A Cistanche Deserticola-ból származó vízzel extrahálható poliszacharidok immunstimuláló aktivitása növényi adjuvánsként in vitro

További információért:ali.ma@wecistanche.com

Ailian Zhang, Xiumei Yang, Quanxiao Li, Yu Yang, Gan Zhao, Bin Wang, Daocheng Wu

1 Xinjiang Key Lab of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang, China,

2 Key Lab of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, Kína,

3 Élettudományi és Technológiai Főiskola, Xi'an Jiaotong Egyetem, Xian, Shanxi, Kína

Absztrakt

A biztonságos és hatékony vakcina-adjuváns fontos a modern vakcinákban. Különféle kínainövényi poliszacharidokaktiválhatja az immunrendszert.Cistanche deserticola(CD) egy hagyományos kínai gyógynövény és adjuváns jelölt. Itt megerősítettükvízzel extrahálható poliszacharidokA CD (WPCD) in vitro és in vivo módosíthatja az immunválaszokat. Dózisfüggő módon a WPCD jelentősen elősegítette a rágcsálóvelőből származó dendritikus sejtek (BM-DC) érését és működését az MHC expressziós szintjének fokozásával -II, CD86, CD80 és CD40, allogén T-sejt-proliferáció, valamint az IL-12 és TNF- hozama a toll-like receptor4-en (TLR4) keresztül, amint azt in vitro kísérletek mutatják. Ezenkívül immunmoduláló aktivitását egerekben is megfigyelték. A WPCD hatékonyan javította az IgG, IgG1 és IgG2a titereit, és jelentősen fokozta a T- és B-sejtek proliferációját, az IFN- és IL-4 termelődését CD4 plusz T-sejtekben, valamint az IFN-expressziós szintjét CD8-ban. plusz a T-sejtek jobbak, mint az Alum. Ezenkívül a WPCD jelentősen megnövelheti a CD40 és CD80 expressziós szintjét a lépben lévő DC-ken, és csökkentheti a Treg gyakoriságát. A tanulmány azt sugallja, hogy a Cistanche deserticola poliszacharidjai biztonságos és hatékony vakcina-adjuvánsok mind a humorális, mind a celluláris immunitás kiváltására azáltal, hogy aktiválják a DC-ket a TLR4 jelátviteli útvonalon keresztül.

Kattintson a Cistanche szárú termékekhez

Bevezetés

A védőoltások fontosak a betegségek leküzdésében vagy megelőzésében. Az újonnan előállított és jelenleg fejlesztés alatt álló vakcinák nagy tisztaságú rekombinánsokantigéneknagyobb biztonsággal, de a tisztított antigének nem tudnak kielégítően stimulálniimmunválaszlegyengített vagy inaktivált kórokozó készítményekkel összehasonlítva. Adjuvánsok segítségével a vakcinák perzisztenciát válthatnak kiimmunválaszok[1,2]. Az új, erős adjuvánsok széles körben érintettek mind a vakcinafejlesztésben, mind az emberi egészségben. A mai napig különféle adjuvánsokat azonosítottak és alaposan tanulmányoztak. Ezek az adjuvánsok számos előnnyel ruházzák fel a vakcinákat, többek között csökkentik az antigének szükséges mennyiségét, minimalizálják a normál immunválaszokhoz szükséges immunizálások számát, valamint gyorsabb, szélesebb körű és erősebb indukálást tesznek lehetővé.immunválaszok[3–5]. Bár sok erős adjuvánst fejlesztettek ki, mint például a lipopoliszacharidot (LPS) és a Freund-féle teljes adjuvánst (FCA), toxicitásuk miatt nem alkalmazzák őket széles körben. Ezért csak néhány adjuváns, mint például az Alum, engedélyezett klinikai használatra [6]. Összességében hatékonyabb és biztonságosabb adjuvánsokat kell kifejleszteni a fertőző és nem fertőző betegségek elleni jobb profilaktikus és terápiás vakcinák előmozdítása érdekében.

A biztonság fontos szempont az adjuvánsok fejlesztésénél. A kínai lágyszárú összetevők közé tartoznak a tápanyagok és fontos aktív kompozitok, például fenolos vegyületek és poliszacharidok, amelyek erős immunstimulánsként működhetnek [7–9]. Közülük a hagyományos kínai gyógynövényekből származó poliszacharidokat széles körben kutatták immunstimuláló hatásuk és alacsony toxicitásuk miatt. Például az inulin egy immunadjuváns, anélkül, hogy más adjuvánsok, például az FCA toxicitása lenne. Az AdvaxTM delta inulin adjuváns sikeresen fokozta a vakcinák immunogenitását is [10,11]. Az Astragalus, más néven Huangqi kínaiul és Radix Astragali latinul, széles körben elterjedt az egész világon. A poliszacharid az egyik fő hatóanyaga, amely az immunmoduláló aktivitásért felelős. Kísérleti vizsgálatok kimutatták, hogy az Astragalus poliszacharid erős immunmoduláló hatással rendelkezik mind in vitro, mind in vivo [12, 13]. A Lycium barbarum poliszacharidok vakcina adjuvánsként szintén jó javulást és stimuláló hatást mutattak [14, 15]. Ezek a vizsgálatok azt sugallták, hogy a kínai növényi poliszacharidok ideális jelöltek az adjuváns fejlesztéshez.

Cistanche deserticola YC Ma(CD, kínaiul "Rou Cong Rong") egy értékes hagyományos kínai gyógynövény, amelyet kiváló tonizáló hatása miatt általában "a sivatagok ginzengének" neveznek. Hszincsiang száraz vagy félszáraz régióiban elterjedt. Kínában szárított, húsos szárát több száz éve használják tonizáló táplálékként [16, 17]. A főtt CD-t sok éve használták tonizáló táplálékként a túlterhelés okozta károsodások kezelésére, ami arra utal, hogy orális adagolás esetén biztonságos. Ez a növény széles körben érintett széles körű gyógyászati ​​​​funkciói miatt. A legújabb fitokémiai és farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a poliszacharidok a fő biológiailag aktív komponensek, és különféle biológiai hatásokkal bírnak, beleértve az immunmoduláló hatást, az antioxidáns hatást és a gyulladáscsökkentő hatást [18–21]. Mindazonáltal a C. deserticolából származó vízzel extrahálható poliszacharidok immunerősítő aktivitásáról ritkán számoltak be Xinjiangban.

Köztudott, hogy a DC-k fontos antigénprezentáló sejtek (APC), amelyek az immunválasz indításához és a veleszületett és adaptív sejtek modulálásához szükséges jeleket biztosítanak. Egyes adjuvánsok, amelyek javítják a DC-k antigénfelvételét, növelhetik a kostimuláló vagy MHC-molekulákat, és fokozhatják az immunitást. Amikor megindul a DC-k érése, több kostimuláló molekula és citokin termelődik, és a DC-k eltérő fenotípusokat mutatnak [22, 23].

Ebben a tanulmányban először azt vizsgáltuk, hogy a WPCD elősegítheti-e a DC-k aktiválását a TLR4 jelátviteli útvonalon keresztül in vivo. Mivel a DC-k voltak a kapcsolat a veleszületett és az adaptív immunválaszok között, feltételeztük, hogy a WPCD által stimulált DC-k aktiválása befolyásolja az adaptív immunitás kimenetelét. Megvizsgáltuk az ovalbuminra (OVA) adott specifikus immunválaszt WPCD-vel kezelt egerekben, beleértve az IgG, IgG1 és IgG2a alosztály titereit, a T- és B-proliferációt, valamint a citokintermelést. Megvizsgáltuk, hogy a WPCD-kezelés növelné-e a DC-k és a Treg-sejtek aktivitását ezen egerek lépében. Eredményeink bebizonyították a C. deserticola természetes poliszacharidjainak potenciális immunmoduláló hatását, és kiterjesztették alkalmazási körét

Anyagok és metódusok

Állatok

A nyolc-tíz hetes C57BL/6, BALB/c vagy ICR nőstény egereket a Xinjiang Medical University (Urumcsi, Xinjiang, Kína) FirstHospital-tól vásároltuk. Az egereket kórokozómentes körülmények között tartottuk a Xinjiang Egyetem Állategészségügyi és Jóléti Egyetem Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának (ACUC) irányelveinek megfelelően. Az állatkísérleti eljárásokat a Xinjiang Egyetem AUCC hagyta jóvá.

Vizes kivonatok kinyerése

A C. deserticola egy növény Kínában, Hszincsiang tartományban. A nyers poliszacharidot vizes extrakcióval és etanolos kicsapással kaptuk. Röviden, 100 g szárított C. deserticolát porrá őröltünk, majd leszűrtünk. A port petroléterrel szobahőmérsékleten többször visszafolyató hűtő alatt forraljuk, majd vízmentes etanollal 1 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk, hogy eltávolítsuk a színes összetevőket és a lipideket. A maradékokat forrásban lévő vízzel háromszor extraháltuk, és az extraktumokat egyesítettük, 4000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 10 percig, és 60 °C-on 4 órán át visszafolyató hűtő alatt forraltuk. Az oldathoz négyszer 95%-os etanolt adtunk a nyers poliszacharidok kicsapása céljából. A nyers poliszacharidokat újra feloldottuk desztillált vízben, és Savage reagenssel kezeltük a fehérjék eltávolítására. A kivonatokat PBS-ben oldottuk, és a 022- μm-es szűrőn keresztül sterilizáltuk. Végül a WPCD teljes cukortartalma 59,58 százalék volt, amint azt a fenol-kénsav analízis mutatta [24].

DC-k generálása

A BM-DC-ket a korábban leírt módszer szerint állítottuk elő, kis módosításokkal [25]. A C57BL/6 egerekből származó csontvelői DC-ket RPMI-1640 komplett tápközeggel (Gibco) öblítettük ki, amelyet 10% magzati borjúszérummal (Hyclone) egészítettünk ki. Az összegyűjtött sejteket 50 μM-merkaptoetanolt (Sigma, St Louis, MO) és 20 ng/ml egér GM-CSF-et (Peprotech, Rocky Hill, NY) tartalmazó RPMI{7}} tápközegben újraszuszpendáltuk, és 37 °C-on inkubáltuk. C 5 százalékos CO2 atmoszférában. A táptalaj felét 1-2 naponta friss, GM-CSF-et tartalmazó táptalajra cseréltük. A sejteket a 6. napon összegyűjtöttük, különböző dózisú WPCD-vel, LPS-sel (100 ng/ml) (Sigma, St Louis, MO) kezeltük 24 órán át, majd áramlási citometriával értékeltük.

DC-k érésének és T-sejt aktiválódásának kimutatása in vitro

A WPCD BM-DC-kre gyakorolt ​​in vitro érési hatását FAC-ok fenotípusos analízisének eredményei alapján értékeltük. A 7. napon a C57BL/6-ból származó BM–DC-ket GM-CSF jelenlétében indukáltuk, majd különböző koncentrációjú WPCD-vel kezeltük (0.01, 0.{11) }}2, 0,05, 0,1 és 0,2 mg/ml) 12 órán keresztül három párhuzamosban. LPS-t (100 ng/ml) használtunk pozitív kontrollként. Miután a BM-DC-ket PBS-ben mostuk, és Fc-blokkot (BD Biosciences, CA) használtunk a nem specifikus antitest-kötődés megakadályozására, a sejteket PBS-ben festettük meg megfelelő FITC-, PE- vagy APC-konjugált CD40, CD11c, CD{ {24}}, CD80 és MHC-II antitestek (BD) 20 percig 37 ˚C-on. A megfestett sejteket FACs Calibur (BD) detektáltuk. Az adatok elemzése FlowJo szoftverrel (Tree Star) történt.

Az in vitro DCS érési kísérletben sejttenyészet felülúszókat is gyűjtöttünk az IL-12 és a TNF- elemzésére citokin tesztkészletek (Boster, Wuhan, Kína) segítségével a gyártó utasításai szerint. Az abszorbanciát 450 nm-en ELISA lemezleolvasóval (Bio-Rad, USA) mértük. A mintákban lévő citokin mennyiségeket a rekombináns citokinek standard görbéivel számítottuk ki regressziós lineáris módszerrel.

Allogén stimuláló aktivitásuk tesztelésére a kevert limfocita reakció (MLR) kísérletét végeztük az előző módszer szerint [26] MTT (Sigma, St Louis, MO) assay segítségével. Röviden, a stimulátorsejtekként használt C57BL/6 egerekből származó BM-DC-ket a 7. napon RPMI-1640 tápközegben plusz GM-CSF-ben kinyertük, és különböző koncentrációjú WPCD-vel kezeltük 12 órán keresztül 37 °C-on. A sejteket mostuk, és RPMI{10}} tápközegben újraszuszpendáltuk, mielőtt a 24-lyuklemezre szélesztettük. BALB/c egerekből izoláltuk a válaszadó sejteket. A BM-DC-ket lépsejtekkel kevertük 1:5 és 1:10 arányban. A sejteket 37 °C-on tenyésztettük 5 százalékos CO2 atmoszférában három napig, három párhuzamosban. Pozitív kontrollként LPS-kezelést alkalmaztunk. Ezt követően a tenyészetekhez 20 μL MTT-t adtunk az utolsó 4-órás tenyésztéshez. A mérési hullámhosszon (490 nm) és a referencia hullámhosszon (650 nm) mértük az abszorbanciákat a T-sejt proliferációs analízishez. Minden mintát háttérkontrollhoz mértünk.

Kezelés TLR4 inhibitorral in vitro

A BM-DC-ket 5 μM TAK-242-dal (TLR4 inhibitor, Medchemexpress Inc.USA) előkezeltük 1 órán át, majd különböző koncentrációjú WPCD-vel (100 és 200 ug/ml) együtt tenyésztettük 12 órán keresztül. a Golgi Stop jelenlétében vagy hiányában három példányban. A pozitív kontrollhoz LPS került hozzáadásra. A sejteket és a felülúszókat a CD86 és a CD40 felszíni markerek, valamint a TNF-a és az IL-12 citokinek elemzéséhez ELISA-val detektáltuk.

Immunizációs protokoll

Akut toxicitási teszt. Ebben a vizsgálatban az orális akut toxicitási tesztben 4 0 egészséges felnőtt ICR egeret használtak. Az ICR egereket egy éjszakán át éheztettük (ételt, de nem vizet) az adagolás előtt. A WPCD-t orálisan adtuk be 0, 50, 500 vagy 5000 mg/ttkg dózisban minden állatnak 7 napon keresztül. Sóoldattal kezelt és timsóval kezelt egerek kerültek a kontrollcsoportba. Az állatokat naponta megfigyeltük 14 egymást követő napon. Az egereket egyenként figyelték meg, hogy rögzítsék a mortalitást és a klinikai tüneteket. Ezenkívül a kísérlet során a testtömegeket, valamint a táplálék- és vízfogyasztásukat is mérték. A 14. napon a lép vagy csecsemőmirigy indexét a következőképpen számítottuk ki: (lép vagy csecsemőmirigy tömege/testtömeg) × 10.

A WPCD immunmoduláló aktivitás kimutatása in vivo. Annak vizsgálatára, hogy a WPCD rendelkezik-e immunmoduláló hatással, az ovalbumint (OVA) (Sigma) használtuk modellantigénként, és a nőstény ICR egereket véletlenszerűen 7 csoportra osztották (negatív kontrollcsoport (0,9 százalék NaCl és 400 ug WPCD) és a pozitív kontroll (200 ug timsó OVA-val)). Az egereknek kétszer szubkután, 10 ug OVA-val önmagában vagy WPCD-vel OVA-val 20, 100 vagy 400 ug dózisban, 2-hetes időközönként. Az emlékeztető oltás után vérmintákat és lépet vettünk az IgG titerek, az IgG alosztályok, a lépsejtek proliferációja és a citokin, a DCs felszíni markerek és a Treg frekvencia kimutatása érdekében.

OVA-specifikus antitestek kimutatása

Az OVA-specifikus IgG titereket és alosztályokat ELISA-val vizsgáltuk az előző módszer szerint [27]. Az ELISA lemezeket (Nunc, Thermo Fisher Scientific) egy éjszakán át bevontuk, majd blokkoltuk. A szérummintákat sorozathígítottuk az IgG titer elemzéséhez vagy az IgG1 és IgG2a kimutatásához (Southern Biotech, Inc.). A lemezeket ezután HRP-konjugált anti-egér IgG-t, IgG1-et és IgG2a-t tartalmazó PBST-vel inkubáltuk 1 órán át 37 °C-on. A kolorimetriás reakciót tetrametilbenzidinnel (TMB) fejlesztettük ki, majd a 450 nm/655 nm-en mért abszorbanciákat optikai sűrűség (OD) egységekben fejeztük ki.

Lépsejtek proliferáció és citokin kimutatása

A lépsejtek proliferációját MTT vizsgálattal határoztuk meg. Az első vakcinációt követő 21. napon egyetlen lépsejt-szuszpenziót kaptunk. A sejteket RPMI-1640 táptalajban tenyésztettük 96-lyukú lemezeken, 1×106 sejt/lyuk koncentráció szerint három párhuzamosban. A tenyészeteket OVA-val (végső koncentráció 10 ug/ml), ConA-val (végső koncentráció 5 ug/ml) (Sigma, St Louis, MO) és LPS-sel (végső koncentráció 100 ng/ml) stimuláltuk 48 órán keresztül 37 °C-on. . A sejteket 48 órán át tenyésztettük, és 20 μl (5 mg/ml) MTT-t (Sigma, St Louis, MO) adtunk minden egyes lyukba, és további 4 órán át inkubáltuk. Miután minden lyukba 50 μl DMSO-t adtunk a színfejlődés megállítására (Sigma), a lemezeket 570 nm-en olvastuk le mikrotiterlemez-leolvasóval (Bio-Rad, CA, USA). A lépsejtek proliferációját stimulációs indexként (SI) fejeztük ki, amely a stimulált lyuk OD570 nm aránya a nem stimulált lyukhoz képest.

Az IL-4 és az IFN- hozamát a T-sejtekben intracelluláris citokinfestéssel mérték egy publikált protokoll szerint, kisebb módosításokkal [27, 28]. Az első vakcinázást követő 21. napon egyetlen lépsejt szuszpenziót készítettünk. A vörösvérsejt-lízis után a lépsejteket (2×106 sejt/ml) OVA-val (10 ug/ml) inkubáltuk 4-órás stimulációig, majd Golgi stopot (BD) adtunk hozzá 12 órás inkubációhoz, PMA-t pozitív kontroll. A sejteket összegyűjtöttük, PBS-sel mostuk, CD4-FITC/CD8-FITC-vel megfestettük, és Cyto fix/Cytoperm kittel (BD) rögzítettük és permeabilizáltuk a gyártó utasításai szerint. Az intracelluláris citokinfestést a megfelelő koncentrációjú IL-4-PE vagy IFN- -APC antitestekkel 4°C-on 20 percig végeztük. A festett sejteket FAC-okkal detektáltuk. Az adatok elemzése a FlowJo-ban történt.

A DC-k érésének és a lépben lévő Treg-sejtek értékelése

Egerekben a lépsejtekből származó DC-k érésének elemzéséhez sejtfelszíni festést végeztünk CD11c-PE, CD40-FITC és CD80-APC antitestekkel. Az első vakcinázást követő 3. napon egyetlen lépsejt szuszpenziót (1 × 106 sejt/ml) kaptunk, és a sejteket kétszeres festésnek vetettük alá. A fluoreszcens intenzitást a FACs Calibur mérte, a mért adatokat pedig a FlowJo elemezte.

Annak megfigyelése érdekében, hogy a WPCD csökkentheti-e a CD4 plusz CD25 plusz Foxp3 plusz Treg sejtek gyakoriságát. A második vakcinációt követő 7. napon egyetlen lépsejt szuszpenziót készítettünk. A lépsejteket (2×106 sejt/ml) sejtfelszíni festésnek vetettük alá CD4-APC antitesttel, majd nukleáris citokin festést végeztünk megfelelő CD25-FITC és Foxp3-PE antitestekkel. az egér szabályozó T-sejtfestő készletet (eBios ciences) a gyártó utasításai szerint. A CD4 plusz CD25 plusz Foxp3 plusz Treg sejtek gyakoriságát FAC-okon tesztelték. Az adatok elemzése a FlowJo-ban történt.

Statisztikai analízis

Egyutas varianciaanalízis (ANOVA) teszteket (Tukey Multiple-Comparison Test) végeztünk a több kísérleti csoport közötti különbségek elemzésére. Valamennyi érték átlag ±SD-ben van kifejezve. P< 0.05="" is="" believed="" to="" be="" statistically="" significant.="" the="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" prism="" 5.0="">

Eredmények

A WPCD elősegítette a BM-DC-k érését és működését in vitro

Az adaptív immunitást a DC-k aktiválása határozza meg, beleértve a kostimuláló molekulák és citokinek típusait [29, 30]. Kezdetben azt vizsgáltuk, hogy a WPCD elősegítheti-e a kostimuláló molekulák expresszióját. A WPCD különböző dózisainak megfelelően C57BL/6-ból származó BM-DC-ket adtunk be. A sejtekben a CD11c, CD86, CD80, CD40 és MHC-II expressziós szintjét elemeztük (1. ábra). Az SSC-vel és FSC-vel kapuzott sejtek azt mutatták, hogy a különböző dózisú WPCD-kezelés nem változtatta meg a BM-DC-k morfológiáját (az adatokat nem mutatjuk be). A CD86, CD80 és CD40 expressziós szintje dózisfüggő módon szignifikánsan megemelkedett a kezeletlen csoporthoz képest, és a WPCD 20 ug/ml dózisa alatt elérte a platót, de a különbség nem szignifikáns az LPS-csoporthoz képest (1A–1C. ábra). Az MHC-II expressziós szintje szignifikánsan megnőtt a maximális értékre 50 ug/ml dózis alatt (1D. ábra). A sejtfelszíni markerek elemzési eredményei azt mutatták, hogy az LPS-sel vagy WPCD-vel kezelt DC-k szignifikánsan megnövekedett CD86, CD80, CD40 és MHC-II expressziós szinteket mutattak, és elősegítették a fenotípusos érést.

Egyes adjuvánsok növelhetik a kostimuláló molekulákat a DC-ken, vagy közvetlenül indukálhatják a citokinek szekrécióját. Az IL-12 és a TNF- a Th1 immunválaszt aktiváló fő citokinek. Elemeztük a citokin hozamát BM–DC-kben WPCD kezelés után. Miután a BM–DC-ket 12 órán át különböző tartalmú WPCD-vel kezeltük, a felülúszót összegyűjtöttük, hogy ELISA kittel kimutatjuk az IL-12 és a TNF- tartalmát. A WPCD dózisfüggően növelheti az IL-12 (2A. ábra) és a TNF- (2B. ábra) termelését. Az eredmények azt mutatták, hogy a WPCD indukálhatja a DC-k funkcionális érését

Immunválasz esetén funkcionálisan aktiválni kell a DC-ket. Ezután az allogén T-sejt proliferáció magasabb szintjét a teljesen érett DC-k indukálták. Ezért a DC-k WPCD-re adott funkcionális válaszát az MLR vizsgálta. A WPCD-indukált DC-k allostimulációs képessége, hasonlóan az LPS-hez, drámaian megnövekedett dózisfüggő módon a jelzett arány mellett (2C és 2D ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a WPCD javította az antigénprezentációt és optimalizálta a T-sejtes választ az MLR által in vitro.

A WPCD elősegítette a DC-k érését a TLR4 útvonalon keresztül

A fenti eredményekből arra lehet következtetni, hogy a WPCD által aktivált BM-DC-k az LPS-hez (egy TLR4 ligandum) hasonló DC-k felszíni molekula expresszióját jelezték. Feltételeztük tehát, hogy a BM-DC-ket a WPCD aktiválja a TLR4 útvonalon keresztül. Miután a BM-DC-ket TAK-242 (TLR4 inhibitor) előkezeltük, majd 12 órán keresztül WPCD-vel és LPS-sel együtt tenyésztettük, a CD40, CD86, TNF-a vagy IL{{12} }} volt kimutatható FAC vagy ELISA segítségével. A 3A. és 3B. ábrákon látható, hogy a TAK-242 kezelés az LPS vagy WPCD által indukált CD40 és CD86 szignifikánsan lecsökkent expresszióját, valamint IL-12 vagy citokintermelést eredményezett. A TNF-a szintén szignifikánsan csökkent (3C. és 3D. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a WPCD aktiválhatja az egyenáramú érést a TLR4 útvonalon keresztül.

A WPCD fokozta a humorális és celluláris immunitást

Összehasonlítás céljából értékeltük a WPCD hatásait a humorális immunválasz kiváltására OVA-val immunizált egerekben. A vakcinázás előtt, valamint az első vakcinázást követő 14., 21., 35. és 49. napon vért vettünk az IgG titer és az IgG alosztályok szérumának ELISA-val történő kimutatására. Az OVA-ra adott IgG antitest-válasz a WPCD adagolásának növelésével (100 és 400 ug) dózisfüggő módon nőtt (4. ábra). Az optimális koncentráció 100 ug/ml WPCD volt, és kétszeresére növelte az IgG-válaszokat a 21., 35. és 49. napon önmagában az OVA-hoz képest (4A. ábra). Az OVA-specifikus IgG1 és IgG2a antitestszintek jelentős növekedését tapasztaltuk 20 és 100 ug WPCD beadása alatt a szérumban a 35. napon az OVA-csoporttal összehasonlítva (4B. ábra). Eközben az Alum csak az OVA-specifikus IgG és IgG1 antitestek expressziós szintjét segítette elő az immunizált egerekben. A WPCD önmagában nem váltott ki OVA-specifikus antitesteket. A fenti eredmények nyilvánvalóan azt mutatták, hogy a WPCD magasabb antitesttitereket és kiegyensúlyozottabb Th1/Th2 választ generált, mint az Alum.

A lépsejtek proliferációja a celluláris immunitás másik mutatója. A ConA stimulálja a T-sejteket, az LPS pedig a B-sejtek proliferációját. Az első vakcinázást követő 21. napon egyetlen lépsejt szuszpenziót kaptunk, és OVA-val (10 ug/ml), OVA323-339 (10 ug/ml) peptiddel, ConA-val (5 ug/ml) és LPS-sel (5) stimuláltuk. ug/ml) 48 órán át. Ezután MTT módszerrel mértük a T-sejtek proliferációját. A WPCD szignifikánsan elősegítheti az OVA-antigén, a Con A-mitogén és az LPS mitogén által stimulált lépsejtek proliferációját az OVA-val és WPCD-vel immunizált egerekben (5. ábra), és a WPCD optimális koncentrációja 100 ug/ml volt. Ezek az adatok azt mutatták, hogy a WPCD vakcina adjuvánsként OVA-val immunizált egerekben hatékonyabban képes indukálni a T-sejtek és B-sejtek aktiválását, mint az Alum.

Az összes tesztelt WCPD adjuváns, amelyet OVA-vakcinákkal formuláztak, egyformán erős humorális és celluláris immunitást generált (4. és 5. ábra). Ezen adatok alapján a WPCD OVA-specifikus T helper (Th) sejtválaszra gyakorolt ​​hatásának további értékeléséhez tovább elemeztük a citokin expressziót CD8 plusz és CD4 plus T sejtekben áramlási citometriával (6. ábra). Az első vakcinázást követő 21. napon egyetlen egerek lépsejteket izoláltunk, majd együtt tenyésztettük az OVA-val (10 ug/ml). Az IL-4 hozam a CD4 plusz T-sejtekben a 100 ug OVA/WPCD-vel kezelt csoportban szignifikánsan magasabb volt, mint az OVA/Alum csoportban és az OVA-csoportban, és hasonló volt a PMA-hoz (6A. ábra). Ezenkívül az IFN-hozam a CD8 plus és CD4 plus T-sejtekben szintén szignifikánsan megnövekedett az OVA/WPCD-vel (20, 100 és 400 ug) beadott egerekben (6B. és 6C. ábra). Az Alum adjuvánshoz képest a WPCD jobb képességet mutatott a T-sejtek IL-4 és IFN-szekréciójának indukálására.

A WPCD stimulálta a DC-k érését, és csökkenti a Treg-frekvenciát in vivo

A DCS-t a legerősebb APC-kként ismerik el, amelyek részt vesznek az elsődleges immunválasz kiváltásában. Így az első vakcinázást követő 3. napon megvizsgáltuk a WPCD CD40-re és CD80-ra gyakorolt ​​hatásait a lépben lévő DC-kre (7A és 7B ábra). Az 100-ug OVA/WPCD csoport egerei szignifikánsan magasabb CD40 és CD80 szintet produkáltak DC-ken, mint az OVA/Alum csoportban lévők. Ezek az adatok azt mutatták, hogy a WPCD aktiválhatja a DC-ket és indukálhatja a DC-k érését egerekben. A Treg sejtek egyensúlyba tudják hozni a toleranciát és az immunválaszokat. Annak további vizsgálatára, hogy a WPCD hogyan modulálta az immunválaszt, az egerek lépében lévő Treg sejteket egér szabályozó T-sejtfestő készlettel festették meg. Az első vakcinázást követő 21. napon a CD25 plusz Foxp3 plusz Treg sejtek gyakoriságának csökkenése volt megfigyelhető az összes CD4 plusz T sejtben (7C. ábra). Az OVA és OVA/Alum csoportokhoz képest a WPCD csoport szignifikánsan csökkent Treg gyakoriságot mutatott.

A WPCD biztonsági értékelése egerekben

Az orális akut toxicitás becslésére akut toxicitási tesztet végeztünk. Az 5000 mg/testtömegkilogramm orális adagolású egerek nem mutattak rendellenes viselkedést vagy mellékhatásokat, és nem találtak mortalitást a toxicitás-értékelő tesztben. Nem észleltek szignifikáns különbséget a testtömeg-gyarapodásban, a csecsemőmirigy-indexben és a lépindexben a különböző WPCD-dózisokkal kezelt egerek különböző csoportjai között, és nem volt szignifikáns különbség (1. táblázat). 14 nap elteltével nem figyeltek meg elhullást. Ezért a WPCD LD50 értéke több mint 5000 mg testtömeg-kilogrammonként.

Annak tesztelésére, hogy a WPCD negatív hatással volt-e az egerek növekedésére a szubkután vakcinázás előtt és után, minden egyes egér testtömegét meghatároztuk (2. táblázat). Az egerek ezt követő megfigyelése során nem figyeltek meg mellékhatásokat vagy rendellenes viselkedést. Emellett a WPCD-vel és a sóoldattal vagy OVA/Alum-mal kezelt egerek testtömege nem mutatott szignifikáns különbséget. Ezek a megfigyelési eredmények azt mutatták, hogy a WPCD beadása biztonságos volt.

Vita

Az adjuvánsok kulcsfontosságú komponensek a vakcinákban [31]. A genomika és proteomika fejlődésének köszönhetően egyre több rekombináns és szintetikus vakcina molekula kerül azonosításra. Ezért több adjuvánsra és készítményre van szükség. Egyes hatásos adjuvánsok általában fokozott toxicitással kapcsolatosak, például az FCA. Ezért olyan biztonságos készítményt kell találni, amely különböző szinergetikus komponenseket tartalmaz, amelyek végül kiváltják a kívánt immunválaszt. A kínai gyógynövényekből származó poliszacharidok nem mérgezőek, és nem mutatnak jelentős mellékhatásokat [32,28]. Egy bizonyos vakcinához biztonságos adjuváns szükséges.

A Cistanche deserticola egy fontos tonizáló gyógynövény, amely széles körben elterjedt a száraz területeken és a meleg sivatagokban Kína északnyugati részén. A Cistanche deserticola bioaktivitása miatt széles körben érintett, beleértve az immunmoduláló, antioxidáns, antibakteriális és daganatellenes hatásokat [20,21]. Némi előrelépés történt a Cistanche deserticola szerkezeti jellemzésében és immunológiai aktivitásában, amely jó jelölt adjuvánsok kifejlesztéséhez. Kísérletileg értékeltük a WPCD adjuváns hatásait és mechanizmusát in vitro és in vivo. A WPCD szubkután beadása jelentősen elősegítette a humorális és celluláris immunválaszokat a szérum antitestek és a limfocita proliferáció növelésével, a citokinek expressziójának fokozásával, a DC érésének fokozásával és a CD4 plusz CD25 plusz Foxp3 plusz Treg sejtek gyakoriságának leszabályozásával.

A DCS kulcsfontosságú APC-k a naiv T-sejtek indításához. A DC-k aktiválása fontos az adjuvánsok számára. A DCS-t, különösen az egérvelőből származó DC-ket gyakran használják adjuvánsok és vakcinák értékelésére. Az áramlási citometria képes megkülönböztetni azokat a sejteket, amelyek egy antigén befogása után aktiválódtak a környező sejtektől. Az FCM elemzésben a stimulált sejtek aggregációjának mértéke közvetett mutatója az immunmodulátorok biztonságosságának értékelésében [3]. Így a WPCD adjuváns aktivitási adatai DC-kben in vitro értékes információkkal szolgálhatnak az állatmodellek számára. A BM-DC modell alapján az MHC-II, CD86, CD80 és CD40 expressziós szintjeit, a citokintermelést és az allogén T-sejt proliferációt az optimális WPCD koncentráció tartományban detektáltuk. Az MHC-II, CD86, CD80 és CD40 expressziós szintje a BM-DC-kben megemelkedett, a TNF-a és IL-12 hozama pedig dózisfüggő módon nőtt. Megfigyelték az allogén T-sejt proliferációt. A BM-DC-k morfológiája nem változott. A BM-DC-k aktivációjának és a gyulladásos citokinek szekréciójának in vitro indukálásával a WPCD adjuváns jelentősen növelheti az antigén mennyiségét és az APC-k mennyiségét, és serkentheti a T-sejteket IFN-szekrécióra, ami hozzájárul az immunmoduláló aktivitás fokozásához.

Különféle kínai lágyszárú poliszacharidok képesek aktiválni az immunrendszert, és kiváló adjuváns képességekkel rendelkeznek azáltal, hogy serkentik a DC-k érését a TLR4 útvonalon [33,28]. Így feltételezzük, hogy a TLR4 részt vesz a WPCD-indukált DC-k érésének jelátviteli útvonalában. Ahogy az várható volt, a TLR4 gátló kezelések a TNF-a és az IL{7}} szignifikáns csökkenését eredményezték. Ezenkívül a TLR4 útvonal gátlása a CD 40 és CD80 expresszióját is gátolta a DC-ken, ami azt jelzi, hogy a DC-k érése a TLR4-től függ. Ezért nyilvánvaló, hogy a TLR4 részt vesz a WPCD által kiváltott DC-k érésében.

Az adjuvánsok és a vakcinakészítmény optimális dózisát számos kísérlet során empirikusan határozzák meg. Annak érdekében, hogy feltárjuk a WPCD adjuváns és az OVA antigének dózis-válasz összefüggését egerekben, különböző WPCD dózisokat választottunk ki a BM-DC-kből származó in vitro korábban közölt adatok alapján, hogy kétszer szubkután adjunk ICR egereket. Megállapítottuk, hogy a WPCD szignifikánsan megnövelte az OVA-specifikus antitestek termelését, és kiegyensúlyozott Th1/Th2 immunválaszt indukált az IgG1 és IgG2a szint növekedésével. Különösen az IgG2a szintje volt magasabb, mint az optimális dózisban Alum-mal kezeltnél. Ezért a WPCD magasabb szintű specifikus antitesteket és nagyobb hatékonyságot eredményezett az alacsonyabb injekciók mellett.

Az új vakcinákhoz erős sejtválaszok indukálására van szükség, amelyek magukban foglalják az antitesteket, a T-helper (Th) sejteket és a citotoxikus T-limfocitákat (CTL). A terápiás vakcina célja erősebb T-sejtes válaszok kiváltása. Az ideális adjuváns növeli a vakcina hatékonyságát és elősegíti a sejt által közvetített immunitást anélkül, hogy toxikus hatásokat okozna [34]. Az immunizált egérmodelleken végzett megfigyelések közül a WPCD az OVA-specifikus és a nem specifikus lépsejtek proliferációjának növekedéséhez vezetett az Alumhoz képest. Egyes adjuvánsok fokozzák a citokinek és az immunrendszer szabályozását. Például a szaponinok stimulálhatják a sejt által közvetített immunválaszt egy olyan antigénre, amely általában csak antitesteket indukál. Az IL-4-t és az IFN-t választottuk indikátorként az egerek immunitási szintjének közvetett értékelésére. A WPCD több IL-4 és IFN-szekréciót tud indukálni, mint az Alum. Így a WPCD-oltás eredményeként erős helper T-sejt-válaszokat és citokinszekréciót figyeltek meg, ami arra utal, hogy a WPCD hatékonyabban tudta stimulálni a limfocitákat a Th1-típusú citokin és a Th{13}} típusú citokin kiválasztására, mint a Timsó.

Az antigénprezentációt befolyásoló adjuvánsok összetett immunfolyamatokat is befolyásolhatnak. A Treg sejtek képesek módosítani a Th1 és Th2 válaszokat [35]. A WPCD megfelelő dózisa elősegítheti a DC-k érését egerekben azáltal, hogy növeli a CD80 és CD40 expressziós szintjét, és felerősíti az OVA antigén prezentációs képességét a korai immunválaszban. A DCS-aktiváció és a Treg-frekvencia kísérleti eredményei azt mutatták, hogy a WPCD indukálta a DC-k érését, és csökkentette a Treg-frekvenciát egerekben a lépben. Ezek az eredmények bebizonyították, hogy a WPCD fokozta az OVA-vakcinák hatékonyságát azáltal, hogy növeli az antigénprezentáló sejtek célba juttatását és elősegíti a T-sejt-specifikus aktivációt.

Adjuvánsok kifejlesztése során nehéz szelektíven kiváltani a megfelelő immunválaszt a megfelelő fertőzéssel szemben. A megfelelő adjuvánsnak alacsony mellékhatásokkal és toxicitással kell rendelkeznie az emberekre vagy állatokra. Ezért figyelembe kell venni a WPCD biztonságát, beleértve az azonnali és hosszú távú mellékhatásokat is. Ebben a vizsgálatban a WPCD akut toxicitását és a WPCD egerek növekedési teljesítményére gyakorolt ​​negatív hatását 110 napig vizsgáltuk. A WPCD akut toxicitásának eredményei azt mutatták, hogy a testtömeg, a csecsemőmirigy-index vagy a lépindex nem mutatott szignifikáns különbséget. A WPCD LD50 értéke több mint 5000 mg testtömeg-kilogrammonként. Az egerek kísérleti későbbi megfigyelése során nem találtak mellékhatást vagy kóros viselkedést az egereknél. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a WPCD biztonságos.

Összefoglalva, ebben a tanulmányban a WPCD, a Xinjiangból származó C. deserticolából kivont nyers poliszacharid, bizonyos adjuváns tulajdonságokat mutatott. Például a WPCD fokozta mind a Th1, mind a Th2 válaszokat azáltal, hogy aktiválta a DC-ket, növelte az antitestválaszokat, és javította a citokintermelést. Ezenkívül megvizsgáltuk a WPCD hatékonyságának mechanizmusát a DC-k érésének és működésének a TLR4 útvonalon keresztül történő in vitro elemzésével. A csak WPCD-vel kezelt egereknél nem figyeltek meg nyilvánvaló mellékhatást. Ezért a WPCD magasabb immunstimuláló aktivitással rendelkezett a celluláris és humorális immunválaszokban. Az adjuvánsok több vegyület keveréke. Több nyers kivonat keverékének nagyobb jótékony hatásai lehetnek, mint egyetlen növényi kivonatnak. Szükséges a WPCD-kivonatok szisztematikus feltárása, hatékonyságuk és biztonságosságuk tesztelése, hatásmechanizmusuk tisztázása.

Segítő információ

S1 fájl. ÉRKEZÉS Ellenőrzőlista. (DOCX)

Köszönetnyilvánítás

Külön köszönet Bing Wangnak és Daocheng Wu-nak, hogy jó ötleteket adtak a kísérletekhez.

Szerzői hozzájárulások

Koncepció: Ailian Zhang, Bin Wang, Daocheng Wu.

Az adatok gondozása: Xiumei Yang, Yu Yang. Formális elemzés: Ailian Zhang, Quanxiao Li.

Finanszírozás beszerzése: Ailian Zhang.Projekt adminisztráció: Ailian Zhang.

Források: Ailian Zhang, Gan Zhao. Írás – eredeti vázlat: Ailian Zhang.

Írás – áttekintés és szerkesztés: Ailian Zhang, Daocheng Wu.