Az immunstimuláló antitest-konjugátumok erőteljes mieloid aktivációt és tartós daganatellenes immunitást váltanak ki (2. rész)

További információért kérem vegye fel a kapcsolatotdavid.wan@wecistanche.com

Vita:

Az itt bemutatott eredmények meggyőző bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy az ISAC-t a tumor immunterápia új technológiájaként támogatják. Az ISAC-ok in vitro modellezése kimutatta, hogy képesek az elsődleges humán mieloid APC-ket Fc R- és TLR-függő módon aktiválni, és az egér OVA-modellrendszer segítségével fokozni az antigén-kereszt-prezentációt. A CD40 kostimuláló molekula felszabályozása révén történő aktiválódást nem csak in vitro figyelték meg, hanem a tumorban élő mieloid APC-ken is megfigyelték mind a xenograft, mind a szingenikus tumormodellekben. A tanulmány egyik szembetűnő megállapítása az volt, hogy a TLR agonista kovalens kötődése egy A tumorra célzott monoklonális antitest ISAC formájában megváltoztatta az immunstimuláló eredményt és az általános hatékonyságot, amely általában a TLR agonistáknál várható. A trastuzumab T785-tel kombinált lokális bejuttatásának összehasonlítása a T785-ISAC szisztémás bejuttatásával azt mutatta, hogy csak az ISAC volt sikeres a tumorterhelés csökkentésében. A keverék helyi adagolása nem járt előnyökkel a HCC1954 tumor xenograft modellben, a hatások hasonlóak voltak, mint a trastuzumab önmagában. Ez a megállapítás alátámasztja, hogy nem csak a helyi bejuttatás, hanem az antitest és a TLR agonista egyidejű bejuttatása is elengedhetetlen az ISAC-val megfigyelt terápiás hatékonysághoz. A HCC1954 tumorxenograft modellben generált mechanikai adatok azt mutatták, hogy az Fc R és a TLR kapcsolat in vivo szükséges a hatékonysághoz, mivel sem a TLRnull-ISAC, sem az Fc-inaktív ISAC nem tudta szabályozni a tumor növekedését. Ezenkívül az ISAC-ok szisztémás beadása tartós daganatellenes hatékonyságot eredményezett patkány HER2 plusz szingenikus tumormodellekben és humán HER2 plusz emlőrák xenograftokban, amelyek rezisztensek voltak a nem konjugált antitesttel végzett kezelésre. A HER2-t választották a preklinikai in vivo vizsgálatok célantigénjeként, mivel a lokálisan előrehaladott vagy áttétes emlőrákban szenvedő betegek neoadjuváns, adjuváns és első vonalbeli terápiájában a HER{16}}célzott antitestek dominálnak, amelyeket nem az immunrendszer stimulálására terveztek. rendszer és a jóváhagyott T-sejt-ellenőrzési pont inhibitor blokkoló antitestek minimálisan hatékonyak ezeknél a betegeknél. Ezeknek a betegeknek előnyösek lehetnek az ISAC-k, amelyek megőrzik a kiindulási antitestek funkcionalitását, és jelentős immunstimuláló potenciállal rendelkeznek. Mint minden immunterápiás szer esetében, fennáll a lehetőség a gyógyszerellenes antitestek előállítására vagy súlyosbítására, és az ISAC esetében végső soron a kiindulási antitest immunogenitásától függhet. Ezeket a felméréseket klinikailag lehet a legjobban elvégezni, és a trastuzumab ideális lehet a vizsgálatokhoz, mivel a Herceptin™ immunogenitási aránya a betegeknél kevesebb, mint 1 százalék. Az antitest és az adjuváns egyidejű bejuttatásának szükségességét bizonyító in vivo adatokat tovább támasztják azok a munkák, amelyek részletezik az ISAC aktivitást szabályozó intracelluláris jelátvitelt egyidejű Fc R és TLR jelátvitel révén. Míg a további vizsgálatok tovább tisztázhatják az intracelluláris ISAC jelátviteli dinamikát, az itt ismertetett tanulmányok rávilágítanak a TLR agonista antitesthez való konjugálásának lehetséges jelátviteli előnyeire, amint az jellemzően megfigyelhető, amikor az antitestek kórokozókkal lépnek kapcsolatba a védő immunitás során. Az intracelluláris jelátvitel CyTOF-alapú elemzése humán PBMC-ket alkalmaztakmegérteni és megkülönböztetni a keverék és az ISAC aktivitását. Az eredmények felerősítették az ISAC-stimulációt követő aláírást az egyes komponensek keveréke által kiváltotthoz képest, ami tovább támogatja az aktivitás fokozásának lehetőségét az antitest és a TLR agonista kémiai konjugációja révén. Míg az ISAC-ok TLR7 és TLR{1}}specifikus ereje nem mérhető HEK293 riportersejtekkel, a bemutatóAz IRF-7 ISAC-indukálta foszforilációja aktív TLR7/8 agonizmusra utal, mivel az IRF-7 köztudottan a TLR7 és TLR8 MyD88-vezérelt jelátvitel 30-as áramlási irányában található. Az adatok azt mutatják, hogy a Az ISAC nemcsak a TLR- és FcR-útvonalakhoz kapcsolódó kanonikus útvonalak fokozott jelátvitelét váltja ki, hanem csökkenti a páronkénti aktiválási küszöböt is, amely a downstream jelátviteli fehérjék, például a riboszómális S6 fehérje foszforilációjának kiváltásához szükséges, amely a fehérje transzláció kulcsfontosságú szabályozója a sejtben. Magas DREMI pontszámok, különösen mérvemonocitákban és DC-kben is támogatják az ISAC-val történő stimuláció által kiváltott erős feltételes függőséget, amely a keveréknél nem látható. Ez a jelenség lehetelősegítik az endoszómán belüli receptorok bőségében, lokalizációjában és/vagy rekrutációjában bekövetkező intracelluláris változások, de további vizsgálatok szükségesek a pontos mechanizmus megerősítéséhez. Fontos, hogy a DREMI-elemzés az ISAC-stimuláció eredményeként ismert jelzőpartnerekkel konzisztens kapcsolatokat azonosított. Ismert gátló hatása révénszerepe volt a kanonikus NF-κB jelátvitelben 49, csökkent függőséget figyeltünk meg (azaz a DREMI pontszámot)A pIRF7 és a kappa B (IκB) inhibitora között, amikor a mieloid sejteket ISAC-vel stimuláltuk. Ezek az eredmények együttesen támogatják az ISAC stimuláció utáni megfelelő jelátviteli útvonal molekulákon keresztüli felerősített és tartós intracelluláris választ, a TLR és az Fc R-hez kapcsolódó jelátviteli utak közötti szinergia mellett.

Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni Cistanche-ról

Eredményeink azt mutatták, hogy a funkcionális Fc-Fc R kölcsönhatások elengedhetetlenek a mieloid APC-k ISAC által közvetített aktiválásához. A természetes IgG1 Fc, amely a legnagyobb affinitással rendelkezik a természetben létező IgG izotípusok aktiváló Fc Rs-ei iránt, jobb volt, mint a többi IgG izotípus, amelyek kisebb affinitással rendelkeznek az aktiváló Fc R-ek iránt. Az Fc-Fc R kölcsönhatás további fokozása fukoziláció révén fokozta a hatékonyságot, míg az Fc-Fc R kölcsönhatás glikoziláció révén történő csökkentése csökkentette a potenciát. Ahogy az várható volt, a Syk jelátvitel az Fc R kapcsolódás után a későbbi TLR agonizmus mellett szükséges volt ahhoz, hogy az ISAC-k maximális stimulációt váltsanak ki. Ezeket a megállapításokat alátámasztják azok a vizsgálatok, amelyek a mieloid stimuláció drámai fokozódását mutatják a lemezhez kötött IgG-vel és a TLR agonistával, a PAM3CSK 50-nel történő együttes stimulációt követően. Arra is utalnak, hogy kiterjedtebb Fc-keresztkötés alakul ki a célsejt felszínén vagy az in vitro lemezeken belül. , előfordulhat, vagy differenciális jelzőhálózatok kapcsolódnak be, az ISAC stimulációt követően, szemben az összetevők keverékével. Az ISAC platform in vivo transzlációját először humán HER2 plusz tumorsejtvonalakkal értékelték olyan egerekben, amelyekből hiányoztak a teljesen működőképes B-, T- és NK-sejtek. Figyelemre méltó, hogy a trastuzumab ISAC szignifikánsan hatékonyabb volt, mint a trastuzumab több különböző HER2 expressziós szinttel rendelkező daganat esetén. Továbbá az adatok azt mutatták, hogy az ISAC daganatellenes hatása függ a tumor-célzástól, mivel az izotípus-ISAC nem volt képes a tumor regresszióját és kiürülését indukálni. Míg az in vitro modellezés kimutatta, hogy az ISAC hatékonyságának lehetővé tételéhez a TLR és az Fc R aktivitásra van szükség, az ilyen modellek nem voltak sikeresek az ISAC antigén-célzástól való függőség mérésében. Nem mértek különbséget a célzott és a T785-izotípusú ISAC-ok között egészséges humán mieloid APC-kkel együtt tenyésztett lemezes tesztekben.daganatsejtekkel (az adatokat nem mutatjuk be).Az in vitro mért cél-dependencia hiánya több tényezőnek tudható be: a mieloid APC-kről azt találták, hogy in vitro tenyésztést követően felszabályozzák az Fc R-t a sejtfelszínen, ami fokozhatja az oldható IgG FcR-hez való kötődési képességét, ami felerősített jel az ISAC izotípusból.Ráadásul a kulturáltrendszerből hiányzik az endogén IgG és további in vivo jelenlévő szérumfaktorok, amelyek versenyezhetnek az FcR-ért in vivo, és tompíthatják az ISAC izotípusú hatásokat.Mindazonáltal az in vivo modellek kimutatták, hogy az ISAC a daganatellenes hatékonyság szempontjából a tumor-célzásra támaszkodik.A hatékonysági vizsgálatok során nemcsak az ISAC-izotípusok mutattak csekély hatást a tumornövekedésre, de azt is kimutatták, hogy nem indukálnak hatást a tumorok genetikai szintjére, amint azt a xenograft és a szingenikus tumormodellek mutatják.Amellett, hogy in vivo kimutatta a célfüggő hatékonyságot, a T785-ISAC-t az állatok tolerálták, és minimális súlycsökkenést indukált, ami kevés jelét mutatta a célon kívüli hatásoknak és a nemkívánatos eseményeknek az egérben.Ezek az adatok továbbá alátámasztják a szisztémás úton beadott tumor-célzó ISAC azon képességét, hogy eljut a daganathoz, és lokalizált gyulladáskeltő daganatellenes választ indukál.

A mieloid sejt által közvetített effektor funkciók fontosságát sejtkimerítő vizsgálatokban mutatták be, amelyekben a fagociták klodronát-kiürülése megszüntette az ISAC tumorclearance-t indukáló képességét.Érdekes módon bár a tumorok kezdetben visszafejlődött a Gr1 pozitív sejtek kimerülése után, a daganatok később kinőttek.Ez a jelenség a fagocita prekurzorok, például a monociták kimerülésének eredményeként következhetett be, amelyek később funkcionális és érett fagocita sejtekké differenciálódhattak 51.További molekuláris és sejtszintű betekintést nyertünk az mRNS-szintek és az ISAC-kezelést követő változások számszerűsítéséből.Ezeket az adatokat az immunhisztokémia és a fehérje mennyiségi meghatározása is megerősítette, jelezve, hogy mieloid sejtek infiltrálódnak a daganatba.gyulladást elősegítő citokin TNF és mieloid kemoattraktánsok CCL2 (MCP-1) és CCL4 (Mip1b) termelésével.

2. ábra: Az ISACS különböző jelátviteli mintákat vált ki mieloid APC-kben. (ad) A frissen izolált humán PBMC-ket 1 μM rituximab-ISAC-vel vagy a keverék ekvimoláris ekvivalensével stimuláltuk CD20 plusz Toledo tumorsejtek jelenlétében 1:1 arányban. arányban 15 percig. (a) Az ISAC jelátvitelhez viszonyított medián arcsinh arányát különböző foszfoproteinek keverék-stimulációját követően mértük, amint azt a hőtérkép ábrázolja, a sárga a fokozott jelátvitelt, a kék pedig a csökkent jelet. (b) Reprezentatív áramlási citometriai diagramok a pIRF7 és pRPS6 számára monocitákban és cDC-kben. (c) Az indukált jelátviteli változást a nem stimulált kontrollhoz viszonyított arcsinh arányként számítottuk ki. Az IRF7 és ERK1/2 foszforilációt monocitákban és cDC-kben mértük ISAC vagy keverék stimulációt követően. Az adatok egy kísérletből származnak hat donorral (átlag és SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><0.0001. (d)="" representative="" drevi="" plots="" following="" dremi="" analysis="" with="" the="" area="" under="" the="" curve="" (auc)="" and="" inflection="" point="" (ip)="" denoted.="" drevi="" plots="" were="" visually="" inspected="" for="" curve="" fit="" and="" signal-to-noise,="" and="" inflection="" points="" were="" calculated="" for="" those="" with="" proper="" sigmoidal="" curve="" fits="" (n/a="" indicates="" no="" curve="">

A CCL2 és CCL4, CCR2 és CCR5 receptorok monocitákon, illetve makrofágokon expresszálódnak, ami arra utal, hogy ezek a sejttípusok toborozhatók az ISAC-kezelt daganatokhoz.Ezenkívül a Cxcl9 és Cxcl11 mRNS, amelyek T-sejt-specifikus kemokineket kódolnak, és amelyeket a DC-k expresszálnak a TME-ben, szintén felszabályozták a trastuzumab ISAC-kezelést (23. kiegészítő ábra) 52,53.Egy megnövelt hatású trastuzumab ISAC, amely a CL264 agonistát alkalmazta, fokozott hatékonyságot mutatott a kevésbé HER2-t expresszáló tumormodellekben.Ez azért fontos, mert azoknak a betegeknek, akiknek daganatai alacsony HER2-t expresszálnak, korlátozottabbak a kezelési lehetőségei, és nem jogosultak trastuzumab vagy más trastuzumab tartalmú terápiákra.Körülbelül 5-10 százalékos átmeneti súlycsökkenést és megnövekedett szisztémás TNF-szekréciót figyeltek meg a célzott és izotípusú CL264-ISAC-okkal egyaránt kezelt állatoknál, ami a robusztus anti-ellenes hatáson túlmenően a lehetséges célon kívüli hatásokra utal. tumoraktivitást figyeltek meg.A xenograft modellekben bemutatott kollektív adatok azt sugallják, hogy az ISAC által közvetített fagocitózis hatékony mechanizmus a daganatok eliminálására, de ez a mechanizmus fokozódhat a tumor neoantigének antigén prezentációja után a T-sejteknek immunkompetens gazdaszervezetekben.Ebből a célból az ISAC-ok azon képességét, hogy elősegítsék a daganatellenes immunitást vad típusú egerekben, anti-rHER2 ISAC-okkal vizsgálták két különböző változatban.rHER2-szingenikus modelleket (MMC és CT26-rHER2) kifejező. Mind a T785-öt, mind a CL264-et tartalmazó ISAC-okat a szingén MMC-modellben értékelték, tekintettel az rHER2 magas antigénexpressziójára, mivel mind az alacsonyabb, mind a nagyobb potenciájú ISAC-kről azt feltételezték, hogy hatékonyak magas antigénsűrűséggel a tumorsejtben. Mindkét rHER2 ISAC a tumor teljes kiürüléséhez vezetett az MMC modellben nagy daganatokat (350-950 mm3) hordozó állatokban, míg a nem konjugált antitest nem tudta szabályozni a tumor növekedését. Az mRNS-transzkriptumszintek elemzése az MMC-modellben drámai elmozdulást mutatott ki a szabályozás szabályozásábansok gén a megcélzott rHER2 T785-ISAC-kezelést követő 24 órában az rHER2 antitesthez vagy az ISAC izotípushoz képest, beleértve a mieloid sejtbiológiában, a TLR biológiában és az adaptív immunválaszokban részt vevő géneket is. A CD11c-t és F4/80-expresszáló sejtek fokozott infiltrációját észlelték immunhisztokémiával, hasonlóan a HCC1954 xenograft tumormodellben tapasztalt tendenciához. Továbbá CD8 T-sejt-infiltrációt figyeltek megimmunhisztokémia, amely támogatja az adaptív immunválasz kialakulását az ISAC-kezelést követően.

Amellett, hogy a fagociták fontosak a xenograft modellben, az MMC szingén tumormodellben végzett depléciós vizsgálatok erős fagocitáktól való függést mutattak ki, mivel a klodronáttal töltött liposzómák használatával történő kimerülés leállította az ISAC által közvetített daganatellenes hatásokat. Ezen túlmenően a szingenikus vizsgálatok azt mutatták, hogy a T-sejtek kritikus szerepet játszanak az ISAC hatékonyságában. Az ISAC által vezérelt tumor clearance erősen függött a CD8 T-sejtek aktivitásától, mivel a CD8 T-sejtek kimerülése gátolta a tumorellenes hatékonyságot. Az adatok arra utalnak, hogy a T-sejt aktivitást az ISAC-stimulált mieloid sejtek TLR által közvetített aktiválása hajtja. A T-sejtekre vonatkozó ilyen követelmény, amely feltehetően a tumorhoz kapcsolódó antigének ISAC-stimulált mieloid sejtek általi bemutatásával kapcsolatos, alátámasztja, hogy az ISAC-k valószínűleg legalább két mechanizmuson keresztül közvetítik daganatellenes aktivitásukat: fagocitózison és antigénprezentáción keresztül. Míg a fagociták korai daganatellenes választ adnak az ISAC-kezelést követően, a T-sejtek antigén-priming végül biztosítja a tumor clearance-ét és a teljes immunkompetens modellekben mért tartós hatásokat. Ez a kombináció nagyon kívánatos lenne a rákos betegek számára, mivel az ISAC-kezelés robusztus és tartós daganatellenes immunitáshoz vezethet. Az ISAC által közvetített T-sejt-aktiváció jelentőségének további feltárása érdekében az egereket rHER2 CL-t követően CT26- rHER2 daganatokból gyógyították meg. 264-Az ISAC-kezelést 30 napos daganatmentesség után ismét megindították a nem rHER2-t expresszáló CT26 szülői sejtvonallal. Az rHER2-CT26-tal gyógyított állatokat megvédték a CT26-os fertőzéstől, míg a daganatos naiv állatok nem tudták kilökni a daganat növekedését. Ezenkívül annak bizonyítására, hogy a védelem specifikus a CT26 tumorsejtvonalra, a 4T1-et egyidejűleg beültettük a szülői CT26-tal kiváltott egerek ellenoldali oldalába. Bár a CT26 daganatok nem tudtak növekedni a her-CT26-tal gyógyított egerekben, a 4T1 tumor növekedése nem volt megterhelve, és így bizonyítékot szolgáltat arra, hogy az immunitás antigén-specifikus és függ az adaptív immunválasztól. Ezen túlmenően ezek a vizsgálatok azt sugallják, hogy a tumor-célzott ISAC-k nemcsak az eredetileg megcélzott tumorantigénhez, hanem a nem célzott antigénekhez is közvetítik az immunológiai memóriát. Ezek az adatok arra is utalnak, hogy a mieloid sejtek tumorhoz kapcsolódó antigéneket mutathatnak be, amelyek további CTL-válaszokat váltanak ki. Ezeknek az eredményeknek a következményei azt mutatják, hogy még ha a megcélzott tumorantigén utóbb leszabályozott vagy nem tud kötődni az ISAC-hoz, az immunológiai memória már meg van hívva, és képes tartós választ fenntartani. Ez a válasz nemaz ISAC által megcélzott antigénre korlátozódik, hanem további, azonosítatlan, tumor által expresszált antigénekre is.Összességében ezek az adatok azt mutatják, hogy az ISAC-k minőségileg és mennyiségileg eltérő biológiát váltanak ki a sejtaktivációval és az antigénprezentációval, a T-sejt-proliferációval és a tartós daganatellenes immunitással kapcsolatban.

Methods and Materials: Antibody Conjugation & Characterization For conjugation of adjuvants to the antibody, adjuvants were first synthesized to include a linker flanked by a reactive group. Conjugates produced using two-step methods were first synthesized through the modification of mAb lysine residues with a heterobifunctional crosslinker SATA. Deprotection of the acetylated thiol exposed a reactive thiol which was then reacted at room temperature for 2-4 hours with an adjuvant-linker flanked by a thio-reactive maleimide. For constructs produced using a single-step conjugation method, TFP esters were then conjugated to an IgG1 antibody. The TFP esters were dissolved in anhydrous DMSO to make a 20 mM stock solution and 5-10 molar equivalents (relative to the antibody) were added to the IgG antibody at 10 mg/mL in PBS. The conjugation reaction was performed at 4-40°C for 2-12 hours. The resulting immunoconjugates were buffer exchanged into PBS (pH 7.4) through desalting (Zeba Columns, Thermo Fisher Scientific) or dialysis to remove excess small molecular weight impurities. The final protein concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm on a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). The yields were >75 százalék a visszanyert fehérje alapján. A SEC analízis minimális aggregátum jelenlétét mutatta ki, a DAR-t pedig LC/MS analízissel határoztuk meg. A tisztított ISAC-okat 0,2 μm-es steril szűrőn átszűrtük, és felhasználásig –20 fokon tároltuk. HEK Reporter Assay A humán TLR7-et vagy humán TLR8-at expresszáló HEK293 riportersejteket az Invivogen-től vásároltuk (hub-htlr7 vagy hub-htlr8). és a gyártói protokollokat követték a sejtszaporítás és a kísérletezés során. Röviden, a sejteket 80-85 százalékos összefolyásig növesztjük 5 százalék CO2 mellett 10 százalék FBS-sel, zeocinnal és blaszticidinnel kiegészített DMEM-ben. A sejteket ezután 96-lyukú lapos lemezekre oltottuk 4x104 sejt/lyuk arányban HEK kimutatási tápközeget és immunstimuláló molekulákat tartalmazó szubsztráttal. Az aktivitást lemezolvasóval mértük 620-655 nm hullámhosszon. A Biacore AnalysisHis-tagged Fc Gamma Receptor (FCGR) fehérjéket az R&D Systemstől szereztük be (FCGR1 (CD64, cat# 1257-FC{{23}). }), FCGR2A (CD32a, cat# 1257-FC-050), FCGR2B (CD32b, cat# 1875-FC-050), FCGR3A (CD16a, cat# {{34) }}FC-050). A kötődési elemzést Biacore T200 készüléken végeztük HBS-EP plusz pufferben (GE BR100669) egy immobilizált anti-HIS antitestet (HIS Capture kit, GE 28995056) tartalmazó CM5 chip (GE BR100530) segítségével. A Rituximab vagy a Rituximab-ISAC csak befogott FCGR-t vagy referencia felületi anti-His antitestet tartalmazó áramlási sejteket fecskendezett be.Anti-His felület és egy csak puffert tartalmazó injekció. Kinetikus titrálási módszert alkalmaztunk, és a felületeket a ciklusok között regeneráltuk 10 mM glicin (pH 1,5) injekciózásával. Az adatokat Biacore T200 kiértékelő szoftverrel (V3.1) illesztettük kinetikai illeszkedéssel (1:1) az FCGR1-hez és FCGR3A-hoz (6 futtatás átlaga), az FCGR2A-hoz és FCGR2B-hez pedig az állandósult állapotú affinitást (1:1) (3 futtatás átlaga). ).

Human Myeloid APC Isolation Myeloid APCs, which predominantly consisted of monocytes (>95%), were isolated from the whole blood of healthy donors (Stanford Blood Center) by density gradient centrifugation using a RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (Stem Cell Technologies). Myeloid APCs were further isolated using a negative selection Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 depletion (Stem Cell Technologies) to a final purity of >90 százaléka a CD14, CD16, CD11c és HLA-DR expresszión alapuló áramlási citometriával meghatározva. Toledo tumorsejt-előkészítés A Toledo-sejteket (ATCC) a gyártó által ajánlott tápközegben tenyésztettük, és az eladó által javasolt sejtsűrűségen (ATCC) tartottuk. A sejteket eltávolítottuk a tenyészetből, mostuk, és 2% FBS-t és 2 mM EDTA-t tartalmazó PBS-ben újraszuszpendáltuk 1-10x106 sejt/ml-ben. Egyes esetekben a sejteket ezt követően 2 percig 2 μM CFSE-vel jelöltük, majd egyszer mostuk RPMI-vel (Lonza), amelyet 10 százalékos FBS-sel (Atlanta Biologicals) és 100 U/ml Pen/Strep-pel (Lonza) egészítettünk ki. A sejteket ezután 2%-os paraformaldehidben fixáltuk, és háromszor mostuk PBS-sel a további felhasználás előtt. Sejtaktivációs vizsgálatok A PBMC-ket vagy izolált monocitákat üregenként 3x105 vagy 2x105 sejtben szélesztettük lapos fenekű, 96-lyukú lemezekre IMDM-ben. kiegészítve 10 százalékos FBS-sel (Atlanta Biologicals), 1 mM nátrium-piruváttal (Lonza), 100 µM nem esszenciális aminosavakkal (Lonza) és 100 U/mL Pen/Strep-pel (Lonza). A monocita és a tumor együttes tenyésztésével végzett kísérletekhez a monocitákat fix allogén tumorsejtekkel tenyésztettük 3:1 arányban. A sejteket ezt követően immunstimuláló szerekkel vagy kontrollokkal inkubáltuk 18-36 órán át 37 fokon, 10 százalékos CO2 mellett. A sejtaktivációt az aktivációs markerek sejtfelszíni expresszióján és a citokintermelésen keresztül mértük. A felszíni markerek expressziós szintjét áramlási citometriával mértük CD40 (5C3, BD), CD86 (IT2.2, BD), HLA-DR (L243, BD) és CD16 (3G8, BD) elleni antitestekkel. CD14 (MΦP9, BD) és CD123 (7G3, BD). A PBMC-ket áramlási citometriával elemeztük a fent említett aktivációs markerek elleni antitestekkel, valamint a CD19 (HIB19, BD), CD56 (B159, BD), CD3 (SK7, BD), CD4 (OKT4, BioLegend), CD8 (SK1, BD) és CD69 (FN50, BD). A sejttenyészet felülúszóját minden esetben 18 vagy 36-órás inkubáció után gyűjtöttük össze, és a citokintermelést citokin gyöngysor készlettel (Human Inflammatory Cytokin Kit, BD Biosciences) és ELISA-val (TNF Human ELISA kit, eBiosciences) mértük. .Tömegcitometria A PBMC-ket egészséges donorvérből izoláltuk, és ISAC-vel, antitest és adjuváns keverékével stimuláltuk, vagy inger nélkül 5-15 percig 37 fokon. A stimulációt követően a sejtek16 százalékos PFA (Electron Microscopy Sciences) hozzáadásával rögzítettük 1,6 százalékos végső koncentrációig, és 1 0 percig szobahőmérsékleten (RT) inkubáltuk. A rögzített sejteket sejtfestő közeggel (CSM; PBS 0,5% BSA-val és 0,02% nátrium-aziddal (mindegyik Sigma) mostuk, és palládium-alapú megközelítéssel vonalkódoltuk, a korábban leírtak szerint 54. A vonalkódolt mintákat egyesítettük összetett minta felületfestéshez.

A felületi festést antitestek hozzáadásával (2. kiegészítő táblázat) végeztük CSM-ben, és 3{{10}} percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az anti-humán antitesteket vagy konjugálva (Fluidigm) vagy nehézfém-izotópokhoz konjugálva vásárolták meg a MaxPar X8 antitest-jelölő készlet (Fluidigm) segítségével a gyártó ajánlásainak megfelelően. A felületen megfestett sejteket egyszer mostuk CSM-ben, és jégen 10 percig MeOH-val permeabilizáltuk. A permeabilizált sejteket kétszer mostuk CSM-mel, és intracelluláris antigének elleni antitesteket adtunk hozzá 30 percig szobahőmérsékleten. A sejteket CSM-mel mostuk, végül interkalációs oldatban (1,6% PFA PBS-ben, 0,02% szaponin (Sigma) és 0,5 μM iridium-interkalátor (Fluidigm)) újraszuszpendáltuk egy éjszakán át 4 °C-on. Az adatgyűjtés előtt a mintákat egyszer CSM-ben és kétszer ddH2O-ban mostuk. Az összes mintát sejtszűrőn (Falcon) átszűrtük, és 1x106 sejt/ml koncentrációban ddH2O-ban szuszpendáltuk, 1x EQ négyelemes kalibrációs gyöngyökkel (Fluidigm) és CyTOF2 tömegcitométerrel (Fluidigm) szerzett adatokkal. A jelzési válaszokat a Citibank 29-en belüli SPADE implementációjával értékeltük ki. Az elemzéseket minden sejten lefuttattuk (nem mintavételezés), kiválasztva a megadott számú klasztert, és az összes releváns felületi markert felhasználva, de intracelluláris markereket nem a klaszterezéshez. Az immunsejtvonalakat a nagydimenziós felszíni fehérje expressziós mintáik alapján annotáltuk. A statisztikai elemzéseket R, egy nyílt forráskódú statisztikai szoftverkörnyezetben végeztük. Az egyes sejtalcsoportokon, kezelt csoportokon és donorokon belül a következő húsz foszfoprotein marker átlagos szorzási változását számítottuk ki: p-Src, p-STAT5, p-cMET, p-AKT, p-MAPKAPK2, p-SHP2, p -SLP76, p-IRF-7, p-ZAP70/SYK, p-CREB, p-NFKB, p-PI3K, IKB (összesen), p-PLCG1, p-ERK1/2, p-p38, p -BTK/ITK, p-S6, p-STAT3 és p-JNK/SAPK. Az átlagos hajtásváltozást az egyes klaszterekben lévő sejtek teljes számával súlyoztuk, a SPADE klaszterezést követően meghatározottak szerint. Páros t-próbákat végeztünk az átlagos hajtásváltozás különbségének becslésére, és annak a nullhipotézisnek a tesztelésére, hogy nincs különbség az egyes markerek átlagos hajtásváltozásában a kezelési és a kontrollkörülmények között.

Xenograft tumormodell kísérleti eljárás A tumor sejtvonalakat az ATCC-től (NCI-N87, HCC1954 és COLO205) vagy AddexBio-tól (JIMT-1) vásároltuk, és a gyártó útmutatásai szerint szaporították. A sejteket összegyűjtöttük, amikor elérték a 80-90 százalékos konfluenciát az Accutase-szal (Stemcell) való leválasztással, PBS-sel mostuk, 40 x 106 sejt/ml koncentrációban PBS-ben újraszuszpendáltuk, és legfeljebb két órára jégre helyeztük. Közvetlenül a beültetés előtt a szuszpendált sejteket összekevertük azonos térfogatú Cultrex PathClear BME, Type 3 (R&D Systems) oldattal, és a keverékből 100 μL-t (2 x 106 sejt) szubkután beültettünk a jobb oldalba 6-8-hét -öreg nőstény egerek az alábbiak szerint: NCI-N87 és COLO205 sejteket NSG egerekbe (Jackson Laboratory), HCC1954 és JIMT{18}} sejteket Rag2/IL2rg kettős knockoutba (Taconic) és HCC1954 sejteket ültettünk be (az értékeléshez T785-ISAC) NSG-be, illSCID/beige egerek (Jackson Laboratory vagy Taconic és Envigo). A daganat méretét hetente kétszer rögzítettük, és a következő képlettel becsültük meg: (hossz x szélesség2)/2. Amikor a daganatok elérték a 50-100 mm3-t, általában a daganat beültetésétől számított egy héten belül, megkezdték a kezeléseket. Az egereket a daganat mérete alapján randomizáltuk kezelési csoportokba a kezdeti kezelés előtt. A trastuzumabot (EirGenix; EG12014), a Trastuzumab ISAC-t vagy az ISAC izotípust PBS-ben állítottuk elő 1 mg/ml koncentrációban, és 5 mg/kg dózisban adtuk be intraperitoneálisan ötévente (Q5D), összesen hat adagban. Azokat az egereket, amelyek daganata meghaladta a 2000 mm3-t, elaltatták.

HCC1954 és MMC sejtkimerülési kísérleti eljárás A makrofágok és más fagocita sejtek kimerítésére a HCC1954 vagy MMC daganatokat hordozó egereket intraperitoneális injekcióval kezeltük két nappal a kezdeti ISAC-kezelés előtt klodronát liposzómákkal vagy kontroll liposzómákkal, amelyek nem tartalmaztak kontroll, CaEntalogate as asulát. CLD-8901), majd hetente kétszer kezelték, összesen három héten keresztül. A neutrofilek kimerítésére az egereket kimerítő antitestekkel kezeltük 1A8-as, hogy csak a Ly6G-t és a neutrofileket (BioXCell katalógusszám: BE0075-1) vagy RB6-8C5-tel kezeljük a Gr1 plusz sejteket, amely magában foglalja a Ly6G plusz neutrofileket és Ly6C pluszt. sejtek (BioXCell katalógusszám: BE0075) vagy izotípus kontrollok 2A3 és LTF-2 (BioXCell katalógusszám: BE0089 és BE0090) két nappal a kezdeti ISAC-kezelés előtt, majd hetente kétszer kezelték három héten keresztül. A sejtek kimerülését a vérben áramlási citometriával igazoltuk (kiegészítő 24. ábra). Daganat citokin- és mRNS-elemzési eljárás A daganatokat a korábban leírtak szerint ültettük be, és a kezelést követően a jelzett időpontokban elemzés céljából összegyűjtöttük. Az immunhisztokémiához és az mRNS-elemzéshez a daganatokat felosztottuk, és az mRNS-t a NanoString egér pánrák immunprofilozó panellel elemeztük. Az adatok elemzése az nSolver Advanced Analysis Software szoftverrel történt a gyártó ajánlásainak megfelelően. Vulkándiagramokat rajzoltunk a ggplot2 csomaggal R-ben. A citokinanalízishez tumorlizátumok előállításához a tumorfragmenseket előre elkészített pufferben tartottuk (1 Pierce Protease Inhibitor Tablets (Thermo Fisher, katalógusszám: A32965), 20 ml T-ben oldva. PER Tissue Protein Extraction Reagens, Thermo Fisher, Katalógusszám: 78510) GentleMACS M Tubes-ban (Miltenyi, Katalógusszám 130-093-236) közvetlenül a boncolás után. A tumormintákat ezután GentleMACS Octo Disssociator segítségével disszociáltuk. Az összes mintát 5 percig centrifugáltuk 300 g-on. A felülúszókat ezután mikrofuga-csövekbe gyűjtöttük, és mikrocentrifugával újra centrifugáltuk. A felülúszón az MSD citokinanalízist végeztünk. Immunhisztokémiát végeztünk hematoxilin és eozin felhasználásával a szöveti architektúra azonosítására, valamint a következő markerekre, ahol a vizsgálatok azt jelezték: CD11c (CST katalógusszám: 87585) és CD8 (CST katalógusszám: 98941).

4. ábra: A T785-ISAC-ok erős daganatellenes immunitást váltanak ki trastuzumab-rezisztens tumorxenograft modellekben.(ad) SCID/Beige vagy NSG egereket ültettek be a HCC1954 tumorsejtvonallal, és véletlenszerűen kiválasztották, amikor a tumor térfogata elérte az 50-et. – 75 mm3. (a) Az egereket egyszer kezeltük intraperitoneálisan (IP) 5 mg/kg trastuzumab T785-ISAC-vel vagy trastuzumabbal, vagy molárisan egyenértékű adagolást trastuzumab és T785 keverékével az ISAC-ba intratumorális (IT) injekcióval. Az adatok egy kísérletből származnak, csoportonként n=3-5 egérrel. (b) Az egereket intraperitoneális injekcióval kezelték 5 mg/kg trastuzumabbal, trastuzumab-ISAC-vel,rituximab vagy rituximab-ISAC Q5DX6 (csoportonként n= 5 egér). (c) Az egereket intraperitoneális injekcióval kezeltük 5 mg/kg trastuzumabbal, trastuzumab T785-ISAC-val, trastuzumab N297A-ISAC-val vagy trastuzumab TLRnull-ISAC-vel (csoportonként n=5 egér). (d) A HCC1954 tumorsejteket SCID/Beige egerekbe ültettük be, és a kérdéses sejtek kimerültek a trastuzumab T785-ISAC kezelés előtt és alatt (5 mg/kg, Q5DX3) anti-Ly6G antitesttel (patkány IgG2a kontroll) , klodronát liposzómák (kontroll liposzómák kontrollként) vagy anti-Gr1 antitest (patkány IgG2b kontroll). Az adatok egy kísérletből származnak, csoportonként n=4-6 egérrel. (e, f) NSG vagy Rag2/IL2rg kettős knockout egerekbe ültettük be a JIMT-1 tumorsejtvonalat, és randomizáltuk, amikor a tumor térfogata elérte az 50-75 mm3-t. Az egereket ezt követően a jelzett kezelésekkel kezelték 5 mg/kg intraperitoneálisan (e) Q5DX6 gyakorisággal.vagy (f) Q5DX5 (csoportonként n=3-6 egér). (bf) A bemutatott adatok legalább két kísérletet reprezentálnak. (gj) A HCC-1954 tumorokat egércsoportokból gyűjtöttük be a jelzett időpontokban az egyszeri 5 mg/kg ISAC- vagy kontrollantitest-kezelést követően. A daganatokat feldolgoztuk áramlási citometriás analízishez, NanoString mRNS mennyiségi meghatározásához, vagy formalinban rögzítettük és paraffinba ágyaztuk az immunhisztokémiához. (g) A vulkán diagramok a génexpresszió log2-szeres változását mutatják a kezelt vs. izotípus kontroll tumorokban NanoString segítségével 24 órán belül (csoportonként n{11}} egér). A < 0.05="" korrigált="" p-értékkel="" rendelkező="" változások="" piros="" színnel="" jelennek="" meg.="" (h)="" az="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" segítségével="" számszerűsített="" génaláírási="" pontszámok="" a="" kezelés="" után="" 24="" órával="" elemzett="" tumorokra="" (csoportonként="" n="5" egér).="" (i)="" a="" daganatos="" sejtösszetétel="" áramlási="" citometriás="" analízise="" a="" kezelés="" után="" 24="" órával="" és="" 7="" nappal="" (csoportonként="" n="2-4" egér).="" az="" adatok="" legalább="" 2="" kísérletre="" vonatkoznak.="" (j)="" reprezentatív="" képek,="" valamint="" az="" f4/80="" és="" cd11c="" ihc="" mennyiségi="" meghatározása="" minden="" egyes="" javasolt="" kezelés="" után="" 9="" nappal="" gyűjtött="" daganatokról.="" a="" skálák="" 50="" μm-esek.="" (aj)="" az="" adatok="" sem="" átlagként,="" a="" statisztikák="" pedig="" *p-vel="" jelennek=""><0.05,><0.01,><0.001,><>

Szingenikus tumormodell Kísérleti eljárás Az MMC sejteket Dr. Disistől (University of Washington) szereztük be, és RPMI 1640-ben tenyésztettük 20 százalék FBS-sel, 1 százalék penicillin-sztreptomicinnel és L-glutaminnal 37 fokos hőmérsékleten és 5 százalék CO2-ig, amíg {{8 }} százalék összefolyó. A patkány HER2 fehérjét stabilan expresszáló CT26 sejteket (ATCC) transzfektáltuk RPMI 1640-ben, amelyet 10% FBS-sel és 600 ug/ml G418 szelektív antibiotikummal (Thermo) egészítettek ki 37 fokos hőmérsékleten és 5% CO2-vel, amíg 80-90% konfluens nem lett. Miután kellően összefolytak, a sejteket Accutase-szal (Stemcell) való leválasztással és PBS-sel történő mosással gyűjtöttük össze. Az összegyűjtött sejteket 20 x 106 sejt/ml (MMC) sebességgel újraszuszpendáltuk.vagy 5 x 106 sejt/ml (CT26-rHER2) PBS-ben, és felhasználásig 4 fokon /jégen tartottuk. 100 μLszuszpendált sejteket szubkután ültettünk be 6-8-hetes FVB/N-TgN(MMTV- Erbb2)NK1Mul/Jegerekbe (MMC modell, The Jackson Laboratory) vagy nőstény BALB/c egerekbe (CT26 modell, The Jackson Laboratory) . A tumor méretét kétszer mértük és rögzítettükegy hét a vizsgálat idejére. A tumor térfogatát a következő képlettel becsültük meg: (hossz x szélesség2)/2. Amint a daganatok elérték az 200-500 mm3-t (MMC) vagy a 50-100 mm3-t (CT26-rHER2), általában a daganat beültetésétől számított egy héten belül, megkezdték a kezeléseket. Az egereket a tumor mérete alapján véletlenszerűen kezeltük a kezelés megkezdése előttkezelés. Az anti-rHER2 mAb-t (BioXCell; 7.16.4) vagy az anti-rHER2-ISAC-t intraperitoneálisan adtuk be (a gyakoriság az ábrák jelmagyarázatai szerint) a vizsgálat időtartama alatt.Azokat az egereket, amelyek daganata meghaladta a 2000 mm3-t, elaltatták. A T-sejt-kiürülést értékeltükállatokban CD4 (BioXCell; GK1.5) vagy CD8 (BioXCell; YTS 169.4) sejtpusztító antitestek alkalmazásával. A kimerülést a tumor beültetése előtt kezdtük meg, és hetente kétszer 200 ug/antitest adagolásával folytattuk. A tumor újrafertőzésére CT26 és 4T1 sejtvonalakat ültettünk be tumorvonalonként 5 x 106 sejtben, és a tumorban nem kezelt egereket mindkét sejtvonallal fertőztük meg kontrollként.

Kiegészítő anyagok Kiegészítő anyagokért lásd a PubMed Central webes verzióját. Köszönetnyilvánítás: A szerzők köszönetet szeretnének mondani P. Bastónak, NE Reticker-Flynnnek, T. Prestwoodnak és B. Malletnek a segítő beszélgetésükért. Köszönetet mondunk a Stanford Blood Center Flow Cytometry Core-nak is, különösen L. Tolentinónak, O. Choinak és N. Wu-nak. Köszönetünket fejezzük ki Dr. Mary L. (Nora) Disisnek és Denise Cecilnek is a Washingtoni Egyetemről, akik az MMC tumorsejtvonalat biztosították.

Finanszírozás: Az SE Ackermant a Stanford BioX Bowes ösztöndíj támogatta.

Hivatkozások:1. Davis TA et al. Rituximab anti-CD20 monoklonális antitest terápia non-Hodgkin limfómában: az újrakezelés biztonsága és hatékonysága. J Clin Oncol 18, 3135–3143, doi: 10.1200/JCO.2000.18.17.3135 (2000). [PubMed: 10963642]2. Grillo-Lopez AJ et al. Rituximab: az első limfóma kezelésére jóváhagyott monoklonális antitest. Curr Pharm Biotechnol 1, 1-9 (2000). [PubMed: 11467356]3. Lizotte PH et al. A nem kissejtes tüdőrákok többparaméteres profilozása különböző immunfenotípusokat tár fel. JCI Insight 1, e89014, doi:10.1172/jci.insight.89014 (2016). [PubMed: 27699239]4. Spranger S et al. Az immunogén antigének sűrűsége nem magyarázza meg a T-sejt-gyulladásos tumor mikrokörnyezet jelenlétét vagy hiányát melanomában. Proc Natl Acad Sci USA 113, E7759–E7768, doi:10.1073/pnas.1609376113 (2016). [PubMed: 27837020]5. Beatty GL & Gladney WL Immunmenekülési mechanizmusok, mint útmutató a rák immunterápiájához. Clin Cancer Res 21, 687–692, doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-1860 (2015). [PubMed: 25501578]6. Fridman WH, Pages F, Salutes-Fridman C & Galon J Az immunrendszer kontextusa humán daganatokban: hatás a klinikai kimenetelre. Nat Rev Cancer 12, 298–306, doi:10.1038/nrc3245 (2012). [Kiadási szám: 22419253]

7. Galon J & Bruni D Megközelítések az immunrendszer meleg, megváltozott és hideg daganatainak kezelésére kombinált immunterápiával. Nat Rev Drug Discov 18, 197–218, doi:10.1038/s41573-018-0007-y (2019). [PubMed: 30610226]8. Gabrilovich DI, Ostrand-Rosenberg S & Bronte V. A mieloid sejtek összehangolt szabályozása daganatok által. Nat Rev Immunol 12, 253–268, doi:10.1038/nri3175 (2012). [PubMed: 22437938]9. Joyce JA és Fearon DT T-sejtek kizárása, immunkiváltság és a tumor mikrokörnyezete. Science 348, 74–80, doi:10.1126/science.aaa6204 (2015). [PubMed: 25838376] 10. Carmi Y et al. Az Akt és az SHP-1 a tumorimmunitás DC-intrinsic ellenőrzőpontjai. JCI Insight 1, e89020, doi:10.1172/jci.insight.89020 (2016). [PubMed: 27812544]11. Carmi Y et al. Az allogén IgG dendritikus sejtingerekkel kombinálva tumorellenes T-sejtes immunitást indukál. Nature 521, 99–104, doi:10.1038/nature14424 (2015). [PubMed: 25924063]12. Allen BM et al. Az immun mikrokörnyezet szisztémás diszfunkciója és plaszticitása rákmodellekben. Nat Med 26, 1125–1134, doi: 10,1038/s 41591-020-0892-6 (2020). [PubMed: 32451499]13. Sagiv-Barfi I et al. A spontán rosszindulatú daganatok felszámolása helyi immunterápiával. Sci Transl Med 10, doi:10.1126/scitranslmed.aan4488 (2018).14. Spitzer MH et al. A hatékony rákimmunterápiához szisztémás immunitás szükséges. Cell 168, 487–502 e415, doi:10.1016/j.cell.2016.12.022 (2017). [PubMed: 28111070]15. Milhem Mohammed M., Theresa Medina RG, Kirkwood John M., Buchbinder Elizabeth, Mehmi Inderjit, Niu Jiaxin, Shaheen Montaser, Weight Ryan, Margolin Kim, Luke Jason, Morris Aaron, Mauro David, Krieg Arthur M., Ribas Antoni CT{ {77}}Az intratumorális útdíj-szerű receptor (TLR9) agonista, a CMP-001 pembrolizumabbal kombinálva megfordíthatja a PD-1 gátlással szembeni rezisztenciát egy 1b fázisú vizsgálatban előrehaladott melanomában szenvedő alanyokon (AACR Annual Meeting) 2018, 2018).16. Rook AH A CTCL TLR-agonistáinak szépsége. Blood 119, 321–322, doi:10.1182/vér-2011-11-391243 (2012). [PubMed: 22247516]17. Singh M et al. Hatékony veleszületett és adaptív melanoma elleni immunitás a lokalizált TLR7/8 aktiválás révén. J Immunol. 193, 4722–4731, doi: 10.4049/J Immunol. 1401160 (2014). [PubMed:25252955]18. Zhao BG, Vasilakos JP, Tross D, Smirnov D & Klinman DM A 7., 8. és 9. díjszerű receptorokat célzó kombinált terápia megszünteti a nagy kialakult daganatokat. J Immunother Cancer, 2, 12, doi:10.1186/{115}} (2014). [PubMed: 24982761]19. Jurk M et al. A humán TLR7 vagy TLR8 egymástól függetlenül választ ad az R-848 vírusellenes vegyületre. Nat Immunol 3, 499, doi:10.1038/ni{126}} (2002). [PubMed: 12032557]20. Chattergoon MA et al. A HIV és a HCV aktiválja a gyulladást a monocitákban és a makrofágokban az endoszomális Toll-szerű receptorokon keresztül az 1-es típusú interferon indukciója nélkül. PLoS Pathog 10, e1004082, doi:10.1371/journal.bat.1004082 (2014). [PubMed: 24788318]21. Eigenbrod T, Pelka K, Latz E, Kreikemeyer B & Dalpke AH A TLR8 bakteriális RNS-t érzékel az emberi monocitákban, és nem redundáns szerepet játszik a Streptococcus pyogenes felismerésében. J Immunol. 195, 1092–1099, doi: 10.4049/J Immunol. 1403173 (2015). [PubMed: 26101323]22. Mattson G et al. A térhálósítás gyakorlati megközelítése. Mol Biol Rep 17, 167-183 (1993). [PubMed: 8326953]23. Gabay C, Ben-Bassat H, Schlesinger M & Laskov R Szomatikus mutációk és intraklonális variációk a B-non-Hodgkin limfóma sejtvonalak átrendezett Vkappa génjeiben. Eur J Haematol 63, 180–191, doi:10.1111/j.{164}}.1999.tb01766.x (1999). [PubMed: 10485273]24. Alonso MN et al. A T(H)1, T(H)2 és T(H)17 sejtek arra utasítják a monocitákat, hogy speciális dendritesejt-alcsoportokká differenciálódjanak. Blood 118, 3311–3320, doi:10,1182/vér-2011-03-341065 (2011). [PubMed: 21813450]25. Clarke SR et al. Az ovalbumin-specifikus TCR transzgenikus vonal jellemzése OT-I: MHC elemek pozitív és negatív szelekcióhoz. Immunol Cell Biol 78, 110–117, doi:10.1046/j.{189}}.2000.00889.x (2000). [PubMed: 10762410]26. Zehn D, Lee SY és Bevan MJ Teljes, de lecsökkent T-sejtes válasz nagyon alacsony affinitású antigénre. Nature 458, 211–214, doi:10.1038/nature07657 (2009). [PubMed: 19182777]27. Kondratova M et al. A rákban előforduló veleszületett immunválasz többléptékű jelzőhálózati térképe sejtheterogenitási aláírásokat tár fel. Nat Commun 10, 4808, doi: 10,1038/s 41467-019-12270-x (2019). [Kiadási szám: 31641119]

28. Bendall SC et al. Különböző immun- és gyógyszerválaszok egysejtes tömegcitometriája a humán hematopoietikus kontinuumban. Science 332, 687–696, doi:10.1126/science.1198704 (2011). [PubMed: 21551058]29. Qiu P és mtsai. Sejthierarchia kinyerése nagydimenziós citometriai adatokból SPADE segítségével. Nat Biotechnol 29, 886–891, doi: 10.1038/nbt.1991 (2011). [PubMed: 21964415]30.Kawai T & Akira S TLR jelzés. Cell Death Differ 13, 816–825, doi:10.1038/sj.cdd.4401850 (2006). [PubMed: 16410796] 31. Sanchez-Mejorada G & Rosales C Jelátvitel immunglobulin Fc receptorok által. J. Leukoc Biol. 63, 521-533 (1998). [PubMed: 9581795]32. Krishnaswamy S et al. Rendszerbiológia. A T-sejt jelátvitel feltételes sűrűség alapú elemzése egysejtű adatokban. Science 346, 1250689, doi:10.1126/science.1250689 (2014). [PubMed: 25342659]33. Kiefer F et al. A Syk protein tirozin kináz nélkülözhetetlen az Fcgamma receptor jelátvitelhez makrofágokban és neutrofilekben. Mol Cell Biol. 18, 4209-4220 (1998). [PubMed: 9632805]34. Braselmann S et al. Az R406, egy orálisan beszerezhető lép tirozin kináz inhibitor blokkolja az Fc receptor jelátvitelt és csökkenti az immunkomplex által közvetített gyulladást. J Pharmacol Exp Ther 319, 998–1008, doi: 10.1124/jpet.106.109058 (2006). [PubMed: 16946104]35. Bruhns P et al. Humán Fcgamma receptorok és polimorf változataik specifitása és affinitása a humán IgG alosztályokhoz. Blood 113, 3716–3725, doi:10,1182/vér-2008-09-179754 (2009). [PubMed: 19018092]36. Nimmerjahn F & Ravetch JV Eltérő immunglobulin g alosztály aktivitása szelektív Fc receptor kötődés révén. Science 310, 1510–1512, doi:10.1126/science.1118948 (2005). [PubMed: 16322460]37. Jefferis R Rekombináns antitestterápiák: a glikoziláció hatása a hatásmechanizmusokra. Trends Pharmacol Sci 30, 356–362, doi:10.1016/j.tips.2009.04.007 (2009). [PubMed: 19552968]38. Tanji H, Ohio U, Shibata T, Miyake K & Shimizu T A Toll-like receptor 8 dimerek agonista ligandumok által kiváltott szerkezeti átszervezése. Science 339, 1426–1429, doi:10.1126/ science.1229159 (2013). [PubMed: 23520111]39. Shultz LD et al. Humán limfoid és mieloid sejtfejlődés NOD/LtSz szerint mobilizált humán hemopoetikus őssejtekkel beültetett IL2R gamma null egerekben. J Immunol. 174, 6477-6489, doi: 10.4049/J Immunol. 174.10.6477 (2005). [PubMed: 15879151]40. Xia Z et al. Veleszületett immunválasz az emberi csontvelő fibroblaszt sejtbeültetésre CB17 SCID / bézs egerekben. J Cell Biochem 98, 966-980, doi: 10.1002/jcb.20730 (2006). [PubMed: 16795075]41. Tanner M et al. Herceptin-rezisztens emlőrákban szenvedő betegből létrehozott új sejtvonal jellemzése. Mol Cancer Ther 3, 1585–1592 (2004). [Pubmed: 15634652]42.Luque-Cabal M, Garcia-Teijido P, Fernandez-Perez Y, Sanchez-Lorenzo L & Palacio-Vazquez I Mechanisms Behind the Resistance to Trastuzumab in HER Azt. Clin Med Insights Oncol 10, 21–30, doi:10.4137/CMO.S34537 (2016). [PubMed: 27042153]43. Li JY et al. A biparatópiás HER2-Célzott antitest-gyógyszer konjugátum tumorregressziót indukál a HER-re refrakter vagy arra alkalmatlan elsődleges modellekben2-Célzott terápia. Cancer Cell 29, 117–129, doi:10.1016/j.ccell.2015.12.008 (2016). [PubMed: 26766593]44. Ning S, Pagano JS & Barber GN IRF7: aktiválás, szabályozás, módosítás és funkció. Genes Immun 12, 399–414, doi:10.1038/gene.2011.21 (2011). [PubMed: 21490621]45. Cao Q et al. A vese F4/80 plusz CD11c plusz mononukleáris fagociták a makrofágok fenotípusos és funkcionális jellemzőit mutatják egészségügyi és adriamicin nefropátiában. J Am Soc Nephrol 26, 349–363, doi:10.1681/ASN.2013121336 (2015). [PubMed: 25012165]46. Sheng J et al. A tipikus hagyományos 2-es típusú dendrites sejtek monocitából származó sejtek diszkrét részhalmaza hatékonyan képes keresztezni. Cell Rep 21, 1203–1214, doi:10.1016/ j.celrep.2017.10.024 (2017). [Kiadási szám: 29091760]

47. Knutson KL, Almand B, Dang Y & Disis ML Neu-antigén-negatív variánsok állíthatók elő neu-specifikus antitestterápia után neu-transzgénikus egerekben. Cancer Res 64, 1146–1151 (2004). [PubMed: 14871850]48. Moynihan KD et al. Nagy, kialakult daganatok felszámolása egerekben kombinált immunterápiával, amely veleszületett és adaptív immunválaszokat vált ki. Nat Med 22, 1402–1410, doi: 10,1038/nm.4200 (2016). [PubMed: 27775706]49.Siebenlist U, Franzoso G & Brown K Az NF-kappa B. Annu Rev Cell Biol 10, 405–455, doi:10.1146/annurev.cb.10.1102941.1 (10.102941)1. . [PubMed: 7888182]

6. ábra: A CL264-tartalmú ISAC-ok tumorclearance-t váltanak ki xenograftokat expresszáló HER2 tápközegben, valamint T-sejt-mediált tumor clearance-t, immunológiai memóriát és epitóp terjedést szingenikus tumormodellben. (a) Az ISAC generálásához használt T785 és CL264 adjuvánsok kémiai szerkezete. (b) A HCC1954 tumorsejtvonallal beültetett NSG egereket randomizáltuk, amikor a tumor térfogata elérte az 50-75 mm3-t. Az egereket egyszer kezeltük 5 mg/kg trastuzumab, trastuzumab T785-ISAC vagy trastuzumab CL264-ISAC intraperitoneális injekciójával. A daganatokat 20 órával a beadás után összegyűjtöttük, egysejt-szuszpenzióvá dolgoztuk fel, és áramlási citometriával elemeztük a tumorba infiltráló mieloid APC-k aktiválódásának értékelésére. (cd) NSG vagy Rag2/IL2rg kettős knockout egerekbe ültettük be a jelzett humán tumorsejtvonalat, és randomizáltuk, amikor a tumor térfogata elérte az 50-75 mm3-t (HCC1954) vagy a 75-150 mm3-t (JIMT-1). Az egereket intraperitoneális injekcióval kezelték 5 mg/kg rituximabbal, trastuzumabbal, trastuzumab T785-ISAC-val, trastuzumab CL264-ISAC-vel vagy a megfelelő izotípussal.ISAC-k, 5 naponta, összesen 6 kezelésig. (e) Az rHER2 expresszióját CT26-rHER2 tumorsejteken mértük tenyészetben az implantáció előtt (bal oldali áramlási diagram) és a tumorokban kilenc nappal az implantáció után (jobb oldali áramlási diagram) áramlási citometriával, fluoreszcensen konjugált anti-rHER2 antitesttel. (piros) vagy izotípus kontroll (kék). (f) Balb/c egereket ültettek be a CT26-rHER2 tumorsejtvonallal, és véletlenszerűen kiválasztották, amikor a tumor térfogata elérte az 50-et.mm3. Az egereket ezután intraperitoneális injekcióval kezeltük 10 mg/kg egér antipatkánnyalHER2 vagy egér anti-patkány HER2 CL264-ISAC 5 naponta, összesen 6 kezelésig. A bemutatott adatok 1 kísérletből származnak, karonként 8 egérrel, és 3 kísérletet reprezentálnak.

(g) Anti-rat HER2 CL264-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >21 nappal az utolsó kezelés után szülői CT26-tal (bal oldal) és 4T1 sejtvonalakkal (jobb oldal) fertőztük, CD4 és CD8 T-sejt-kiürüléssel vagy anélkül (mindegyik n =3). A szülői CT26 és 4T1 sejtvonalakkal fertőzött tumor naiv egereket (n=6) vettük be kontrollként. (ai) Az adatok karonként 3-6 egérrel végzett egyéni kísérletekből származnak, és a karonként legalább 3 egérrel végzett 1-4 kísérletet reprezentálják. Az adatok átlagértékként jelennek meg SEM-mel, a statisztikák pedig *P-vel<><0.01,><0.001, and=""><>

50. Vogelpoel LT et al. Az FcgammaRIIa keresztbeszéd a TLR-ekkel, az IL-1R-rel és az IFNgammaR-rel szelektíven modulálja a citokintermelést humán mieloid sejtekben. Immunobiology 220, 193–199, doi:10.1016/j.imbio.2014.07.016 (2015). [PubMed: 25108563]51. Daley JM, Thomas AA, Connolly MD, Reichner JS és Albina JE Ly6G-specifikus monoklonális antitest alkalmazása a neutrofilek lebontására egerekben. J Leukoc Biol 83, 64–70, doi:10.1189/jlb.0407247 (2008). [PubMed: 17884993]52. Broz ML és mtsai. A daganat mieloid kompartmentjének boncolása ritka, aktiválódó antigénprezentáló sejteket tár fel, amelyek kritikusak a T-sejtes immunitás szempontjából. Cancer Cell 26, 938, doi:10.1016/ j.ccell.2014.11.010 (2014).53. Spranger S, Dai D, Horton B és Gajewski TF tumorban élő Batf3 dendritikus sejtek szükségesek az effektor T-sejt-kereskedelemhez és az örökbefogadó T-sejt-terápiához. Cancer Cell 31, 711–723 e714, doi:10.1016/j.ccell.2017.04.003 (2017). [PubMed: 28486109]54. Zunder ER et al. Palládium alapú tömegcímkés cella vonalkódolás kettős szűrési sémával és egycellás dekonvolúciós algoritmussal. Nat Protoc 10, 316–333, doi:10.1038/nprot.2015.020 (2015). [Kiadási szám: 25612231]