Immungén-expresszió és funkcionális hálózatok a Lupus Nephritis különböző osztályaiban Ⅰ
Nov 08, 2023
ABSZTRAKT
Cél A NanoString platform hasznosságának felfedezésetisztázó veseA III., IV. és V. osztályú lupus nephritis (LN) immuntranszkriptumai retrospektív kohorsz segítségévelformalin fixált paraffinba ágyazott(FFPE) vesebiopsziás szövet.
Módszerek: Az immungén transzkriptum analízisét a NanoString nCounter platform segítségével végeztük LN (n=55), vékony alapmembrán (TBM) betegség (n=14) és membrános nephropathia (MN) (n{) RNS-én. {2}}) FFPEvese biopsziaszövet. Az LN minták egyetlen III (n=11), IV (n=23) és V (n=21) osztályú biopsziából álltak, vegyes elváltozások nélkül. A differenciális génexpressziót a NanoString nSolver programmal végeztük, a vulkánok ábrázolásaival és az R-ben generált hőtérképekkel. Jelentős átiratokat kérdeztünk le a funkcionális hálózatok azonosítására a STRING és a Gene ontogén kifejezések használatával.
KATTINTSON IDE A CISTANCHE VESE SZÁMÁRA TÖRTÉNŐ GYÓGYNÖVÉNYI KÉSZÍTMÉNYÉHEZ KAPCSOLATBAN
Eredmények A TBM-hez képest 52 szignifikánsan eltérően expresszálódó gént azonosítottunk, amelyek mindhárom LN osztályban közösek. Az útvonal-analízis az I. típusú interferon (IFN) jelátviteli, komplement és MHC II jelátviteli útvonalak feldúsulását mutatta, a legtöbb a IV. osztályú LN-ben a legmagasabb expressziót mutatta. A IV. osztályú LN biopsziáink az NF-κB jelátvitel és immunológiai dúsulás szignifikáns növekedését is mutatták az V. osztályú LN biopsziákkal összehasonlítva. Az I. típusú IFN útvonalból származó transzkriptumok megkülönböztették a V. osztályú LN-t az MN-től.
Következtetés A teljes vesemetszet transzkriptomikai elemzésünk betekintést nyújtott a III., IV. és V. osztályú LN molekuláris profiljába. Az adatok rávilágítottak a mindhárom osztályra jellemző fontos útvonalakra, valamint a IV. osztályú LN biopsziáinkban gazdagított útvonalakra. A molekuláris útvonalak feltárásának képessége LN-ben FFPE teljes biopsziás metszetekkel klinikailag hasznos lehet az LN kezelésének kiválasztásában.
BEVEZETÉS
Lupus nefritisz(LN) a szisztémás fontos megnyilvánulásalupus erythematosus(SLE), és a betegek hozzávetőleg 40%-ában alakul ki.1 Prevalenciáját befolyásolja az életkor (magasabb a gyermekkori SLE-ben) és az etnikai hovatartozás (magasabb a nem kaukázusi betegeknél), és fordítottan összefügg a társadalmi-gazdasági státusszal.vese biopsziafontos része az LN3 4 kezelésének, és jelentős erőfeszítéseket tettek annak érdekében, hogy a biopsziában észlelt változásokat összekapcsolják a patogenezissel, a kezelés kiválasztásával és a prognózissal.1 Ehhez kritikus volt egy olyan LN osztályozási rendszer kidolgozása, amely magában foglalta a biopsziás elváltozások szabványosított meghatározásai a jelentések közötti variabilitás csökkentése érdekében.
Az International Society of Nephrology/Renal Pathology Society (ISN/RPS) 2003-as konszenzusos LN5 osztályozása hat osztályt írt le: minimális mezangiális LN (I. osztály); mesangialis proliferatív LN (II. osztály); fokális LN (III. osztály); diffúz LN, amely tovább osztható diffúz szegmentális (IV-S osztály) és diffúz globális (IV-G osztály) proliferatív LN-re; hártyás LN (V. osztály) és előrehaladott szklerotizáló LN (VI. osztály). Az aktív (A, pl. endokapilláris hipercellularitás, fibrinoid nekrózis, sejtes és mikrocelluláris félhold) és krónikus (C, pl. glomeruláris sclerosis, rostos félholdak) glomeruláris elváltozásokat is meghatároztuk és jelöltük a III. és IV. osztály leírásánál. Például a IV-G osztály (A) diffúz globális proliferatív LN-t írt le aktív léziókkal. Javasolták ennek a besorolásnak a frissítését.6 Az ajánlások között szerepelt a IV-S és IV-G osztály felosztásának megszüntetése, mivel ezek nem befolyásolják az eredményt. Egy metaanalízisben bármelyik előfordulásavégstádiumú vesebetegségvagya szérum kreatininszintjének megduplázódásanem különbözött az IV-S és IV-G osztályok között.7 Javasolták az aktív és krónikus leírók helyettesítését az NIH lupus aktivitási és pontozási rendszeréből származó aktivitási és krónikussági indexekkel8, ezáltal lehetővé téve az aktivitás kvantitatív értékelését (a pontszám 0-től 24-ig) és krónikusság (pontszám 0-től 12-ig).
Az LN osztály kritikus fontosságú a menedzsment tájékoztatása szempontjából.3 Immunszuppresszió javasolt az aktív III. és IV. LN-ben, de nem a II. osztályú LN-ben. Az V. osztályú LN-ben az immunszuppresszió megindítására vonatkozó döntést a proteinuria mértéke és a renin-angiotenzin-aldoszteron blokádra adott válasza befolyásolja. Ha a kezelés után 12 hónappal nem sikerül kontrollálni a proteinuriát, az krónikus vesebetegséggé való progresszióval jár 9–11, így a kezelés célja a proteinuria csökkentése a teljes klinikai válasz elérése érdekében.<0.5–0.7 g per 24 hours).
Az LN osztály önmagában kevésbé robusztus az eredmények tájékoztatásában, merta krónikus vesebetegség kialakulásának kockázati tényezőitartalmazzaklinikai szolgáltatásokés mivel olyan hiszto-logikai jellemzőket tartalmaznak, amelyeket az LN osztálydefiníciók nem rögzítenek. Ezek közé tartozik az intersticiális fibrózis és tubuláris atrófia (IFTA) mértéke, valamint a specifikus glomeruláris elváltozások, mint például a fibrinoid nekrózis és a rostos félhold.12 A kiválasztott és jól meghatározott egyedi veseléziók számszerűsítése megalapozhatja a prognózist. Ez nyilvánvaló az IgA nephropathiában, ahol a mezangiális sejtesség, az endokapilláris hipercellularitás, a szegmentális szklerózis, a tubuláris atrófia, az intersticiális fibrózis és a félholdak pontozása a MEST-C pontszámot képezve segíti a kockázat előrejelzését.13–15 Az ISN javasolt módosításai Az LN /RPS 2003 konszenzusos osztályozása orvosolhatja ezeket a hiányosságokat6, de még mindig a morfológia használatán alapul. Következésképpen szükség van a LN-biopsziákon belüli molekuláris útvonalak tanulmányozására, és annak megértésére, hogy ezek hogyan kapcsolódnak az LN-osztályokhoz16 17 és a kezelési eredményekhez.18 19 A klinikai hasznosság szempontjából a vesebiopsziák transzkriptomikus elemzése a legfontosabb előrehaladott az antitestek által közvetített vesekilökődés diagnosztizálásában, ahol a géntranszkriptumok expressziójának növekedését a biopsziás szövetben – a validálásig – hozzáadták a validált morfológiai kritériumokhoz.20 A transzkriptomikai adatok felhasználásának hasznosságának meghatározása a vese klinikai használhatóságának javítására. biopszia SLE-ben, NanoString technológiát használtunk 750 immunrendszerrel és gyulladással kapcsolatos transzkriptum expressziójának tanulmányozására 55 LN-biopsziából származó, 55 LN-biopsziából származó, 14 vékony alapmembrán (TBM) és 9 biopsziában. membranosus nephropathia (MN).
MÓD
Minták: Az FFPE vesebiopsziás szövetet archivált LN, TBM és MN mintákból vettük fel, amelyek klinikai felhasználásra kerültek, és ahol megfelelő szövet állt rendelkezésre az elemzéshez. A vegyes elváltozásokat vagy jelentős hegesedést mutató lupus biopsziát kizárták. A TBM-et betegségkontrollként használták, mivel nem álltak rendelkezésre normális vesebiopsziák. A klinikai paramétereket visszamenőleg gyűjtöttük össze az egészségügyi nyilvántartásokból. Az interferon (IFN) pontmátrixot a korábban közölt módon kaptuk meg.21 A teljes választ a vizelet fehérje/kreatinin arányaként (uPCR) határoztuk meg.<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20% 1 évvel a biopszia után. A részleges választ uPCR-ként határoztuk meg<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.
RNS extrakció
Hat 10 μm vastag teljes szövetmetszetet kaptunk mikrotommal minden FFPE blokkból, két 4 μm-es metszet eltávolítását követően. A keresztszennyeződés elkerülése érdekében a berendezést RNase Away-vel tisztítottuk a minták között, és minden mintához friss pengét használtunk. A teljes szövet RNS izolálását ugyanazon a napon végeztük az RNeasy FFPE Kit (Qiagen, #73504) segítségével, és az RNS-koncentrációt NanoDrop ND1000 spektrofotométerrel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; online kiegészítő adat S1) értékeltük.
Transzkriptom elemzés
Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >duplája (átlag+2 SD) negatív kontrollpróbák. A számokat 10 háztartási gén (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB és ZC3H14) geometriai átlagára normalizáltuk, és úgy választottuk ki, ahogyan az összes mintatípusban kifejeződött. Az összes minta normalizált számait az S2 online kiegészítő adat tartalmazza.
Statisztikai analízis
A differenciális génexpressziót (DGE) a Solver Advanced Analytics (V.4) Fast/Approxi mate algoritmussal végeztük, amely az egyszerűsített negatív binomiális modellt használja minden próbára, kivéve, ha az algoritmus nem konvergál, és a lineáris regressziós módszert alkalmazzák. Független változóként az LN-t, MN-t vagy az LN osztályt (III., IV. és V.), referenciacsoportként pedig a TBM-et használtuk. A küszöbértéket 100-ra, a mintákon belüli megfigyelési gyakoriságot pedig 8%-ra állítottuk be; A P értéket a Benjamini-Hochberg módszerrel korrigáltuk, a hamis felfedezési küszöbértékkel a következőre van beállítva: 0.05. A vulkándiagramok az Enhanced Volcano csomag (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) segítségével készültek az R.22-ben. A funkcionális fehérje-asszociációs hálózat vizualizációját a STRING adatbázis használatával (https://string-db.org/) végeztük. , a teljes STRING hálózat használatával. A hálózat széleit a bizalom határozza meg, és az interakciókat a legmagasabb megbízhatósági interakciós pontszámra állítottuk be (0,9 vagy nagyobb). A hálózaton belüli leválasztott csomópontok nem jelennek meg. A szignifikánsan eltérően expresszált géneket értékelték a génontológia (GO) kifejezések (biológiai folyamatok, molekuláris funkciók, sejtkomponens), a reakcióútvonalak és a STRING helyi hálózati klaszterek gazdagítása szempontjából. Vizuális interakciós hálózatokat hoztak létre funkcionális dúsításokkal a GO kifejezésekben (biológiai folyamatok) és a STRING elemzésben. Az LN alosztályok közötti átfedő, differenciálisan expresszált gének területarányos Venn diagramja a BioVenn segítségével készült (www.biovenn. nl).23 A fejlett elemzési megoldószoftver adatait beolvastuk az R statisztikai környezetbe, és az adatok megjelenítését boxplots, főkomponens-analízis, vulkánparcellák és hőtérképek. A hőtérképeket a normalizált számlálások Z pontszámainak és az R-ben lévő pheatmap felhasználásával állítottuk elő. A klasztereket Fisher-féle egzakt teszttel elemeztük. A Sidak-féle többszörös összehasonlítási teszttel végzett varianciaanalízist több csoport összehasonlítására használtuk. Az adatokat GraphPad Prism (V.8.0) segítségével elemeztük.
A betegek és a nyilvánosság bevonása (PPI) nyilatkozata
Ez a tanulmány a MASTERPLANS konzorcium része volt, és a betegek munkatársai minden munkaterületen részt vettek, beleértve ezt a tanulmányt is. A PPI terminusszószedetet készített, hogy lehetővé tegye a szélesebb betegközösséggel való további kapcsolatfelvételt, és a kutatási eredményeket a laikus felülvizsgálati napokon is figyelembe vették. A publikációkat a MASTERPLANS honlapján (https://sites.manchester.ac.uk/masterplans) osztják meg.
A Wecistanche támogató szolgáltatása – Kína legnagyobb ciszterna exportőre:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel.:+86 15292862950
Vásároljon további specifikációkért:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
