A Drosophila parazitoid méreg peptidjének in Silico elemzése feltárja a kation–poláris–kation klip motívum előfordulását a csomós fehérjékben 1. rész

Absztrakt:

Általános parazitoid darazsakként a Leptopilina heteroatom nagyon sikeres a Drosophila nemzetségbe tartozó gyümölcslegyek számos faján. A parazitoidok speciális multi-stratégiás extracelluláris vezikula (EV)-szerű struktúrákat termelnek méregükben. A proteomikai elemzés számos immunitással összefüggő fehérjét azonosított, köztük a csomós peptidet, az LhKNOT-t, amely tartalmazza a szerkezetileg konzervált cisztein csomó (ICK) gátlószert, amely különböző taxonokból származó fehérjékben van jelen. Az LhKNOT 36-maradványmag csomós redőjének szerkezeti és dokkoló elemzése feltárta, hogy magán a csomós motívum mellett egy kation–poláris–kation (CPC) klip is van.

Az inhibitor cisztein egy természetes anyag, amelyet az oxidatív károsodás megelőzésére és a sejtnövekedés elősegítésére használnak. Az immunitás szempontjából a cisztein szerepe elsősorban a szervezet immunitásának javításában, valamint a gyulladások és fertőzések megelőzésében nyilvánul meg.

Az utóbbi években egyre több tanulmány bizonyítja, hogy a cisztein fontos szerepet játszhat az immunrendszerben. Elősegítheti az immunsejtek szaporodását, fokozhatja a szervezet kórokozókkal szembeni ellenálló képességét, csökkentheti a fertőzésveszélyt. Ezenkívül a cisztein csökkentheti a szabad gyökök termelését és javíthatja az immunrendszer általános egészségi állapotát, ezáltal erősítve a szervezet immunitását.

Bár a cisztein immunitásra gyakorolt ​​hatása nagyon jelentős, cisztein inhibitor alkalmazása esetén óvatosan kell alkalmazni. Mivel a cisztein inhibitort általában bizonyos betegségek, például szív- és érrendszeri betegségek, ízületi gyulladás stb. kezelésére használják, visszaélés esetén az immunitást befolyásolja, és a szervezet immunrendszerének gyengülését okozza, ami növeli a fertőzés kockázatát.

Összefoglalva, elválaszthatatlan kapcsolat van a cisztein inhibitor és az immunitás között. Bár a cisztein inhibitorai elősegíthetik a szervezet egészségét, ezeket is orvosi irányítás mellett kell alkalmazni, és oda kell figyelni az ésszerű dózis fenntartására a szervezet egészségének megőrzése érdekében. Látható, hogy javítanunk kell az immunitást. A Cistanche jelentősen javíthatja az immunitást, mivel a húshamu különféle biológiailag aktív összetevőket tartalmaz, mint például poliszacharidok, két gomba, Huang Li stb. Ezek az összetevők különböző immunrendszereket serkenthetnek. sejtszerű sejtek, növelve immunaktivitásukat.

Kattintson a Cistanche egészségügyi előnyei

A CPC klip motívumról úgy gondolják, hogy elősegíti az antimikrobiális aktivitást a heparinkötő fehérjékben. Meglepő módon a tesztelt ICK-k többsége a CPC klip motívumával is rendelkezik, beleértve a 75 jóhiszemű növényi és ízeltlábú csomós fehérjét, amelyek nagy szekvenciát és/vagy szerkezeti hasonlóságot mutatnak az LhKNOT-tal. Az LhKNOT-hoz és a többi 75 csomós fehérjéhez hasonlóan még a Drosophila Drosomycin gombaellenes peptid is, amely a légy TollNF-kappa B immunrendszerének kanonikus célgénje, tartalmazza ezt a CPC klip motívumot. Eredményeink együttesen az LhKNOT parazitoid lehetséges védekező funkciójára utalnak.

A CPC klip motívum elterjedtsége, amely a cisztein csomóban rejlik az itt vizsgált csomós fehérjékben, azt sugallja, hogy a kapott 3D topológia fontos biokémiai funkcióik szempontjából. A CPC klip valószínűleg egy erősen konzervált szerkezeti motívum, amely számos különböző fehérjében található, amelyek heparinkötő képességgel rendelkeznek, beleértve az amiloid fehérjéket is. A csomók a terápiás gyógyszerfejlesztés célpontjai, és szerkezet-funkció kapcsolataikba való betekintés előremozdítja az új gyógyszertervezést.

Kulcsszavak:

Gazda–parazita; Drosophila; Leptopilina; cisztein csomó; csomós hajtás; Kation–Polar–Cation klip; antimikrobiális peptid; heparin-kötő motívum; mini fehérjék.

1. Bemutatkozás

A gazda-parazita kölcsönhatások során a parazitának támadó nyomást kell gyakorolnia, miközben életben kell tartania a gazdaszervezetet, hogy életképes utódokat tartson fenn [1,2]. Az ilyen ellentmondó célok különböző molekuláris stratégiákkal rendelkező virulencia faktorok kialakulásához vezettek, miközben megőrizték a magas gazdaspecifitást. A parazita Hymenoptera több mint egymillió fajt alkot, mindenütt jelen van a bolygón, és különféle ízeltlábúakon, főleg rovarokon parazitál [3].

A rovarok gazdáit megtámadó darazsak különféle viselkedési és biokémiai stratégiákat dolgoztak ki a siker érdekében, és állandó együtt-evolúciós nyomás alatt maradnak gazdáikkal [4–7].

A Leptopilina/Drosophila rendszer egy feltörekvő modell a darázsellenes válaszok és a darázsvirulencia stratégiák molekuláris alapjainak megértéséhez [8]. A gazdaszervezet immunitásának elnyomására a Leptopilina nőstények a peterakás során mérgező faktorokat juttatnak be lárvagazdáikba [4,9,10]. A Drosophila jól meghatározott veleszületett immunmechanizmusai [11–13] értékes kontextust biztosítanak ezen darázsméreg-tényezők hatásainak tanulmányozásához.

A L. boulardi specialista által okozott fertőzés aktiválja a humorális és celluláris immunkarokat, amelyeket a légy konzervált Toll-NF-κB jelátviteli útvonala vezérel. Az antimikrobiális peptid (AMP) gének, például a drosomicin expressziója L. boulardi fertőzés után aktiválódik [14]. A Toll-NF-κB jelátvitel a vérsejtek osztódását és fejlődését is szabályozza [15,16], amely lépések szabályozzák a darázstojások kapszulázását és elpusztulását [17,18].

Ezzel szemben a generalista L. heteroatom általi fertőzés elnyomja mindkét immunpályát [9,14], és szinte az összes lárva vérsejtje elpusztul a darázsméreg faktorai miatt [19,20].

Ebben a tanulmányban egy L. heteroatomos peptid, az LhKNOT elméleti szerkezetét elemezzük, amelyet az L. heteroatom mérgében az organellumszerű váladékokban azonosítottak, de nem az L. boulardi méregben [21]. Ezek az immunszuppresszív organellumok több mint 350 fehérjét tartalmaznak, és eukarióta mikrovezikulák proteomikus profiljával és rengeteg immunitással kapcsolatos fehérjével rendelkeznek [21–23].

Az LhKNOT átveszi az "inhibitor cisztein csomó" (csomó) motívumot [24]. A csomós motívum széles körben megőrződött számos taxonban, a növényektől [25, 26] a csigákig [27]. Ezek a kis peptidek (<60 residues) are functionally diverse. Knottins are used offensively, in spider toxins [28] and cone snail venom [27], as well as defensively, e.g., in wound healing activities of cacti [26], and antimicrobial host defense in plants [25,26,29] and invertebrates [30].

A csomós aktivitás széles skálája a redő általános szerkezetének tulajdonítható, amely kizárólag hat cisztein maradékból álló konzervált motívumra támaszkodik, amely kihasználja e ciszteinek egyedülálló diszulfidhidakat képező képességét. A csomós motívum akkor fordul elő, ha ciszteinmaradékokat figyelünk meg egy C1-C2-C3-C4-C5-C6 mintában (ahol a „-” több erősen változó szermaradványok).

Ezután hasonlóan konzervált módon diszulfid hidak jönnek létre (C1-C4, C2-C5 és C3-C6), ami C1-C4 és C{{ 8}}C5 makrociklust alkot, míg C3-C6 ebben a makrociklusban fordul elő, ami "csomós" topológiát eredményez. Mivel ez a csomós topológia nagyrészt a hat cisztein maradék megőrzésétől függ, a csomós motívum jelentős eltéréseket tesz lehetővé a teljes szekvenciában [30]. Kis méretük, a szekvencia-varianciák nagy toleranciája és a megfigyelt szerkezeti stabilitás kombinációja a csomókat a gyógyszertervezés népszerű támasztékává tette [30], potenciálisan még a rákkezelésben is [31].

Különféle kísérleti bizonyítékok mutatják vagy sugallják a különböző csomópontok [25, 26, 29, 30, 32, 33] vagy kapuzott ioncsatorna kölcsönhatások [28, 34] antimikrobiális képességeit, bár a molekuláris mechanizmusok, amelyekkel ezeket a funkciókat végrehajtják, nem jól érthető. Továbbá nem ismert, hogy ezeknek az antimikrobiális funkcióknak közös a hatásmechanizmusa.

Tekintettel a légyparaziták immunszuppresszív részecskéiből való felfedezésére, a célunk az volt, hogy (a) azonosítsuk az LhKNOT-hoz kapcsolódó szekvenciákat különböző organizmusokból, beleértve a L. heteroatomot, L. boulardit és Ganaspis parazitoidokat, amelyek megtámadják a Drosophilát, és (b) új szerkezeti motívum(ok), amelyek az ismert vagy új LhKNOT homológokban jelen vannak, abban a reményben, hogy egy ilyen konzervált motívum előrejelzése az LhKNOT lehetséges funkcióira utalhat, és iránymutatást adhat a jövőbeni kísérleti kutatásokhoz.

Megmutatjuk, hogy az LhKNOT elméleti modellje három antiparallel béta lappal rendelkezik a csomós redő jellemzőivel, amelyeket diszulfid hidak korlátoznak. Az LhKNOT modell CPC klipet tartalmaz, amely képes kölcsönhatásba lépni a heparinnal, egy negatív töltésű glikozaminoglikánnal (GAG), amely jelentős orvosi értékű. Az LhKNOT emellett képes kölcsönhatásba lépni más GAG-okkal, mint például a keratán-szulfáttal (a heparinhoz hasonló erősen szulfatált GAG) és a hialuronsavval (az egyetlen GAG képviselő, amely nem igényel szulfatálást) [35].

Ezenkívül az LhKNOT szerkezeti homológjai (azaz a bona fide csomós motívum fehérjék) is rendelkeznek a heparinnal dokkolható CPC klip motívummal. Meglepő módon az LhKNOT-hoz és ezekhez a jóhiszemű csomós fehérjékhez hasonlóan még a Drosophila Drosomycin gombaellenes peptid is megosztja ezt a CPC klip motívumot szerkezetében. Ezt a motívumot az L. heteroatom, L. boulardi és Ganaspis spp. 46 további LhKNOT homológja közül 41-ben azonosították. darazsak sikeresen D. melanogasteren.

Ezek az in silico alapú megfigyelések arra utalnak, hogy a sok csomóban rejlő CPC klip motívum szerkezeti alapot adhat az immun- vagy virulenciafunkciók módosításához. A darázs LhKNOT lehetséges antimikrobiális vagy virulenciával kapcsolatos funkciójára gondolunk. A három Drosophila parazitoidból származó újonnan azonosított csomó peptidek többségében a csomóredő bősége és a CPC klip motívummal való egyezése azt sugallja, hogy ezek fontos, még meghatározandó szerepük van a parazitoid fiziológiában és/vagy a gazda-parazitában. interakciók.

2. Eredmények
2.1. Az LhKNOT szekvencia hasonlóságot mutat a rovarok és növények antimikrobiális peptidjeivel

Az nr és a TSA adatbázisokban végzett BLASTp keresés a teljes hosszúságú LhKNOT szekvencia (60 aminosav) felhasználásával korlátozott számú jelentős találatot mutatott ki, elsősorban "antimikrobiális peptidekként" jelölve, növényekből és rovarokból. Néhány gombaszekvenciát is azonosítottak. Minden eredmény kevesebb, mint 60 százalékos aminosav-azonosságot mutatott az LhKNOT-val. Az LhKNOT-ra az nr adatbázisban a legjobb egyezés a közönséges bogárból, a Callosobruchus maculatesből származó antimikrobiális peptid volt, míg a TSA adatbázisban a legjobb találatot az Aceria Coachella búzagombóc atkából származó antimikrobiális peptid jelentette.

A konzerváció az LhKNOT-hoz kapcsolódó egyetlen szekvenciamotívum, a cisztein csomós „gombaellenes peptid” aláírás (pfam11410 domén, E=2.8 × 10-3) régiójában volt a legszembetűnőbb. A távoli homológok kimutatására szolgáló PSI-BLAST futtatása után további szekvenciákat fedeztünk fel. A PSI-BLAST hasonló eredményeket mutatott a közönséges jégnövény, a Mesembryanthemum crystallinum esetében; vörös atkák, Dinothrombium tinctorium; parazitoid darázs, Trichogramma pretiosum; csattanó bogár, Ignelater világító; parazitoid darázs, Trichogramma brassicae; közönséges pollenbogár, Brassicogethes aeneus; kőrisfúró, Agrilus planipennis; és fűrészlegy, Neodiprion lecontei.

A Rejtett Markov-modellek által vezérelt HMMER webszervert a távoli homológok kimutatásának alternatív módszereként használva öt gombás találatot azonosítottunk az Akanthomyces lecanii, a Cordyceps javanica, a Cordyceps confragosa, a Rosellinia necatrix és a Beauveria bassiana fajokból.

A PDB hasonló szekvenciák utáni keresése csak két szignifikáns eredményt hozott, az egyiket az Acrocinus longimanus rovarból származó knottin típusú gombaellenes Alo-3 peptidre, a másikat pedig a Pereskia bleo-ból származó diszulfid-korlátozott sebgyógyító peptidre, a pB1-re. A különböző szekvencia-hasonlósági megközelítésekkel azonosított összes közeli és távoli homológ részleteit az S1 kiegészítő táblázat foglalja össze.

Az LhKNOT-nak a tipikus csomók ismert szerkezetéhez, valamint az azonosított homológokhoz való igazítása azt mutatta, hogy az LhKNOT-ban a három diszulfidhidat alkotó hat cisztein megmarad (1A. ábra). Az N-terminálisán az LhKNOT egy hosszú, spirális szegmenst tartalmaz, amely az előrejelzések szerint jelszekvenciaként fog működni; belsőleg három béta-lapot tartalmaz, amint az a knottin peptidek másodlagos szerkezetétől várható (1B. ábra).

Ezenkívül a rendelkezésre álló L. heteroatom és L. boulardi transzkriptum, valamint egy másik Drosophila parazitoid, a Ganaspis spp. (lásd Módszerek), rengeteg kapcsolódó szekvenciát tárt fel. Az L. heterotoma (Lh14) esetében 16 további Lh14 csomós fehérjét azonosítottunk (S2 kiegészítő táblázat).
Az L. boulardi esetében 22 csomós fehérjét azonosítottunk (S3 kiegészítő táblázat). Hat LhKNOT homológot hasonló módon azonosítottak a Ganaspis hookeri-ből (G1), és két LhKNOT homológot találtak a G. brasiliensis (VA) genomból készített fehérje előrejelzésekben (S4 kiegészítő táblázat). A 2. ábra ezen parazitoid csomós szekvenciák konzerválását mutatja LhKNOT segítségével. Így legalább az a néhány Drosophila parazitoid, amelyről ebben a vizsgálatban mintát vettek, több csomó fehérjét kódolnak. További ilyen csomós peptideket kódolhatnak ezek a darazsak, és szisztematikus proteomikai/bioinformatikai megközelítésekre van szükség egy átfogó lista elkészítéséhez. Ezeknek a feltételezett csomóknak a parazita fiziológiájában betöltött funkciói ismeretlenek.

1. ábra (A) Az LhKNOT (felül) és homológjainak többszörös szekvencia-illesztése a csomós családban (fentről lefelé): Mesembryanthemum crystallinum (növény; antimikrobiális; NCBI ID: AAC19399), Aceria tosichella (atka; antimikrobiális; NCBI ID :MDE48292.1), Callosobruchus maculatus (bogár; ismeretlen; NCBI ID: VEN35376.1), Dinothrombium tinctorium (atka; ismeretlen; NCBI ID:RWS16713.1), Trichogramma pretiosum (Alo{{10}} hasonló; parazitoid darázs; antimikrobiális; NCBI azonosító: XP_014233229.1), Ignelater luminosus (bogár; ismeretlen; NCBI azonosító: KAF2884324.1), Trichogramma brassicae (parazitoid darázs; ismeretlen; NCBI azonosító: CAB{{27) }}{{30}}31014.1), Brassicogethes aeneus (bogár; ismeretlen; NCBI-azonosító: CAH0563829.1), Agrilus planipennis (hamufúró; antimikrobiális; NCBI-azonosító : XP_018321119.1), Neodiprion lecontei (fűrészlegy; ismeretlen; NCBI azonosító: XP_015517007.2), Akanthomyces lecanii (gomba; gombaellenes; Uniprot azonosító: A0A168C5L6), Cordyceps javanica (gomba; gombaellenes ; Uniprot azonosító: A0A545VVU1), Cordyceps confragosa (gomba; ismeretlen; Uniprot azonosító: A0A179IJT7), Rosellinia necatrix (gomba; ismeretlen; Uniprot azonosító: A0A1S8A723), Beauveria bassiana (gomba; ismeretlen; Uniprot azonosító: A0A0A2VUF6), Acrocinus longimanus (Alo-3; bogár; gombaellenes; PDB ID: 1Q3J) és Pereskia bleo (pB1; ID: cactus 5XBD). Az azonos szermaradékok pirossal, míg a kémiailag hasonló maradványok sárgával vannak kiemelve. Fekete nyilak jelölik a konzervált cisztein maradékokat, amelyek felelősek a csomós szerkezeti redőért, a három diszulfid híd diszulfidhíd-kapcsolatát pedig neonzöld számok jelölik.

X és XX jelöli az N-, ​​illetve C-terminális aminosavak változó számát. A modellezett LhKNOT másodlagos szerkezeti elemei felül láthatók. és T jelentése -szál, illetve -turn. (B) Az LhKNOT másodlagos szerkezetének előrejelzése, amely egy hosszú spirális szegmenst (rózsaszín henger; jelpeptid), amelyet három béta szál követ (sárga nyilak). Ez a másodlagos szerkezet a kanonikus Knottin aláírást követi [36]. (C) A csomós szerkezeti redő prototípusa a KNOTTIN adatbázisból [36] (a kép reprodukálására adott engedélyt Dr. Jean-Christophe Gelly, INSERM, 2019. október). A két diszulfid híd (zöld) egy makrociklust alkot, míg a harmadik (kék) áthúzódik a központon, így a fehérje a névadó csomós topológiáját adja. (D) Az LhKNOT előrejelzett harmadlagos szerkezete, amely a csomós topológiát és a konzervált cisztein motívumot mutatja, a ciszteinmaradékok diszulfidhidakat képeznek a csomós családban látható konzervált mintázatban (C1 -C4 és C2 -C5 forma). a makrociklus, a C3 -C6 áthúzza a közepét).

2. ábra (A) Az LhKNOT (fent) és homológjainak többszörös szekvencia-illesztése az Lh14-ben. (B) Az LhKNOT (felül) és homológjainak többszörös szekvencia-illesztése L. boulardiban. A zöld mezőben jelölt X a következő beszúrásoknak felel meg két Lb17 szekvenciában: Lb: GISX01151661.1 X=SQAPPPTPEPFHPPGTPP; Lb: GISX01151653.1 X=SQLTSPRSTFPPTGSTIPSIITT. (C) Az LhKNOT (fent) és homológjainak többszörös szekvencia-illesztése Ganaspis spp. Az azonos szermaradékok pirossal, míg a kémiailag hasonló maradványok sárgával vannak kiemelve.

Fekete nyilak jelölik a konzervált cisztein maradékokat, amelyek felelősek a csomós szerkezeti redőért, a három diszulfid híd diszulfidhíd-kapcsolatát pedig neonzöld számok jelölik. A modellezett LhKNOT másodlagos szerkezeti elemei felül láthatók. és T jelentése -szál, illetve -turn. Szürke csillagokat adunk a szekvenciablokkok tetejére, a fenti aminosavak alternatív konformációkkal modellezett aminosavakat képviselnek.

2.2. Az LhKNOT háromdimenziós szerkezete

A csomós peptid tipikus szerkezeti redőzését hat cisztein határozza meg, amelyek három diszulfidkötésben vesznek részt, és egy ciszteincsomós háromszálú, antiparallel béta-lapot képeznek [25]. Ennek a redőnek egy fontos jellemzője a cisztein-maradékok összekapcsolhatósága a diszulfidhidak kialakítására, valamint a 3-as és 6-os cisztein diszulfidhidai, amelyek az 1-4-es és 2-5-ös diszulfidokon keresztül speciális diszulfidot képeznek (1A, C ábra). ).

Ez a diszulfid a diszulfidcsomó tulajdonsága révén megkülönbözteti a csomóredőt más ciszteincsomófehérjéktől. A konzervált ciszteineken kívül az aminosavszekvencia többi része meglehetősen változó lehet, ezért csak korlátozott számú csomót azonosítanak az LhKNOT szekvenciahasonlósági megközelítései (lásd az előző szakaszt és az S1 kiegészítő táblázatot).

A hajtásfelismerő algoritmusok és a sablon alapú modellezési megközelítések viszont számos különböző csomót találtak ki, amelyek alkalmas jelöltek az LhKNOT modellezésére. A különféle generált LhKNOT-modellek közül a legjobb modell az LhKNOT többsablon-alapú modellje volt, amelyet a HHpred [37] programmal hoztak létre, a három legnépszerűbb Alo-3 (PDB: 1Q3J) sablonból származtatott szerkezeti korlátokkal [ 30], omega-agatoxin-IVA (PDB: 1IVA) [28] és PAFP-S (PDB: 1DKC) [25]. A kiválasztott modellhez a ProSA-web [38] segítségével számított tudásalapú energiaprofilok alacsony energiákat és -4,53-as z-pontszámot mutattak, ami a megoldott struktúrákhoz hasonlítható.

A Verify3D [39] megfelelő pontszámmal értékelte ezt a többsablon-alapú modellt (100.00 százaléka a modellben található maradékok átlagos 3D-s-1 D pontszám nagyobb vagy egyenlő, mint 0,2). A VoroMQA [40] 0,325-ös pontszáma valószínűleg a peptid kis méretét tükrözi, és a templátok pontszámai ugyanabban a tartományban voltak (S1 kiegészítő ábra).

Ez a többsablon-alapú modell a csomós redőt három antiparallel béta-szálral jellemzi, amelyeket diszulfidhidak és a diszulfidhidak várható összekapcsolhatósága korlátoz (1D ábra). A KNOTER3D, a KNOTTIN adatbázisban [36] található eszköz megerősítette, hogy ez a modell jóhiszemű csomós redővel rendelkezik, és megerősítette az 1D. ábrán korábban azonosított diszulfidkötési mintát.

2.3. Az LhKNOT egy CPC-klip jelenlétét mutatja, amely képes kölcsönhatásba lépni a heparinnal és más GAG-okkal

A lehetséges LhKNOT-függvények kereséséhez az LhKNOT közeli szerkezeti homológjainak szerkezet-függvény összefüggéseit vizsgáltuk. A Pereskia bleo kaktuszból (PDB: 5XBD) [26] származó csomós fehérje rendelkezik egy heparinkötő motívummal, amely CPC klip néven ismert. Ez a szerkezeti motívum geometriailag korlátozott klipet alkot két kationos és egy poláris maradékból, amelyek kölcsönhatásba lépnek a heparinnal sóhidak és hidrogénkötések révén, amelyek a klip pozitív töltésű felületén belül rögzítik [41].

A kaktuszcsomó és az LhKNOT szerkezeti szuperpozíciója azt mutatta, hogy a két szerkezet nagyon hasonló, és az összesített különbség kevesebb, mint 2Å. Az LhKNOT heparinnal való dokkolási elemzése, a ClusPro specifikus paramétereit használva a heparinra mint ligandumra, azt mutatta, hogy az LhKNOT esetében a CPC klip motívumához illeszkedő poláris kölcsönhatások az R1-S3-R14 aminosavban fordulnak elő (3A. ábra). .

A mért távolságok (mind az alfa-szének, mind a részt vevő maradék oldalláncok tömegközéppontjai között) kevesebb, mint 1Å-rel tértek el a CPC klip távolságaitól, ami egy feltételezett CPC klip jelenlétére utal az LhKNOT-ban (3B. ábra). A modellezett LhKNOT felületi elektrosztatikája a CPC klip által alkotott várható kationos kötőzseb jelenlétét is kimutatta [41,42] (3C. ábra).

A CPC klip más GAG-okkal való kölcsönhatási képességének felmérésére további dokkolóelemzést végeztünk LhKNOT-tal és keratán-szulfáttal (PDB ID: 1KES), valamint LhKNOT-tal és hialuronsavval (PDB ID: 1HYA). Mindkét esetben a CPC klip által létrehozott pozitív töltésű kötőfelület a negatív töltésű molekulákhoz kötődik. A PDBSum által generált Ligplotok megerősítették a GAG-ok kapcsolatát a CPC-képző maradékokkal (S2 és S3 kiegészítő ábra).

2.4. Az LhKNOT egyéb szerkezeti homológjai is tartalmazzák a CPC klip motívumot

A CPC klip jelenléte mind az LhKNOT-ban, mind a Pereskia bleo-ból (pB1) származó szerkezeti homológja a CPC klip szélesebb körű megőrzésének lehetőségét sugallta a csomós családon belül. Az LhKNOT 21 közeli szerkezeti homológjának elemzése kísérletileg megoldott PDB-kkel a KNOTTIN adatbázisban feltárta, hogy a peptidek minden esetben CPC klip motívummal rendelkeznek. A legtöbb peptid (pl. T. tridentatus) esetében a motívumparaméterek kevesebb, mint 1Å-rel tértek el a magcsomó-redőtől, míg másoknál (pl. az offenzív csomóknál) az eltérés 3Å-ig terjedt (S5 kiegészítő táblázat). Hasonlóképpen, az azonosított homológok modellezett csomós fehérjéi azt mutatták, hogy szinte mindegyik rendelkezik a CPC klipszel.

Tizenhat további szekvenciát L. heteroatomból, 22 szekvenciát L. boulardiból és 8 szekvenciát a Ganaspis spp.-ből modelleztek, és elemezték a CPC klip motívum jelenlétét, amelyeknek nincs ismert 3D szerkezete. Míg a 16 feltételezett L. heteroatom csomóból 13 és a 22 feltételezett L. boulardi csomóból 20 CPC klip motívumot mutatott, az összes Ganaspis szekvencia tartalmazta a CPC klipet (S5 kiegészítő táblázat). Érdekes módon az a hét homológ, amelyek nem mutattak CPC klip motívumot (a) a közönséges pollenbogár-szekvenciához (B. aeneus (CAH0563829.1), (b) az R. necatrix gombaszekvenciához (A0A1S8A723) és (c) háromhoz tartoznak. L. heterotoma csomók 4, 5, 6 és L. boulardi csomók 3 és 20 (S5 kiegészítő táblázat).

A KNOTTIN adatbázisban található csomókról készült felmérés, amelyek nem kapcsolódnak az LhKNOT-hoz, de különböző taxonokat (kúpcsiga, patkórák, rovar, növény, skorpió és pók) reprezentálnak, megmutatta a CPC klip motívumát. A CPC klip motívum felületi elektrosztatikus profilja minden esetben pozitív töltésű, valószínűleg elősegíti a negatív töltésű heparinnal való kölcsönhatást (4. ábra). A fent leírt bogár-, gomba- és darázscsomókhoz hasonlóan azonban a CPC-klipet nem azonosították a növényi ciklotidból és a szivacsokból származó csomókban (S5 kiegészítő táblázat).

4. ábra: A Phytolacca americana (PFAP-s; növény; PDB: 1DKC), (B) Agelenopsis aperta kalciumcsatorna szelektív omega-agatoxin (Omega-agatoxin IV-A) heparin-dokkolási eredményei és felületi elektrosztatika ; pók; PDB: 1IVA), (C) az Acrocinus longimanus gombaellenes peptidje (Alo-3; bogár; PDB: 1Q3J), (D) a Pereskia bleo sebgyógyító peptidje (pB1; kaktusz; PDB: 5XBD) , (E) LhKNOT, (F) a Drosophila spp. "Drosomycin" gombaellenes peptidje. (Drosomycin; légy; PDB: 1MYN), (G) Conotoxin GS (Conotoxin GS; kúpos csigák; PDB:1AG7), (H) patkórákból izolált tachystatin A antimikrobiális peptid (Tachystatin A; patkórák; PDB: 1CIX) és (I) Klorotoxin, a Leiurus quinquestriatus kisméretű skorpiótoxinja (klorotoxin; skorpió; PDB:1CHL), amely a kationos CPC klip motívumát mutatja. Az ábrák a CPC klipszerkezet legjobb megjelenítéséhez igazodnak. A felületi elektrosztatikus potenciálok szín szerinti besorolása –4 kT/e (piros) és plusz 4 kT/e (kék) között van.

2.5. Az LhKNOT CPC-klip in Silico mutációs elemzése egy másodlagos CPC-klipet tár fel

Három in silico LhKNOT mutáns (R1A, S3A, R14A) modelljét vizsgáltuk a vad típusú és mutáns fehérjék kötődési kölcsönhatásainak összehasonlítására. Az R14A mutáns esetében a heparin meglepő módon egy másodlagos CPC kliphez kapcsolódik, amely az R1, S3 és R30 aminosavakat tartalmazza az R1, S3 és R14 motívum helyett a vad típusban (S4 kiegészítő ábra). A kettős vagy hármas mutánsok (R14A-R1A; R14A-S3A-R1A) azonban nem mutattak kölcsönhatást az elsődleges vagy másodlagos CPC klip motívum maradékaival (S4C, D kiegészítő ábra).

Az R1A mutációval rendelkező in silico mutánsok (mind az elsődleges, mind a másodlagos CPC klip motívumot megszakítva) azonban azt mutatták, hogy a heparin kapcsolódik az R29-hez és az R30-hoz, mivel ezek adják az egyetlen megmaradt kationos felületet (S4C, D kiegészítő ábra). Érdekes módon a ligandum inkább a CPC klip motívumához kötődik, mind az elsődleges, mind a másodlagos klipek esetében a további kationos felület helyett, amikor a motívum elérhető, ami arra utal, hogy a CPC klip specifikus kölcsönhatása stabilabb asszociációt tesz lehetővé. nem specifikus elektrosztatikus kölcsönhatás.

For more information:1950477648nn@gmail.com