A bélbaktérium-konzorciumok in vivo beadása replikálja az urolitin A és B metabotípusait egy nem urolitint termelő patkánymodellbenⅠ

Évtizedek óta az ellagitanninok (ET) andellaginsav (EA) fogyasztását számos biológiai hatással összefüggésbe hozták, beleértve az antioxidáns, rákellenes, gyulladásgátló, antibakteriális és HIV-replikáció elleni aktivitást.1 Az ET-ek és az EA-k felszívódása és biológiai hozzáférhetősége azonban Korábbi humán vizsgálatok azt találták, hogy az EA és az EA-O-glükuronid vizelettel történő kiválasztása a bevitt mennyiség kevesebb, mint 1%-a.2,3 Mindazonáltal, bár az ET és az EA felszívódása alacsony, a vastagbél mikrobiota tovább metabolizálja őket urolitinné (Uros), amelyek legalább részben felelősek az ET-ben és (vagy) EA-ban gazdag élelmiszerek jótékony hatásaiért.1,4

Kattintson a hashajtóhoz

Először is, az EA az ET észterkötéseinek hidrolízisén keresztül szabadul fel az ellagitannáz néven ismert enzim által.5 Az EA további lebomláson megy keresztül, és 6H-dibenzo[b,d]pirán-6-egy származékot termel, amelyet Urosnak neveznek. Ez a reakciókaszkád a laktongyűrű laktonáz enzim általi hasításával kezdődik, ami luteinsavat eredményez, amely azután pentahidroxi-Uro-vá (Uro-M5) dekarboxileződik. Az egymást követő dehidroxiláció tetrahidroxi-Uros (Uro-D, Uro-E, és Uro-M6) és trihidroxi-Uros (Uro-C, UroM7 és Uro-G), hogy végül dihidroxi-Urost (Uro-A és isoUro-A) és monohidroxi-Uro-t (Uro-B) kapjanak, az utóbbit általában kimutatják. amikor isoUro-A is termelődik.1

Az emberekben ET-dús élelmiszerek elfogyasztása után kimutatott Uro metabolikus profilok nagy változatossága az ET lebontásáért felelős vastagbél mikrobióta egyedek közötti különbségeire utal.6–8 A vastagbélbaktériumok és a gazdaszervezet közötti számos lehetséges kölcsönhatás magyarázatot adhat a táplálék (poli) metabolikus sorsára. )fenolok.6,9 Ez a kétirányú kölcsönhatás a bélmikrobióta és a (poli)fenolok között arra késztette a tudományos közösséget, hogy csoportosítsa a populációt azok alapján.metabolikus fenotípus (fém típus), hogy megmagyarázza a polifenolok hatásában fennálló különbségeket.10,11 Pontosabban, az ET és az EA metabolizmusa szerint az egyedek urometabotípusokba (UM-ok) rétegezhetők, amelyek a bél mikrobiómának összetételével és működésével kapcsolatosak.7,8,12

Három különböző Uro termelési profilhoz kapcsolódó három emberi UM-ot (UM-A, UM-B és UM-0) írtak le nyugati és keleti populációkban.13–15 Ebben a tekintetben az A metabotípusú (UM-A) egyedek. Számos köztes Uros-t termelnek, de csak az urolitin A-t (Uro-A), a fő felszívódott Urot ebben az UM-ban, a mikrobiális katabolikus út végén. A B metabotípusú (UM-B) egyedek néhány közbenső Urot és három végső Urot termelnek, azaz az urolitin B-t (Uro-B), az urolitint A (IsoUro-A) és az Uro-A-t, amelyek az UM-B fő felszívódása. Ezért a köztes Uros elsősorban a bélben hathat, míg a végsőek helyi és szisztémás hatásokat fejthetnek ki.6 Ezzel szemben az 0 (UM-0) fémtípusú egyedek nem tudják előállítani ezeket a végső Urokat (csak a Eddig az urolitin-M5 prekurzort mutatták ki, amely nem szívódik fel a bélben).

Különbségeket figyeltek meg az Uroprofilok között az UM-ok között és a vastagbél mentén, ami a distalis colon régióban mutat túlnyomórészt Uro-termelést.16–19 Figyelemre méltó, hogy a spanyol és kínai egészséges önkéntesek UM-0 százaléka körülbelül 10%, és még magasabb is lehet Az Egyesült Államok populációja.13–15 A Gordonibacter és az Ellagibacter baktériumnemzetségekről kimutatták, hogy képesek az EA-t bizonyos Urossá metabolizálni.20–23Azonban azt találták, hogy egyes intermedierek (például Uro-D, Uro-E, Uro- Az M7 és az Uro-G) és a végső Uros (Uro-A és Uro-B) nem termelődik ezeknek a baktériumoknak a tiszta tenyészetében, ami azt jelenti, hogy más baktériumoknak kell kiegészíteni az UM-A-t és UM-B-t is konfiguráló Uros-készletet. . A közelmúltban azonosították azokat a bélbaktérium-konzorciumokat, amelyek részt vesznek az EA-metabolizmusban, hogy in vitro uroprodukáló metabotípusokat (UM-A és UM-B) hoznak létre.24

A Gordonibacter plusEnterocloster nemzetségeket és az Ellagibacter plus Enterocloster nemzetségeket tartalmazó bakteriális konzorciumok in vitro termelték az UM-A-val és az UM-B-vel kapcsolatos urolitint.25 Ezek a baktériumkonzorciumok azonban képesek replikálni az UM-A-val és UM-B-vel kapcsolatos humán Uro-profilokat in vivo még mindig ismeretlen. Ezen túlmenően ezen Uro-termelő baktériumok új probiotikumként való fogyasztásának biztonságossága továbbra is bizonytalan, mivel korábban nem tesztelték állatokon vagy embereken. Ebben a vizsgálatban a fenti baktériumkonzorciumok azon képességét értékelték, hogy kolonizálják az Uro-t nem termelő (UM{8}}szerű) patkányok bélrendszerét, és UM-A-t, illetve UM-B-t utánzó Uroproducerekké alakítsák át őket. Ezen bakteriális konzorciumok biztonságát is értékelték. Emellett két új, valós idejű kvantitatív PCR (qPCR) alapú eljárást fejlesztettek ki az Ellagibacter és az Enterocloster kimutatására és mennyiségi meghatározására székletmintákban.

Anyagok és metódusok

Vegyszerek és reagensek

Az urokat a VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, Spanyolország) kémiai úton szintetizálta és tisztította. Az EA-t a Sigma-Aldrich-től (St Louis, MO, USA) vásároltuk. A foszfátpuffer sóoldatot (PBS) a FisherScientifictól (USA), míg a metanolt, etanolt és hangyasavat a Panreac Químicától (Barcelona, ​​Spanyolország) szereztük be. A folyadékkromatográfiás-tömegspektrometriás (LC-MS) minőségű oldószereket a JT Bakertől (Deventer, Hollandia) vásároltuk. Ultrapure Millipore vizet (Bedford, MA, USA) használtunk a vizsgálat során. Minden vegyszer és reagens analitikai minőségű volt.

Bakteriális konzorciumok készítése

A Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, az Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T és az Enterocloster csavarozott CEBASS4A9 törzset, mindegyiket izoláltuk és azonosítottuk a laboratóriumunkban (CEBAS-CSIC, Spanyolország), mLWaerob-ban tenyésztettük. -Chalgren anaerob tápközeg (WAM, Oxoid) csövek 37 fokon 48 órán keresztül Concept 400 anaerob kamrában (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, Dél-Wales, Egyesült Királyság), és 10% glicerinnel és 0,05% L-ciszteán-hidrokloriddal (P-ciszteán-hidroklorid) kiegészített PBS-ben újraszuszpendálva Química, Barcelona, ​​Spanyolország). Anaerob inkubáció után konzorciumokat készítettek elő.24,25 Röviden, az "A bakteriális konzorcium" G-t tartalmazott. urolithinfaciens és E. bolteae törzsek; A "bakteriális konzorciumB" E. isourolithinifaciens és E. bolteae tenyészeteket tartalmazott; és a "kontrollkoktél" steril PBS-t tartalmazott 10% glicerinnel és 0,05% L-cisztein-hidrokloriddal. A beadás előtt az összes koktélt 3,5 ml-es alikvot részekre osztották és -80 fokon tartották.

Állatok, étrendek és kísérleti tervezés

A kísérleti protokollt (hivatkozás 624/2020) a helyi kormány, a Spanyol Nemzeti Kutatási Tanács Bioetikai Bizottsága (Madrid, Spanyolország) és a Murciai Egyetem (Spanyolország) Állatkísérletek Etikai Bizottsága hagyta jóvá. A kísérletek az Európai Unió állatkísérletekre vonatkozó ajánlásait követték (az Európai Parlament és a Tanács 2010/63/EU irányelve a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről). A 240 ± 31 g tömegű Wistar patkányokat (n=18; 9 nőstény és 9 hím) az Envigo-tól (Barcelona, ​​Spanyolország) szereztük be. Ezt a patkánymodellt az alapján választottuk ki, hogy az előzetes vizsgálataink során nem volt képes Uros-t termelni, amelyek során különböző patkánymodellekből származó székletmintákat vizsgáltak. Három csoportot (A, B és C) hoztak létre úgy, hogy véletlenszerűen 6 állatot (3 nőstény és 3 hím patkány) osztottunk be. ) csoportonként (1. ábra).

Minden patkánycsoportot két különböző ketrecben tartottak, nemenként osztva, egy olyan helyiségben, ahol hőmérséklet-szabályozott környezet (22±2 fok), 55 ± 10% relatív páratartalom és szabályozott világos-sötét ciklus (12 óra). A patkányok standard chow diétát kaptak (Teklad, Barcelona, ​​Spanyolország), amely (%/100 g friss tömeg) 14,3% fehérjét (kukoricagluténliszt), 48% szénhidrátot (búzafélék, őrölt búza, őrölt kukorica) és 4% zsírt (szójaolaj) tartalmazott. ), 2,9 kcal g-1 energiasűrűség és 4,1% nyersrost, EA-porral kiegészítve. 95%-os vagy annál nagyobb tisztaságú (3,6 mg 100 g-onként). Az EA-t homogénen összekevertük az őrölt standard tápanyaggal, újra pelletáltuk és liofilizáltuk. Az EA-val dúsított étrendet nedvességtől és fénytől távol tárolták. Az EA dózist adott apatkányok tápláléka körülbelül 0,72 mg/patkány/nap (EA1× diéta), ami humán ekvivalens napi 41 mg-os dózis – 1,26 Minden csoportot EA 1× diétával és csapvízzel ad libitum etettek a kísérlet során ( 5 hét). Mivel a székletmintákban kimutatott EA alacsony volt az első héten, a következő napokban némi extra EA-t adtak hozzá. A 3. héten patkányonként napi 1,5 mgEA-t vízben oldva orálisan, szondán keresztül adagoltak az állatoknak (összesen=EA 3× diéta), amelyet csak 1 hétig adtak be. Végül a 4. héten ≈5 g diót patkányonként naponta (egy másik EA-forrás) adtunk az EA 1× diétához, és a vizsgálat végéig fenntartották, hogy értékeljék a táplálékmátrixot tartalmazó EA hatását a baktériumok életképességére. hogy Urost gyártsanak. A súlyt, az ételt és a vízbevitelt minden nap megmérték. A bélbaktérium-konzorciumokat szájon át, szondán keresztül adták be. Az A csoport 500 µl A bakteriális koktélt, a B csoport 500 µl B bakteriális koktélt, a C csoport (kontroll) pedig 500 µl PBS-t kapott. Az első két hétben 2 naponta, a következő 2 hétben pedig minden nap végeztünk szájszondát. Az elmúlt héten (28-32. nap) az állatok ugyanazt az étrendet folytatták, EA-val és dióval kiegészítve, de szájon át baktériumok beadása nélkül. A vizsgálat végén az állatokat CO2-kamra segítségével leöltük.

Mintavételi eljárások

A vizsgálat során székletmintákat gyűjtöttünk Uro-analízishez UPLC-ESI-QTOF-MS/MS-sel, bélmikrobiótát pedig 16S rRNS-gén szekvenálással és qPCR-rel. Különböző időpontokban (a kiindulási állapot, a 28. nap és a vizsgálat végén) vért vettünk ki hematológiai és szérumbiokémiai elemzésekhez. A vérmintákat a farokvénából vettük (≈500 µL), és heparint tartalmazó csövekbe gyűjtöttük az alapvonalon, valamint a 28. és 32. napon (1. ábra). A plazma elválasztását azonnal végrehajtottuk centrifugálással 3000 g-vel 10 percig 4 fokon, és – -on fagyasztottuk. 80 fok a szerobiokémiai változók további meghatározásáig. A májat, a veséket és a lépet összegyűjtöttük, lemértük és megvizsgáltuk, hogy a leöléskor bármilyen morfológiai eltérést észleljünk.

A primerek tervezése és optimalizálása, valamint az Ellagibacter és Enterocloster qPCR-rel történő kvantifikálásához

Az Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T és az E. csavarozott CEBAS S4A9 16S rRNS génjeinek szekvenciáit a GenBank adatbázisból (EMBL adatbázis) szereztük be. A szekvenciákat a Molecular Evolutionary Genetics Analysis szoftvert (MEGA 11) létrehozó filogenetikailag közeli baktériumhoz igazították, és megvizsgálták a konzervált és variábilis szekvenciák régióit, hogy megtervezzék a primereket és a szondákat az Ellagibacter és az Enterocloster kimutatására és mennyiségi meghatározására (1. táblázat). A primer és szondát a Primer Questand Oligo Analyzer eszközökkel tervezték és validálták (Integrated DNATechnologies, Inc., Belgium). A TaqMan szondát az 5′ és 3′ végén egy 6-karboxi-fluoreszcein csoporttal jelölték. (6FAM) és egy szederoltó (BBQ), ill. A qPCR-t ABI 7500-as szekvenciaérzékelő rendszerrel végeztük. Az egyes primerek és szondák végső koncentrációja 300 és 375 nM volt Ellagibacter és 200 és 500 nM Enterocloster esetében. Hagyományos qPCR protokollt hajtottunk végre az Ellagibacter és a DNS amplifikálásáraEnterocloster, ill. Az Ellagibacteramplifikáció felfutási profilja 1 ciklus volt 95 fokban 5 percig, majd 45 ciklus 95 fokos 15 másodpercig, 50 fokos 40 másodpercig és 72 fokos 31 másodpercig. Végül hozzáadtunk 1 ciklust 72 fokon 5 percig. . Az Enterocloster amplifikáció felfutási profilja 1 ciklus volt 95 fokban 5 percig, majd 40 ciklus 95 fokos 15 másodpercig, 65 fokos 40 másodpercig és 72 fokos ciklusig 31 másodpercig. Végül 1 ciklust adtunk hozzá 72 fokon 5 percig.

Széklet DNS-kivonás és bélmikrobiális elemzések

A székletminták DNS-kinyerését a NucleoSpin® szöveti DNS-tisztító készlettel (Macherey-Nagel, Németország), a gyártó utasításai szerint, bizonyos módosításokkal végeztük. A DNS mennyiségét fluorimetriával (Qubit3.{2}} – ThermoFisher Scientific™, Egyesült Királyság) határoztuk meg, és a tisztaságot a 260/280 nm hullámhosszú abszorbancia arányból (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, UK) mérték. ). A bél mikrobiota összetételét a 16S rRNS gén V3 és V4 variábilis régióinak szekvenálásával határoztuk meg Illumina protokollok (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) szerint, 2 × 300 bp olvasási hossz páros vég futtatással (MiSeqReagent Kit v3). , Illumina Inc.). A metagenomikus szekvenálást MiSeq-Illumina platformon (FISABIO szekvenálási szolgáltatás, Spanyolország) végezték. Az adatfeldolgozást, a kiméra szekvencia eltávolítását, a szekvencia igazítását és a 16S rRNS génszekvencia klaszterezését a máshol leírtak szerint végezték el a taxonómiai besorolás megszerzéséhez.8,27 A Gordonibacter DNS-amplifikációt egy ABI 7500 qPCR rendszerben érték el a korábban leírtak szerint.19,28 Az Enterocloster és Ellagi a jelen tanulmányban tervezett specifikus primereket és próbákat a fent leírt qPCR protokollt követve alkalmaztuk. A mennyiségi meghatározáshoz a Gordonibacter, az Enterocloster és az Ellagibacter genomiális DNS-standard görbéit használtuk. Az összes székletmintát három párhuzamosban elemeztük.

Az urolitinek extrakciója, kimutatása és mennyiségi meghatározása a székletmintákban

A székletmintákat ({{0}},2–0,5 g) 1:10 arányban MeOH/H2O (8{{) oldattal extraháltuk. 20}/20), megsavanyítottuk 0,1% HCl-lel, homogenizáltuk 2 perces vortexeléssel, majd szobahőmérsékleten 10 percig 1500 ford./perc rázatással blokkfűtőben. A szuszpenziót 14 000g-vel centrifugáltuk 4 fokon 10 percig, majd a felülúszót 0,22 µm-es PVDF membránszűrőn (Millipore Corp., Bedford, MA) szűrtük, és háromszorosára hígítottuk MeOH-val (0,1% hangyasav). ) UPLC-ESI-QTOF-MS rendszerbe való befecskendezés előtt. Egy UPLC-rendszert (Agilent 1290Infinity) egy kvadrupól repülési idő (QTOF) LC/MS-rendszerrel (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Németország) kapcsoltunk a széklet metabolitok elemzésére gradiens elúciós módszerrel, mint korábban. .29,30 Röviden, az elválasztást aPoroshell 120 EC-C18 fordított fázisú oszlopon hajtottuk végre, mozgófázisként vizet és acetonitrilt használva, mindkettőt 0,1%-os hangyasavval megsavanyítottuk. Az áramlási sebesség 0,4 ml perc-1, az injektált térfogat 5 µl volt. Az adatfeldolgozáshoz a MassHunter Qualitative Analysis szoftvert (B.10 verzió, Agilent Technologies, Waldbronn, Németország) használtuk. Az összes metabolitot standardokkal való közvetlen összehasonlítással azonosítottuk, és molekulatömegükkel megerősítették. Az EA és a különböző Uros kalibrációs görbéit jó linearitás mellett kaptuk (R2 > 0,99).

Hematológia és klinikai kémia

A hematológiai változókat heparinizált vérben határoztuk meg egy automata hematológiai analizátorral, amely speciális szoftverrel rendelkezik patkányvérmintákhoz (AVDIA 120, Siemens, München, Németország). Az elemzett változók a következők voltak: átlagos corpuscularis térfogat (MCV), átlagos corpuscularis hemoglobin (MCH), átlagos corpuscularis hemoglobin-koncentráció (MCHC), vörösvértest-eloszlás (RDW), átlagos vérlemezketérfogat (MPV), trombocitakritérium (PCT), vérlemezke-eloszlási szélesség (PDW). , átlagos vérlemezke komponens (MPC), átlagos vérlemezke tömeg (MPM), trombocitaszám (PLT), retikulocita hemoglobin tartalom (CHr), és átlagos retikulocita testtérfogat (MCVr). A plazma biokémiai változóit, a kalciumot (Ca) és a foszfort (P) Olympus AU400 kémiai és toxikológiai elemzővel (Beckman Coulter, California, USA) elemeztük. A biokémiai változók a következők voltak: teljes fehérje (PROT), albumin (ALBU), globulin (GLOB), kreatinin (CREA), glükóz (GLUC), koleszterin (CHOL), trigliceridek (TRIGL), alkalikus foszfatáz (ALP), gamma-glutamil-transzpeptidáz GGT), aszpartát-aminotranszferáz (AST) és alanin-aminotranszferáz (ALT). Végül a tiroxin (T4) szintjét IMMULITE® 1000 immunoassay rendszerrel (Siemens) elemeztük.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± szórás (SD) formájában fejezzük ki. A statisztikai elemzést az SPSS szoftver 27-es verziójával végeztük.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), és a különbségek p < 0,05 statisztikailag szignifikánsnak tekintették. Az adatok normalitása Shapiro–Wilk teszttel történt. A különböző kezelési csoportok összehasonlítását ismételt mért varianciaanalízissel (RM ANOVA) végeztük Tukey vagy Dunnett T3 post hoc teszttel, attól függően, hogy az adatok normális vagy nem normális eloszlást követtek-e. A hímek és nőstények közötti különbségeket a páros Student-féle t-próbával vagy Wilcoxon signedrank teszttel vizsgáltuk, amikor az adatok normális vagy nem normális eloszlásúak voltak. Khi-négyzet lineáris diszkriminancia analízis effektusokat (LEfSe) alkalmaztunk a csoportok közötti különbségek kimutatására. Pearson-korrelációt használtunk a változók közötti lehetséges összefüggések elemzésére a normál eloszlású adatokban, míg a Spearman-korrelációt a nem normál eloszlású adatokban. Az adatdiagramokat a Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San Jose, CA, USA) segítségével végeztük.

Természetes növényi gyógyszer a székrekedés enyhítésére-Cistanche

A Cistanche az Orobanchaceae családjába tartozó parazita növények nemzetsége. Ezek a növények gyógyászati ​​tulajdonságaikról ismertek, és évszázadok óta használják őket a hagyományos kínai orvoslásban (TCM). A Cistanche fajok túlnyomórészt Kína, Mongólia és Közép-Ázsia más részein találhatók száraz és sivatagi régiókban. A Cistanche növényeket húsos, sárgás száruk jellemzi, és potenciális egészségügyi előnyeik miatt nagyra értékelik. A TCM-ben úgy gondolják, hogy a Cistanche tonizáló tulajdonságokkal rendelkezik, és általában a vese táplálására, a vitalitás fokozására és a szexuális funkciók támogatására használják. Az öregedés, a fáradtság és az általános jóléti problémák kezelésére is használják. Míg a Cistanche-t régóta használják a hagyományos orvoslásban, a hatékonyságával és biztonságosságával kapcsolatos tudományos kutatások jelenleg is folynak és korlátozottak. Ugyanakkor tartalmaz különféle bioaktív vegyületeket, például fenil-etanol-glikozidokat, iridoidokat, lignánokat és poliszacharidokat, amelyek hozzájárulhatnak gyógyhatásaihoz.

Wecistanche-écisztanche por, cisztanche tabletta, cisztanche kapszula,és más termékek felhasználásával fejleszteneksivatagcistanchealapanyagként, melyek mindegyike jó hatással van a székrekedés enyhítésére. A konkrét mechanizmus a következő: A Cistanche a hagyományos felhasználása és bizonyos vegyületei alapján feltételezhetően potenciális előnyökkel jár a székrekedés enyhítésében. Míg a Cistanche székrekedésre gyakorolt ​​hatásával kapcsolatos tudományos kutatások korlátozottak, úgy gondolják, hogy számos olyan mechanizmusa van, amely hozzájárulhat a székrekedés enyhítésére. Hashajtó hatás:Cistanchea hagyományos kínai orvoslásban régóta használják székrekedés elleni gyógyszerként. Úgy gondolják, hogy enyhe hashajtó hatása van, ami elősegítheti a bélmozgást és székrekedést okozhat. Ez a hatás a Cistanche-ban található különféle vegyületeknek tulajdonítható, mint például a fenil-etanoid glikozidok és poliszacharidok. A belek nedvesítése: A hagyományos használat alapján a Cistanche hidratáló tulajdonságokkal rendelkezik, különösen a beleket célozza meg. A belek hidratálásának és kenésének elősegítése segíthet a szerszámok felpuhításában és megkönnyítheti az áthaladást, ezáltal enyhíti a székrekedést. Gyulladáscsökkentő hatás: A székrekedés néha emésztőrendszeri gyulladással járhat. A Cistanche bizonyos vegyületeket tartalmaz, köztük fenil-etanol-glikozidokat és lignánokat, amelyekről úgy gondolják, hogy gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkeznek. Azáltal, hogy csökkenti a bélgyulladást, javíthatja a bélmozgást és enyhítheti a székrekedést.