 gyulladásos aktivitását az Nrf2 jelátviteli útvonalon keresztül. Ezenkívül a NaHS-kezelés csökkentette a vesekárosodást, a gyulladást és az apoptózist az NLRP3 gyulladásos aktivációjának Nrf2 által közvetített gátlásával.
A vese I/R sérülése fontos klinikai probléma és elsődleges oka az AKI-nak, ami a krónikus kialakulásának fokozott kockázatához vezet.vesebetegség(33). A gyulladás az ischaemiás sérülés fontos patológiás jellemzője, és az immunsejt-aktiválódás következményeként jelentkezik a kórokozókkal és a károsodással összefüggő molekuláris minták felismerése révén (34). Sőt, korábban arról számoltak be, hogy az NLRP3 gyulladás számos betegségben szerepet játszikvesebetegségeka gyulladás, a piroptózis, az apoptózis és a fibrózis szabályozásával (35). Az NLRP3 inflammaszóma egy fehérjekomplex, amely tartalmazza az NLRP3-at, annak adapterfehérjét, az ASC-t és a kaszpáz-1-et. A kaszpáz-1 a pro-IL-1-et és a pro-IL-18-at érett, aktivált szekréciós formákká hasítja. A különböző patológiák, köztük az ischaemia (33) által kiváltott vesekárosodás aktiválja a gyulladásos komplexumot, fokozza az NLRP3 expresszióját, és elősegíti a pro-IL-1 későbbi érését (36). Az NLRP3 KO kis interferáló RNS felhasználásával egerekben vagy vese tubuláris epiteliális sejtjeiben védőhatást fejt ki az ischaemia vagy a glükóz hiányában a sejtkárosodás által kiváltott veseszövet-károsodás ellen (37). A jelen eredmények azt mutatják, hogy a renális I/R az NLRP3 gyulladás aktiválódását indukálta, míg az NLRP3 gátlása MCC950 használatával jelentősen csökkentette az NLRP3 és az ASC expressziós szintjét, valamint a pro-kaszpáz-1 és pro-IL-1 érését a vese I/R-ben. sérülés modell. Ezenkívül az MCC950 általi NLRP3 gátlás javította a veseműködési zavarokat, csökkentette a kórszövettani sérülést és pontszámot, a citokinek túlzott felszabadulását és az apoptotikus sejtek számát. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az NLRP3 aktiválása kulcsszerepet játszhat a vesekárosodásban, és az NLRP3 gátlása védő hatást fejthet ki a vese I/R által kiváltott szövetkárosodás és diszfunkció ellen.
Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy az Nrf2 részt vesz a gyulladásos válaszban (10-12). Ezenkívül az Nrf2 kulcsfontosságú gyulladáscsökkentő, antioxidáns vagy anti-apoptotikus szerepet tölt be ischaemiás állapotokban. Az Nrf2/antioxidáns válaszelem jelátviteli útvonal aktiválása gyengíti a gyulladást és az apoptózist a ciklofoszfamiddal indukált egerek veseszövetében (38). Egy másik tanulmány kimutatta, hogy a szulforafán általi Nrf2 aktiválása gátolja az NF-κB jelátviteli útvonal aktivitását, ezáltal enyhíti a gyulladást a disztrófiás izomszövetben (39). Ezenkívül az Nrf2 leütése elősegíti az NLRP3 gyulladásos aktiválódását, és az IL-1 aktivációjához vezet egy ischaemia modellben (11). A jelen adatok alátámasztják azokat a megállapításokat, amelyek szerint a renális I/R indukálhatja az Nrf2 jelátviteli útvonalat és a downstream célgének, például a HO-1 expresszióját. A Nrf2-KO egerek tovább elősegítették az NLRP3 gyulladás aktiválódását, ami azt jelezte, hogy az NLRP3, ASC, kaszpáz-1 és IL-1 expressziós szintje megemelkedett a vese I/R modellben. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Nrf2 gátló hatást fejtett ki az NLRP3 gyulladásos aktivációjára a vese I/R sérülésében.
Korábbi kutatások arról számoltak be, hogy aveseH2S-t (40) termel. Ezenkívül a H2S fokozza a vese véráramlását és elősegíti a vese kiürülési funkciójátvese, amit a megnövekedett glomeruláris filtrációs ráta bizonyít (41). Ezenkívül a H2S nemcsak a gyulladást és az oxidatív stresszt enyhíti, hanem döntő szerepet játszik az endothel diszfunkció és a magas vérnyomás szabályozásában is (28). A H2S részt vesz a vesével összefüggő betegségek szabályozásában, mint például az I/R sérülés, valamint az obstruktív és diabéteszes nephropathia (42), azonban a mögöttes mechanizmusok továbbra is kevéssé ismertek. Az NHS-t H2S exogén donorként használták a kutatásokban (43). Jelen tanulmányban a H2S szállítása NaHS formájában történt. A jelen eredmények azt mutatták, hogy a NaHS enyhítette a szövetkárosodást,vesediszfunkció, a citokinek túlzott felszabadulása és a renális I/R által kiváltott apoptózis. Korábban beszámoltak arról, hogy a NaHS az Nrf2 jelátviteli útvonal szabályozásán keresztül megakadályozza a mikroglia aktiválódását és az idegsérülés által kiváltott gyulladást (44). Összhangban azzal a hipotézissel, hogy a NaHS az Nrf2 jelátviteli útvonalon keresztül szabályozza a gyulladást, a jelen eredmények azt mutatták, hogy a NaHS növelte az Nrf2 expressziós szintjét és gátolta az NLRP3 expressziós szintjét vese I/R modell egerekben. Ezenkívül az Nrf2 KO eltörölte a NaHS szabályozó hatásait az Nrf2-re és az NLRP3 gyulladásra. A jelen tanulmány azt is vizsgálta, hogy az Nrf2 milyen szerepet játszik a vesekárosodásban és a vesefunkcióban NaHS-kezelést követően; Az Nrf2 gátlása nem csak részben fordította meg a NaHS védő hatásátvese sérülésés diszfunkció, hanem megfordította a NaHS gátló hatását a vese I/R-t követő gyulladásos válaszra és apoptózisra. Ezek az eredmények azt sugallták, hogy az Nrf2 szükséges lehet a NaHS I/R által kiváltott AKI-re gyakorolt védő hatásához, és a NaHS a Nrf2 által közvetített NLPR3 gyulladásos gátláson keresztül gyakorolhatja védő szerepét a szövetkárosodás ellen. Összefoglalva, az I/R által kiváltott vesekárosodás aktiválta az NLRP3 gyulladásos és Nrf2 jelátviteli útvonalat, és az NLRP3 gyulladás gátlása megvédte a vesekárosodást. Az Nrf2 negatívan szabályozta az NLRP3 gyulladásos aktivációját, és enyhítette a NaHS-tvese sérülésés diszfunkció, apoptózis és gyulladásos válasz a Nrf2 által közvetített NLRP3 gyulladásos gátláson keresztül. Ezek az eredmények újszerű betekintést nyújtanak a vese ischaemiás károsodás kezelésének lehetséges jövőbeli célpontjaiba.