A terhességi alacsony fehérjebevitel hatása az embrionális vese mikroRNS expressziójára és a hím magzat nephron progenitor sejtjeiben

edmund.chen@wecistanche.com

Bevezetés

A tápanyaghiány a magzati fejlődés különböző szakaszaiban jelző változásokat eredményezhet a sarkalatos pályákban, ami felnőttkorban visszafordíthatatlan szervi és rendszeri rendellenességeket okozhat [1]. A magzati programozás minden olyan sértést jelent a fejlődés során, amely hosszú távú hatást gyakorol a szervezet szerkezetére vagy működésére [2]. A magzati programozási zavarok alacsony születési súlyt, kevesebb nefront, valamint a szív- és érrendszeri betegségek kockázatának növekedését eredményezik.vese-felnőttkori rendellenességek [3–6]. Más szerzők és mi tanulmányok alacsonyabb születési súlyt, 28 százalékkal kevesebb nefront, csökkentettvese-sókiválasztás, krónikusveseelégtelenség, valamint artériás hipertónia a terhességi alacsony fehérje (LP) bevitelben, összehasonlítva a felnőttkori standard (NP) fehérjebevitellel [3–7]. A nefrogenezis magában foglalja a génexpresszió, a fehérjeszintézis és a szöveti remodelling szigorú ellenőrzését. Tanulmányok kimutatták, hogy a nefronszámot az ureter bimbó (UB) és a metanephros mesenchyme (MM) progenitor sejtek közötti kölcsönhatások határozzák meg [8–10]. Az MM-ből származó jelek az UB-stimulált növekedést és a tubulusrendszer elágazását indukálják. Az MM proliferációját és differenciálódását, amely egy mesenchymalis sapkát (CM) alkot, az UB-végek közvetítik [11].

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEBETEGSÉGET

Komoly érdeklődés mutatkozott az epigenetikai változások szerepe iránt, a prenatális stressz hosszú távú hatásait illetően a magzati fejlődésben [12]. A mikroRNS-ek (miRNS-ek) genom által kódolt, körülbelül 22 nukleotid hosszúságú, kisméretű, nem kódoló RNS-ek, és alapvető szerepet játszanak a célgénexpresszió poszt-transzkripciós szabályozásában [13–16]. A miRNS-ek a génexpressziót poszttranszkripciósan szabályozzák az mRNS transzlációjának vagy a citoplazma stabilitásának szabályozásával [17, 18]. Funkcionális vizsgálatok azt mutatják, hogy a miRNS-ek részt vesznek a kritikus biológiai folyamatokban a fejlődés során és a sejtfiziológiában [13, 16]. Expressziójuk változását számos patológiában figyelték meg [16, 19]. Így a miRNS-ek jellemzése segített megérteni a génszabályozást és a sejtproliferációt, a differenciálódást és az apoptózist, valamint megmagyarázni a patofiziológiai rendellenességeket, beleértve aveserendellenességek [20–22]. A tanulmányok arról számoltak be, hogy közbenveseontogén miRNS-ek nélkülözhetetlenek a nephron fejlődéséhez [23–26]. Ezenkívül egyes miR NA-k alulexpressziója MM progenitor sejtekben csökkenti a sejtproliferációt, ami korai differenciálódást eredményez, és ennek következtében csökkenti a nefronok számát [27, 28]. Ezt a jelenséget fokozott apoptózis és magas Bim expresszió jellemzi a progenitor sejtekben [27]. Így a miRNS-ek módosítják az apoptózis és a metanefris primer sejtek proliferációja közötti egyensúlyt [29].

Feltételeztük, hogy ismeretlen epigenetikai változások és miRNS-expressziós profilok társulnakvesefejlődési rendellenességek az anyai fehérje-korlátozott utódoknál. Ezért célunk volt a miRNS mintázatainak és a magzati génexpresszió előrejelzésének értékelésevesea terhesség 17. napján (17-DG) fehérje-korlátozott hím utódok, hogy azonosítsák a molekuláris útvonalakat és avese-során a sejtproliferáció és differenciálódásvesefejlődés.

Kulcsszavak:veseelégtelenség; vese tubuláris; vese rendellenességek; vesefejlődés; vese

Anyag és módszertan

Állat és étrendA kísérleteket a korábban részletesen leírtak szerint [5, 6] végezték a CEMIB/UNICAMP által szállított tenyészállományból származó, testvérpáros Wistar HanUnib patkányok (250–300 g) nőstény és hím patkányain. , Campinas, SP, Brazília. A környezet és a lakhatás megfelelő feltételeket teremtett egészségük és jólétük kezeléséhez a kísérleti eljárás során. Közvetlenül a három hetes korukban történő elválasztás után az állatokat szabályozott hőmérsékleten (25˚C) és fényviszonyok között (07:00–19:00 óráig) tartották, szabad hozzáférést biztosítva csapvízhez és szabványos laboratóriumi rágcsálótáphoz (Purina Nuvital). , Curitiba, PR, Brazília: Na plus tartalom: 135 ± 3 μEq/g; K plus tartalom: 293 ± 5 μEq/g), tenyésztés előtt 12 hétig. A São Paulo Állami Egyetem Állathasználati Intézményi Etikai Bizottsága (#446-CEUA/UNESP) jóváhagyta a kísérleti protokollt, és a Brazilian College of Animal Experimentation által meghatározott általános irányelveket követték a vizsgálat során. A terhesség 1. napját jelölték meg az a nap, amikor a hüvelykeneten spermiumok jelennek meg. Ezután az anyaállatokat ad libitum tartották a teljes vemhesség alatt egy izokalóriás laboratóriumi rágcsálótápon vagy standard fehérjetartalommal [NP, n=36] (17 százalék fehérje), vagy alacsony fehérjetartalommal [LP, n=51 ] (6 százalék fehérje). Az NP és LP anyai táplálékfogyasztást naponta határoztuk meg (utóbb testsúlyra normalizálva), az anyaállatok testtömegét pedig hetente rögzítettük mindkét csoportban. A terhesség 17. napján (17-DG) az anyákat ketaminnal (75 mg/kg) és xilazinnal (10 mg/kg) érzéstelenítettük, és a méhet szabaddá tették. A magzatokat eltávolították, és lefejezéssel azonnal elaltatták. A magzatokat lemértük, a farkát és a végtagjait pedig összegyűjtöttük ivarmeghatározás céljából. A metanephrost összegyűjtöttük a következő generációs szekvenálás (NGS), RT-qPCR és immunhisztokémiai elemzésekhez.

A CISTANCHE JAVÍTJA A vese-/veseelégtelenséget

Szexi elhatározásA jelen vizsgálatot csak hím 17-DG utódokon végeztük, és az ivarozást Sry hagyományos PCR (polimeráz láncreakció) szekvenciaanalízissel határoztuk meg. A DNS-t proteináz K-val és fenol-kloroformmal végzett enzimatikus lízissel extraháltuk. A reakcióhoz a Master Mix Colorless-Promegát használtuk, a gyártó cikluskörülményeivel. Az Integrated DNA Technologies (IDT) a következő primert szintetizálta: Előre: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Reverse: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.

Teljes RNS extrakcióAz RNS-t NP-ből (n=4) és LP-ből (n=4) egészben extraháltukveseTrizol reagenst (Invitrogen) használva, a gyártó utasításai szerint. A teljes RNS mennyiségét a 260 nm-en mért abszorbancia alapján határoztuk meg nanoVue spektrofotométerrel (GE Healthcare, USA). Az RNS integritását úgy biztosítottuk, hogy az Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Németország) segítségével egy RIN integritásszámot (RIN > 8) kaptunk [30].

miRNA-Seq és adatelemzésA szekvenálást MiSeq platformon (Illumina) végeztük. A protokoll követte a gyártó ben elérhető utasításaitRöviden, a szekvenálás magában foglalja a könyvtár felépítését, és ezt 1 ug teljes RNS-t használtunk. Ebben a lépésben az adapterek csatlakoztatva vannak, a 3 'és 5'. Az adapterek ligálása után reverz transzkripciós reakciót hajtottunk végre a cDNS létrehozása céljából. Ezt követően standard PCR-reakcióval amplifikáltuk, amely szekvenciaindexet tartalmazó primereket használ a minta azonosítására – ez a cDNS-könyvtár, amelyet agarózgél-elektroforézisnek vetünk alá a miRNS izolálása céljából. A mennyiségi meghatározás után a könyvtár koncentrációját 2 nM-ra normalizáltuk 10 nM Tris-HCl (pH 8,5) alkalmazásával, és a transzkriptom szekvenálást MiSeq Reagent Kit v2 segítségével végeztük (50 ciklus).

Az adatok elemzése Tao Chen, Ph.D. együttműködésben történt. a Genetikai és Molekuláris Toxikológiai Osztálytól, National Center for Toxicological Research, Jefferson, AR, USA. A miRNS-ek Next Generation Sequencing (NGS) adatait FASTA formátumban állítottuk elő, és importáltuk a BaseSpace.com webhelyre (Illumina, USA). Az adatok minőségét a gyártó (Illumina) által kifejlesztett alaphívó CASAVA szoftverrel értékeltük. Az elemzéseket a BaseSpace miRNA Analysis (a Torino Egyetemtől, Kanada) és a különböző miRNS-ek szekvenciatérképezését Small RNS-sel (Illumina, USA) végeztük patkány genomra. A differenciálisan expresszált miRNS vizsgálatot Ingenuity Pathway Analysis szoftverrel (Ingenuity, USA) elemeztük.

miRNS expresszió validálásaMinden csoportban négy hím utódot használtunk különböző almokból a miRNS-hez (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p és -199a-5p) kifejezéselemzés. Röviden, 450 ng RNS-t reverz transzkripcióval végeztünk előamplifikáció nélkül, a TaqMan1 Micro RNA Reverse Transcription Kit segítségével, a gyártó útmutatásai szerint. A komplementer DNS-t (cDNS) TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, USA) segítségével amplifikáltuk TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) segítségével StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM) rendszeren, a gyártó utasításai szerint. Az adatok elemzését az összehasonlító kvantifikációs módszerrel értékelt relatív génexpresszió (Pfaffl, 2001) alkalmazásával végeztük. A stabilitási elemzés alapján az U6 snRNS-t és az U87 scRNS-t használtuk referenciagénként. Az összes relatív kvantifikációt a DataAssist szoftverrel (v 3.0), a ΔΔCT módszerrel értékeltük ki. A miRNS-adatokat a MIQE irányelvek [31] követésével állítottuk elő.

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESE MŰKÖDÉSÉT

A megjósolt célgének RT-qPCR-jeA cDNS szintézishez a High Capacity cDNS reverz transzkripciós készletet (Life Technologies, USA) használtuk. Az RT-qPCR reakciók a Bax, Bim, kaszpáz-3, kollagén 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c esetén -ret, ciklin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 és IGF1 gént a SYBR Green Master Mix (Life Technologies, USA) végezte ) az IDT1 Integrated DNA Technologies által biztosított (1. táblázat). A reakciókat 20 μl össztérfogatban hajtottuk végre 2 μL cDNS (1:30 hígítás), 10 μL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, USA) és 4 μL mindegyik specifikus primer (5 nM) felhasználásával. Az amplifikációt és a detektálást a StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM) segítségével végeztük. A Ct értékeket relatív expressziós értékekké konvertáltuk a ΔΔCt módszerrel, az utódok metanephros adatait GAPDH-val mint referenciagénnel normalizáltuk [32].

immunhisztokémia,A magzatot (n {{0}} csoportonként) eltávolítottuk, és azonnal fixáltuk 4 százalékos paraformaldehidben (0,1 M foszfát, pH 7,4). Az anyagokat víztelenítették, diafániázták, és a paraplasztba helyezték, a blokkokat pedig 5-μm vastagságú metszetekre vágták. A szövettani metszeteket paraffinmentesítettük, és immunfluoreszcenciára és immunoperoxidázra feldolgoztuk. A szakaszok voltak

blokkoló oldattal inkubáltuk (8% magzati szarvasmarha-szérum, 2,5% szarvasmarha-albumin és 2% sovány tejpor PBS-ben). Ezt követően 1% sovány tejet tartalmazó PBS-ben hígított elsődleges antitesttel (anti-Six{5}}) állítsa be egy éjszakán át hűtve. PBS-sel történő mosás után a metszeteket egy specifikus másodlagos antitesttel inkubáltuk, az Alexa 488 fluoroforhoz konjugáltuk, és ugyanabban a pufferben hígítottuk, amely 1% tejet tartalmazott, 2 órán át szobahőmérsékleten. Az egymást követő PBS-mosás után a tárgylemezeket fedőlemezekkel szereltük fel Vectashield fluoreszcens összeszerelő közeggel (Vector Laboratories, Inc. Burlingame). A mintában lévő fluoreszcenciát lézeres konfokális mikroszkóppal detektáltuk. A képek a Focus Imagecorder Plus rendszerrel készültek. A c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF -1, - catenin, ZEB1, ZEB2, kaszpáz 3 hasított, ciklin A és WT1 fehérjék esetében immunhisztokémiát végeztünk. A tárgylemezeket hidratáltuk, majd 5 percig 7,2 pH-jú PBS-ben mostuk, majd az antigén visszanyerését pH 6-os citrát pufferrel végeztük.{23}} 25 percig gyorsfőzőben. A tárgylemezeket PBS-ben mostuk. Ezt követően hidrogén-peroxiddal és metanollal endogén peroxidáz blokkolást végeztünk 10 percig sötétben. A metszeteket újra mostuk PBS-ben. Ezután a nem specifikus kötődés blokkolását követtük, és a lemezeket blokkolóoldattal (5% sovány tejpor, PBS-ben) 1 órán át inkubáltuk. A metszeteket az 1%-os BSA-val hígított elsődleges antitesttel (2. táblázat) inkubáltuk egy éjszakán át hűtőszekrényben. PBS-sel történő mosás után a metszeteket szobahőmérsékleten 2 órán át a specifikus másodlagos antitest hatásának tesszük ki. A tárgylemezeket PBS-sel mostuk. A szeleteket DAB-val (3,3'-diaminobenzidin-tetrahidroklorid, Sigma-Aldrich CO1, USA) tártuk fel. Folyóvízben történő egymást követő mosás után a tárgylemezeket hematoxilinnal ellenfestettük, dehidratáltuk, és fedőlemezzel rögzítettük Entellan1 alkalmazásával. A képek fotomikroszkóppal (Olympus BX51) vagy Zeiss LSM 780-NLO konfokális Axio Observer Z.1 mikroszkóppal (Carl Zeiss AG, Németország) készültek, az Országos Tudományos és Technológiai Intézet sejtekre alkalmazott fotonikájáról. Biológia (INFABIC) a Campinasi Állami Egyetemen.

Morfológiai számszerűsítésParaffin 5 μmvesemetszeteket a CellSens Dimension szoftverrel elemeztük egy fotomikroszkópból (Olympus BX51). Azveseszeletekhez fértünk hozzá a nefrogén terület, a CM és UB fehérje és sejtszám, valamint a hematoxilin-eozin festett 17-DG LP magzatban (n=5) összehasonlítva az életkornak megfelelő NP utódokkal (n {{4) }}) különböző anyáktól. Minden elemzett metanephros összes CM-jét és UB-ját számszerűsítettük (4NP és 4LP különböző anyáktól), a statisztikai elemzést t-próbával végeztük, és az értékeket átlag ± SD-ben fejeztük ki. A p�0.05 szignifikánsnak számított. A GraphPad Prism v01 Software, Inc., USA-t a statisztikai elemzéshez és az ábrák készítéséhez használták.

Statisztikai analízisA t-próbát alkalmaztuk, és az értékeket átlag ± standard deviációban (SD) fejeztük ki. P�0.05 szignifikánsnak minősült. A statisztikai elemzéshez és az ábrák készítéséhez a GraphPad Prisma v. 01 szoftvert (GraphPad Software, Inc., USA) használtuk.

Eredmények

MiRNS-ek expressziója miRNS-SeqAz anyai fehérjeszegénységhez kapcsolódó mikroRNS-változások megértésevese-programozás során egy globális miRNS profilalkotási analízis kifejezését hajtottuk végre. 44 deregulált miRNS-t azonosítottak (p � 0,05), amelyek közül 19, illetve 25 miRNS volt felfelé vagy lefelé szabályozott (3. táblázat). A legjobban kifejezett miRNS-eket és funkcióikat, útvonalaikat és hálózataikat az Ingenuity Software segítségével azonosítottuk (4. táblázat).

A miRNS expresszió validálásaAz LP csoport állatainál a Let-7a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p felszabályozott volt, míg a miR-127-3p, miR-144-3p és miR-199a-5p alacsonyabb volt az NP állatokhoz képest. Az eredmények nem mutatnak különbséget a miR{10}} kifejezésben, összehasonlítva a két csoportot (1. ábra). Az 5. táblázat bemutatja a miRNS-ek szekvenálásával kapott értékeket az RT-qPCR validációs adatokkal. Noha szignifikáns miRNS expressziós különbséget figyeltek meg LP-ben az NP utódokhoz képest, a validált miRNS-ek fold változása (FC) hasonló volt mindkét technikához.

miRNS-gén célpontjai

A különböző miRNS-ek, például a Six-2, Bcl-2, PRDM1, ciklin A, PCNA, GDNF, kollagén 1, kaszpáz 3 és Bim expressziós génjei LP-ben nem különböztek szignifikánsan az NP-től. magzat. Azonban a Bax, a TGF -1 Bcl-6, a c-ret, a Map2k2, a Ki-67, az mTOR, a -catenin, a ZEB1, a ZEB2 és az IGF1 gén expressziója felfelé szabályozott a {{15} }}DG LP csoport összehasonlítva a korosztályos kontrollokkal. Ezzel szemben a c-Myc és a NOTHC1 csökkent az anyai fehérje-korlátozott utódokban (2. ábra).

Magzati testtömeg és metanephros morfometriaA 17-DG LP testtömege nem különbözött az életkornak megfelelő NP utódoktól. Azonban az LP metanephros mesenchymája 7,6%-kal kisebb területet és 29%-os kéregvastagságot mutatott, mint az NP-csoport (3. ábra).ImmunhisztokémiaA jelen vizsgálatban az LP magzat szignifikáns (körülbelül 69 százalékos) csökkenést mutatott a Six-2 cap fluoreszcenciájában, mint az NP utódokban (4. ábra).

A Six-2 immunoperoxidáz-elemzés csökkent sejtszámot (14 százalék) mutatott ki az LP CM-ben a 28 százalékkal csökkent Six-2 plusz sejtekhez képest a cap területhez viszonyítva, az NP-utódokhoz képest (4. ábra). A jelen tanulmány a c-Myc CM és UB immunfestett sejtek szignifikáns százalékos csökkenését (kevesebb 14 százalékkal) is kimutatta LP-ben az NP-utódokhoz képest (4. ábra). Ezenkívül a Ki-67-jelzett terület százalékos aránya CM-ben 48 százalékkal kisebb volt LP-ben, mint a magzati NP-ben, míg a Bcl-2 és a hasított kaszpáz-3 immunreaktivitás nem különbözött mindkét csoporttól (1. 5. és 6.). A jelen tanulmány a c-Myc CM és UB immunfestett sejtek szignifikáns százalékos csökkenését (kevesebb 14 százalékkal) is kimutatta LP-ben az NP-utódokhoz képest (4. ábra). Ezenkívül a Ki-67-vel jelölt terület százalékos aránya CM-ben 48 százalékkal kisebb volt LP-ben, mint a magzati NP-ben, míg a Bcl-2 és a hasított kaszpáz-3 immunreaktivitás nem különbözött mindkét csoporttól (1-1. 5. és 6.). Másrészt, LP-ben a CM és UB-catenin jelölt területek 154, illetve 85%-kal növekedtek az NP utódokban elérhetőhöz képest (7. ábra). Ugyanakkor az mTOR immunreaktivitás eloszlása ​​is lényegesen kiterjedtebb területet foglalt el LP CM-ben (139 százalék) és UB-ban (104 százalék), mint az NP magzatban (7. ábra). Az LP-utódokban a TGF -1 az UBS-sejtek festődésében nőtt (körülbelül 30 százalékkal), míg a CM-ben az immunfestett sejtek nem különböztek az NP-csoporthoz képest (8. ábra). A CM sejtmagsejtekben elhelyezkedő ZEB1 metanephros-festett 30%-kal fokozta az LP-t az NP magzathoz képest (8. ábra). Ugyanakkor a ZEB2 immunfluoreszcenciája, bár teljes metanephros struktúrákban jelen van, hasonló volt mindkét kísérleti csoportban (8. ábra). A jelenlegi tanulmány, figyelembe véve a miRNS és mRNS expresszióját és a fehérjéket

Vita

A nefrogenezis sejtes és molekuláris mechanizmusairól szóló ismeretek bővültek [33–37]. Azonban számos szabályozó tényező és jelátviteli út vesz résztvese-ontogenezis továbbra is tisztázatlan [38]. A miRNS-ek döntő szerepet játszanak a génexpresszió szabályozásábanvese-fejlődés [25, 39–41]. Tudomásunk szerint miRNS és mRNS expressziós elemzéseket anyai LP-bevitel 17-DG hím mesenchyma sejtjeiben nem végeztek. Javasolunk egy új molekuláris mechanizmust, amely a korai nefrogenezis gátlásában játszik szerepet, ami csökkenti a nefronok számát. NGS-t használtunk a miRNS expressziójának értékelésére, és azt találtuk, hogy 19 miRNS felfelé és 25 lefelé szabályozott a 17-DG LP-ben az NP metanephroshoz képest. A 10 legjobb deregulált miRNS közül kiválasztottunk 7 olyan miRNS-t, amelyek biológiai célpontjai részt vesznek a proliferációban, a differenciálódásban és a celluláris apoptózisban. Mind a miRNA-Seq, mind a TaqMan adatelemzés konzisztens és specifikus változásokat mutatott ki a miRNS expressziójában LP állatokban a kontroll NP korú állatokhoz képest.

A miR-181 család négy erősen konzervált tagból áll, nevezetesen miR-181a, miR-181b, miR-181c és miR-181d [ 42]. A neoplasztikus sejtekben a miR{6}a tumorszuppresszorként működik, gátolja a sejtproliferációt és -migrációt, valamint sejtes apoptózist indukál [43]. Ez a tanulmány a miR-181a-5p fokozott expresszióját tárta fel a 17-DG LP-ben az életkorban megegyező NP-utódokhoz képest. Bár a kaszpáz mRNS expressziója nem változott, a Bax/Bcl-2 mRNS arány kétszeres növekedése LP-ben az NP utódokhoz viszonyítva fokozott apoptózisra utal a CM-ben, ami azt jelzi, hogy az apoptózis poszttranszkripciósan szabályozott. Tanulmányok kimutatták, hogy a BCL család elősegíti a citokróm felszabadulását a mitokondriumokból, majd gátolja a Casp3 aktivációját, ezáltal gátolja a sejtes apoptózist [44]. Li és mtsai. akut tüdősérülési modellt használt annak feltárására, hogy a túlzott miR-181a csökkent Bcl-2 fehérjeszinttel van összefüggésben; fordítva, a miR-181a gátlás növelte a Bcl-2 szintet [45]. Ez a tanulmány megerősítette Lv és munkatársai eredményeit, akik kimutatták, hogy a miR-181c negatívan szabályozza a Six-2 expresszióját és a sejtproliferációt, párhuzamosan a mesenchymalis sejtek fenotípusának elvesztésévelvesefejlődés LP 17-DG utódokban [25].

Xiang et al. kimutatta, hogy a megnövekedett miR{0}} expresszió elnyomjavese-carcinoma proliferáció, ami rövidebb G2/M fázist eredményez. Ezenkívül Xiang et al. feltárta, hogy a miR-144 túlzott expressziója gátolja az mTOR gén és fehérje expresszióját [46]. Nijland et al. kimutatták, hogy az mTOR jelátvitel növekedése döntő fontosságú a nefronok számának meghatározásához azokban az embriókban, amelyek anyja tápanyagkorlátozásnak volt kitéve [47]. A rapamicin komplex 1 (mTORC1) emlős célpontja elengedhetetlen az embrió fejlődéséhez; Azonban továbbra sem ismert, hogy ez a komplex hogyan szabályozza a növekedés és az autofágia közötti egyensúlyt fiziológiás körülmények és környezeti stressz között [48]. Ezért az mTOR jelátvitel szerepet játszhat a sejtválaszokban olyan állatokban, amelyek a terhesség alatt LP-bevitelnek vannak kitéve; az autofágia észlelésében, indukciójában és befejezésében; és válaszul az intracelluláris tápanyag hozzáférhetőségére [46]. Hipotetikusan súlyos fehérjekorlátozás során a miR-144-3p csökkent expressziója összefüggésbe hozható a fokozott mTOR expresszióval, körülbelül 139%-kal, illetve 104%-kal a CM sejtekben és 104%-kal, hogy kompenzálja a nefronok elvesztését a {{ban. 11}}DG LP utód Chen et al. A miR-127 a sejt öregedésének új szabályozója a Bcl-6 révén [49]. Pan és mtsai. beszámolt arról, hogy a miR-127 alulexpressziója összefüggésben áll a májsejtek fokozott sejtproliferációjával [50]. Ez a vizsgálat a sejtproliferáció csökkenését és a Ki-67-ra pozitívan jelölt sejtek számának szignifikáns csökkenését mutatta ki fehérje-korlátozott állatok CM-jében. Ezenkívül az LP utódokban a nefrogén terület és a proliferáció csökkenését figyelték meg, ami összhangban volt Menendez-Castro és mtsai. 8,4 százalékban fehérje-korlátozott utódokban [51, 52]. Így a megnövekedett Ki-67 és Bcl-6 mRNS-expresszió, valamint a csökkent miR-127-3p-expresszió a 17-DG LP cap-ban, összefüggésbe hozható a fenntartó ellenszabályozási mechanizmusokkal. proliferáció.

Sun et al. kimutatták, hogy a miR-199a-5p túlzott expressziója csökkenti a cisztás sejtproliferációt és apoptózist indukál a sejtciklus szabályozása mellett [53]. Ebben a vizsgálatban a miR-199a-5p expressziója csökken a 17-DG LP-ben, amit a Ki-67, a sejtproliferációs marker és a Map2k2 fokozott transzkripciója kísér. az LP 17-DG metanephros csökkent Ki-67 reaktivitásával jár. Így a terhességi alultápláltság elősegíti a differenciálódást egy poszt-transzkripciós mechanizmuson keresztül. Eredményeink feltárják a cink-ujj E-dobozt kötő homeobox 1 (ZEB1), egy EMT-induktor elnyomó szerepét, amely fenntartja az őssejt-pluripotenciát az embrionális őssejtek differenciálódása során. A -cateninről ismert, hogy aktiválja a nukleáris ZEB1 transzkripciót, ami ZEB1 expressziót eredményez [34]. A TGF jelátviteli útvonal, az egyik legjobban tanulmányozott útvonal, képes EMT-t indukálni az embrionális fejlődés során. Számos TGF-szerű ligandumra van szükség az embrionális fejlődéshez. Azonban nem minden TGF-mediált EMT-hatás függ a ZEB1/2-től, a knockout sejtek indukálhatják a fibronektin és az N-cadherin mezenchimális gének expresszióját. Az E-cadherin azonban már nincs leszabályozva, és aktinrostok is képződnek [54]. Karner et al. közben arról számolt bevese-fejlesztés, a Wnt9b/ -catenin

Az UB-ban és a CM-ben egyaránt kifejezett jelátviteli út szükséges a nefron progenitorsejtek megújulásához és differenciálódásához, ami elengedhetetlen a nefronok kialakulásához az embriogenezis során [55]. Az evolúciósan konzervált Wnt9b/-catenin útvonal kritikus szerepet játszik a szervek, szövetek fejlesztésében és a sérülések helyreállításában többsejtű szervezetekben. Egy tanulmány kimutatta, hogy a c-Myc a -catenin transzkripciós célpontja, amely szabályozza a sejtek proliferációját és differenciálódását.vese-tubuláris epitélium [56]. A -catenin expressziója gén és fehérje szinten nőtt a vizsgált időszakokbanvese-fejlődés a 17-DG LP magzatban. Pan és mtsai. beszámolt arról, hogy a Myc együttműködik a -cateninnel, hogy elősegítse a nephron progenitor sejtek megújulását [10]. Itt az életkornak megfelelő NP utódokhoz képest az LP alacsonyabb c-Myc expressziót mutatott. Ezért ezekben az állatokban alacsonyabb a proliferációhoz és a túléléshez szükséges megújuló sejttartalék, és az LP-modellben a nefronok kisebb számát tükrözhetik. Ráadásul,

A Wnt/-catenin és a Notch jelutak koordinálhatják a Six-2 expresszió szabályozását, és részt vesznek a Six-2 expresszió leszabályozásában a nephron progenitor sejtekben. Tanulmányok kimutatták, hogy alacsony szintű -cateninre lehet szükség ahhoz, hogy a Six-2 expressziót és a CM progenitor sejteket differenciálatlan állapotban tartsák; továbbá a katenin megnövekedett szintje határozza meg a nephron progenitor sejtek sorsát [57, 58]. Így feltételezzük, hogy a csökkent cMyc és Notch jelátvitel, amelyet megnövekedett -catenin expresszió kísért, 28 százalékkal csökkentette a Six-2 expressziót a 17-DG LP utódokban, és korrelált a korai CM-sejtek differenciálódásával, valamint a csökkent őssejt- és nefronszám felnőttkorban. Ezen túlmenően adataink alátámaszthatják, hogy az LP-utód MM-sejtekben a megnövekedett Let-7a-5p és -catenin expresszió, valamint a csökkent Notch-jel modulálhatja a c-Myc, Six-2, és Ki-67 expressziója, ami a progenitor sejtek önmegújulásának csökkenéséhez vezet. A megmaradt CM progenitor sejtek kimerülése a nefronok számának csökkenéséhez és az artériás magas vérnyomás kialakulásához, ill.vese-felnőttkori rendellenességek (10. ábra). Boivin és munkatársaival összhangban eredményeink azt mutatják, hogy a megnövekedett CM-catenin megzavarja az UB növekedését és a nefrogenezist [59]. Tanulmányok kimutatták, hogy a növekedési faktor glia eredetű neurotróf faktor (GDNF), amely az UB növekedésének döntő szabályozója, a c-Ret tirozin kináz receptoron és a Gfra1 koreceptoron keresztül továbbít [60, 61]. A 17-DG LP utódokban jelentős

A c-Ret receptort kódoló mRNS növekedése elméletileg az UB növekedésének növekedéséhez vezet. Azonban ebben a vizsgálatban a GDNF expressziója változatlan volt, ami arra utal, hogy a cRet mRNS növekedése ellenére az UB elágazása csökkent. Korábban 28,3 százalékos csökkenést figyeltünk meg az uréterbimbó ágaiban 14,5 napos terhességi fehérje-korlátozás után [4], ami összefüggésbe hozható az MM-sejtek Six-2 jelölésének 28 százalékos csökkenésével, annak ellenére, hogy a GDNF-ben nem történt változás. átírás. A -catenin valószínűleg kölcsönhatásba lép a c-ret receptorral, és az UB sejt magjába kerül, elősegítve a TGF -1 expresszióját a hámsejtekben, gátolva az UB elágazást és a CM progenitor sejt korai differenciálódását okozza, amint az {{11} }DG LP utódok [62–64]. Ezért előfordulhat, hogy a GDNF nem nélkülözhetetlen a mezenchimális jelek közvetítésében az ureterbimbóhoz; a mechanizmust azonban még tisztázni kell. Valójában kimutattuk, hogy a 17-DG LP utódok MM-jei specifikus növekedést mutattak a Let-7 miRNS expressziójában, ami szignifikánsan károsodott.vesefejlődését, megerősítve ezzel e gének moduláló szerepét a nefrogenezis fejlődési időzítésében [65].

A kezdeti inzulinszerű növekedési faktor (IGF) vizsgálatok során az IGF-1 és -2 domináns szerepét a magzati növekedésben bőséges, de többnyire közvetett bizonyítékok világították meg. Azt találták, hogy az IGF-ek proliferációs és differenciációs faktorként működnek a tenyésztett magzati sejtekben és a beültetés előtti embriókban. Ezenkívül azt találták, hogy az IGF-eket in vitro tenyésztett magzati sejtek és explantátumok szekretálják [66]. A növekedési faktorok, beleértve az IGF-et is, részleges vagy teljes epiteliális-mezenchimális átmenetet okozhatnak. Az IGF-útvonalak aktiválása az EMT fokozódását eredményezi a ZEB1 expresszió indukálásával [67]. Bár több jelölt növekedési tényező is szerepet játszikvesenem ismert, hogy részt vesznek-e a nefrogenezisben. Különböző időpontokban különböző növekedési tényezőkre lehet szükség. Egyes növekedési tényezők ebben az összefüggésben feleslegesek lehetnek. Az embrionális fejlődés során szekvenciális EMT és MET körök szükségesek a speciális sejttípusok megkülönböztetéséhez és egy háromdimenziós struktúra létrehozásához. Ebben a tanulmányban a mesenchymalis-epiteliális interkonvertibilitásról azt találták, hogy fenntartja a sejt plaszticitását, ami arra utal, hogy az embrió LP körülményei között erősen indukálható rendszer van jelen. A Let-7 miRNS-család expresszióját alaposan tanulmányozták különböző magzati szövetekben. A Let-7 miRNS expressziójának növekedése a csökkent proliferációval és az MM-sejtek differenciálódásának korai növekedésével, következésképpen a csökkent nefronszámmal függ össze [27, 15, 68–71]. Magasabb Let-7 expressziót mutattak ki magasabb rendű szervezetekben az agyi embriogenezis utolsó fázisában rágcsálókban [72, 73]. Nagalakshmi et al. feltárta, hogy a Let-7 miRNS expressziója megváltoztatta az UB hámsejt sorsát prekurzorból differenciált állapotba [71]. Ezzel szemben Yermalovich et al. kimutatták, hogy a Lin28b, egy RNS-kötő fehérje túlzott expressziója a szuppresszív Let{15}} miRNS-ekhez kapcsolódik. Bár a lin28 és a Let-7 a gerinctelen állatok ontogén időzítésének ismert szabályozói, ezek szerepe az emlős szervek fejlődésében nem ismert [65]. Ebben a tanulmányban a Let-7a-5p miRNS-expresszió növekedése az LP-magzatban összefüggésbe hozható a csökkent CM-sejtek proliferációjával, ami veszélyezteti a nefrogenezist az NP-csoporthoz képest. Feltételezzük tehát, hogy a megnövekedett Let-7 miRNS által okozott CM-sejtek proliferációjának elnyomása és a nefrogenezis korai leállása közvetlenül vagy közvetve a Lin28b 17-DG LP-ben bekövetkező átmenetileg csökkent expresszióján keresztül következhet be. Ez a hatás jelentősen ronthatjavesefejlődés a 17-DG LP-ben, ami megerősíti, hogy ez a gén szabályozza a fejlődési időzítést a nefrogenezis során. Ebben a vizsgálatban a megnövekedett Let-7a-5p miRNS expresszió egybeesik a c-Myc expresszió csökkenésével. A Myc részt vesz a proliferációban, a növekedésben, az apoptózisban és a sejtdifferenciálódásbanvese-organogenezis [74–76]. Az LP 17-DG utódokban az MM c-Myc gén expressziója csökkent, és a CM c-Myc immunreaktivitás területe 14 százalékkal kisebb volt, mint az NP utódokban. Ezzel egyidejűleg a CM-sejtek számának 14%-os csökkenése 48%-kal csökkenti a Ki-67 immunreaktivitást LP-ben az NP-utódokhoz képest. A vizsgálatok következetesen kimutatták, hogy a c-Myc fontos szerepet játszik az UB elágazás végső fázisában és a CM progenitor sejtproliferáció stimulálásában [74].

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESE FERTŐZÉSÉT

csökkenti az őssejtek szintjét, differenciálatlan állapotban tartja azokat. Ebben a tanulmányban azonban a Let-7a-5p miRNS erős expressziója a CM-ben csökkentette a c-Myc expresszióját, ezáltal csökkentve a progenitorsejtek proliferációját és a korai sejtdifferenciációt az LP 17-DG-ben. utódok (10. ábra). Tanulmányok avesec-Myc transzgenikus egerek egyidejű csökkenését mutatták ki a c-Myc és az S-ix-2 immunpozitív CM-sejtek számában, ami az őssejt-proliferáció csökkenésével jár együtt [74]. Ez a tanulmány jelentős (28 százalékos) csökkenést mutat a Hat-2 pozitív sejt számában, egy specifikusvese-őssejt marker, mint a nefronszámban megfigyelt csökkenés, a 17-DG LP utódok CM-jében az NP utódokhoz képest. 2009-ben Fogelgren et al. kimutatta, hogy a hat-2 gén expressziója csökken a magzati ontogenezis során, ha csökkent nefronszámmal, magas vérnyomással és krónikusveseelégtelenség[77]. Így a Six-2 gén csökkent expressziója a CM progenitor sejtekben a jel által kiváltott differenciálódás elnyomását jelzivese-fejlődés a 17-DG LP utódokban. Mindazonáltal a redundanciát óvatosan kell alkalmazni – a nefrogenezis finom hibái részletesebb elemzéssel vagy eltérő körülmények között nyilvánvalóvá válhatnak. Az IGF1 mRNS szintje a metanefris fejlődés kezdeti szakaszában volt a legmagasabb, a transzkriptumok az egész MM-ben kimutathatók voltak, míg szintjük a további fejlődés során csökkent. Azonban közbenveseembriogenezis, a nephront elősegítő növekedési faktorok (IGF1) és a gátló növekedési faktorok (TGF -1) közötti finom egyensúly szabályozza az UB elágazását.

Következtetés

Bár több szerző tanulmányozta a nefronózist [34, 37, 78], keveset tudunk a nefronszámot meghatározó mechanizmusokról. Ez a tanulmány azt mutatja, hogy sok MM progenitor sejt miRNS, mRNS és fehérje megváltozott a 17-DG LP utódokban, ami csökkent proliferációhoz és korai sejtdifferenciálódáshoz vezet (11. ábra). Ez a finom egyensúly a nephron progenitorok megújulása és a differenciálódás között elengedhetetlenvesefejlődés, mert a megfelelő számú nefron elérésének elmulasztása a krónikus kockázati tényezővese-rendellenesség.