A polifenolos antioxidánsok, a kvercetin és a naringenin közötti kölcsönhatások határozzák meg keverékeik megkülönböztető redox-kémiai és biológiai viselkedését 1. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Az elmúlt két évtizedben végzett kutatások olyan nem fertőző krónikus betegségek molekuláris alapon, mint plérelmeszesedés, magas vérnyomásA cukorbetegség és különösen a rák iránti érdeklődés feltárta, hogy ezeknek a betegségeknek van egy közös kockázati tényezője, amely a redox homeosztázis megzavarása, amelyet gyakran oxidatív stressznek neveznek12. Ez a reaktív oxigénfajták (ROS) megnövekedett endogén szintjének eredményeképpen alakul ki, mivel a szervezet antioxidáns gátja meghibásodik, és úgy gondolják, hogy elősegíti mindezen betegségek kialakulását.3. Így az a feltételezés következett, hogy a ROS semlegesítésére képes exogén faktorok, pl. a növényi antioxidánsok ellensúlyozhatják vagy lassíthatják a krónikus betegségek kialakulását és támogathatják kezelésüket. Ennek a hipotézisnek az igazolása részletes tanulmányokat indított az élelmiszerekben található antioxidánsokról, amelyek megelőző potenciált mutathatnak4. A metaanalízisben összefoglalt több, az élelmiszer-fogyasztást és az étrenddel összefüggő krónikus betegségeket összehasonlító tanulmány ugyanis csökkent kockázatot mutatott ki a gyümölcsökben és zöldségekben gazdag étrendek, a teljes kiőrlésű gabonafélék, valamint az olyan italok esetében, mint a bor, a kávé és a tea, ezért az antioxidáns fitokemikáliákban gazdag termékek. Nem meglepő módon azt feltételezték, hogy ezek az anyagok természetes forrásaikból izolálva, megtisztítva, majd az étrendben elérhetőnél nagyobb dózist tartalmazó étrend-kiegészítők formájában fogyasztva erőteljes kemopreventív szerekké válhatnak. Ezt a feltételezést számos bizonyíték erősítette meg, amelyek olyan tanulmányokból származnak, amelyek a krónikus betegségek, köztük a rák különböző kísérleti in vitro és in vivo modelljeit használták fel.7. Csalódást okozó módon nemrégiben humán vizsgálatok kimutatták, hogy az antioxidáns-kiegészítők nem mutatnak ilyen ígéretes hatást. . Például E8-vitaminnal vagy mikrotápanyag-készítményekkel végzett humán kohorsz- és eset-kontroll-vizsgálatok két metaanalízise arra a következtetésre jutott, hogy az antioxidánsok alacsony szintjének nincs hatása, míg a nagy dózisok növelhetik a rák és a szív- és érrendszeri betegségek előfordulását és mortalitását. az étrend-kiegészítők valódi növényeken alapultak, mint például koncentrált polifenolban gazdag élelmiszerek (gránátalma, zöld tea, brokkoli és kurkuma) specifikus keveréke, így jelentős védőhatást figyeltek meg prosztatarákos férfiaknál1.

További információért kattintson ide

A teljes értékű élelmiszerek ígéretes hatásai az izolált vegyületekkel ellentétben összhangban vannak az élelmiszer-szinergia koncepcióval, amely adalékanyagként vagy több, mint a különböző élelmiszer-összetevők kombinációjának az emberi egészségre gyakorolt ​​adalék hatása. Korábbi tanulmányunk igazolta ezt az elképzelést azáltal, hogy összehasonlította a valódi élelmiszerek bioaktivitását izolált fő antioxidánsukkal. Ez azt mutatta, hogy a bogyós gyümölcsök kivonatainak biológiai hatásai nagymértékben eltérnek az antocianin-cianidin-3-O-glükozid hatásaitól. Más jelentések is felhívták a figyelmet a különböző bioaktív vegyületek és az élelmiszer-mátrix összetevői közötti kölcsönhatások fontosságára, amelyek együttműködő tényezőknek bizonyultak, és amelyek meghatározzák az élelmiszerek végső bioaktivitását3-1. A közelmúltban végzett mechanikai vizsgálataink, amelyekben a bioaktív kakaó összetételének lépésenkénti helyreállítását végezték, szintén alátámasztották az élelmiszer-szinergia gondolatát, de bebizonyították, hogy a komplex összetételű minták biológiai hatásai nem csupán az egyes komponensek aktivitásának kombinációja. Mindezek a megfigyelések azt sugallták, hogy az izolált antioxidánsok redoxhoz kapcsolódó bioaktivitásának mérlegelésekor a keverékeikhez képest figyelembe kell venni az összetevők közötti kölcsönhatásokat. A keverék növekvő összetettségefitokemikáliákúgy tűnt, hogy hozzon létre egy újatredox-aktív anyagahelyett, hogy a keveréket a hozzáadott vegyületre jellemző új aktivitásokkal dúsítaná, amire az élelmiszer-szinergia koncepcióból következtet.

A Cistanche javíthatja az immunitást

A jelenlegi kutatásban leegyszerűsítettük a kísérleti rendszert úgy, hogy csak két magszerkezetre korlátoztuk, hogy kölcsönhatásaik részleteibe mélyedjünk a kémiai szerkezet, a redox reaktivitás és a redoxhoz kapcsolódó bioaktivitások összefüggésében, hogy lehetővé tegyük a jobb megértést, ill. az antioxidánsok kemoprevenciós potenciáljának előrejelzése.' Az erre a célra használt fitokemikáliák a különféle gyógynövényekben, zöldségekben és gyümölcsökben, különösen a citrusfélékben jelen lévő általános antioxidánsok voltak, nevezetesen: a kvercetin (O) és annak ramno-oldal-rutinja által képviselt flavonolok ( R) és flavanonok a naringenin (N-) és annakneohesperidosidnaringin (N plusz), valamint e vegyületek két keveréke (QN-, RN plus). A tanulmány kémiai összetétele magában foglalta az oxidatív folyamatok termodinamikájába és kinetikájába némi betekintést nyújtó meghatározásokat, például a DPPH tesztet, a potenciometrikus titrálást és a differenciálimpulzus voltammetriát (DPV). A biológiai tesztek a vizsgált minták sejtnövekedésre (MTT teszt), celluláris antioxidáns aktivitásra (CAA vizsgálat), genotoxicitásra (comet assay), globális DNS metilációs szintre (comet assay epigenetic változata) és a 84 redox expressziójára gyakorolt ​​hatást vizsgálták. -kapcsolódó gének (real-time PCR array alapú technológiák). A biológiai kísérletek során a táplálkozási vizsgálatokhoz javasolt vastagbél adenokarcinóma HT29 sejtvonalat használtuk a bélhám modelljeként, amely viszonylag magas koncentrációjú lenyelt antioxidánsoknak lehet kitéve.

Eredmények

Korábbi vizsgálataink, amelyekben a kakaópor és fő összetevőinek redoxhoz kapcsolódó tulajdonságait hasonlították össze, rámutattak a keverék polifenolos komponensei közötti kölcsönhatások fontosságára az általános antioxidáns aktivitásra. A jelenlegi kutatásban leegyszerűsítettük a kísérleti rendszert, hogy részletesebben megvizsgáljuk az ilyen kölcsönhatásokat egy olyan flavonoid pár esetében, amelyek gyakori élelmiszer-összetevők. Két flavonoidot választottunk, mind aglikonok, mind glikozidok formájában. A flavonolokat a kvercetin (Q) és annak jellemezteramnosid-rutin(R) ésflavanonoka naringenin(N-) és annak neohesperidosid naringinje (N plusz ). Ezek a polifenolok különböznek a redox-aktív hidroxilcsoportok számában és elhelyezkedésében, valamint abban, hogy képesek intramolekuláris H-kötéseket kialakítani, azaz három olyan szerkezeti jellemzőt mutatnak be, amelyek megzavarhatják az antioxidáns vegyületek tulajdonságainak csökkentését. Amint az 1. ábrán látható, a közbenső szemikinon gyökök a B gyűrűben lévő katekolrész oxidációjának első lépésében keletkeztek

Q vagy R kétféleképpen stabilizálható8,19. Az első mód a magszerkezet konjugálása a B és C gyűrűn, valamint a második H-kötés kialakítása a szomszédos OH-csoporttal vagy a C-gyűrűben lévő szubsztituensekkel, különösen az R-ben. A hidroxilcsoportok jelenléte a 3-as helyzetben lévő cukorszubsztituensben A C gyűrű tovább fokozhatja ezt a stabilizáló hatást a H-kötések több lehetőségének köszönhetően (közvetlenül vagy vízmolekulán keresztül). Ezzel szemben a köztes fenoxicsoport az N pluszban vagy az N-ben nem stabilizálódik a gyűrűt is magában foglaló konjugált kettős kötésekkel C vagy H-kötés szomszédos szubsztituensekkel. Ezenkívül az N pluszban a cukorrész az A gyűrűhöz kapcsolódik, és így túl messze van ahhoz, hogy H-kötést hozzon létre a B gyűrűben lévő gyökkel. Várható, hogy ezek a szerkezeti jellemzők befolyásolják a vizsgált flavonoidok redox aktivitását.

Antioxidáns hatás kémiai tesztekkel.

A vizsgált polifenolok és keverékeik redukáló tulajdonságainak meghatározását két kémiai vizsgálattal végeztem 37 °C-on, a redox folyamatok sejtkörülményeihez igazodva. Az első módszer az általánosan használt szakaszos spektrofotometriás DPPH teszt volt; az egyes flavonoidokra és keverékeikre vonatkozó eredményeket a 2A. ábra mutatja be. Ezeket n sztöchiometriai értékekkel fejezzük ki, ahol a 10-es szám a reakció időtartamára utal – 10 perc. Az időparaméter beépítésével a mérésekbe egy kinetikai szempont is beépült az antioxidáns aktivitás értékelésébe, amint azt korábban leírtuk13. Ezekben a meghatározásokban mindkét aglikon erősebb redukáló tulajdonságokat mutatott, mint a megfelelő glikozidok, amint azt korábban ezzel a teszttel2021 is kimutatták, míg a flavonolok erősebbek voltak. aktívabb, mint a flavanonok. Az O volt a leghatékonyabb vegyület a DPPH-gyökök megkötésében, és ezt követte az R. A DPPH-val szembeni elhanyagolható reaktivitás ellenére mindkét flavanon, köztük az N, amely önmagában nem mutatott redox tulajdonságokat a reakció 10 perces periódusa alatt, jelentősen növelte a teljes antioxidáns aktivitást. keverékek, mind aglikonok ON-, mind glikozidok esetében RN plus .

A második módszer potenciometrikus titrálást (PT) tartalmazott, amely lehetővé teszi a standard redukciós potenciál (E) mérését, és így értékelte a tiszta vegyületek termodinamikai képességét az elektronszerzésre. A meghatározott értékek Megerősítve, hogy Q és R erős redukáló vegyületek (2B. ábra). Azonban PT-ben R szívesebben fogadta be a donor elektronokat, mint Q. Az E meghatározása N- és N plusz esetén nem volt lehetséges az oxidációs folyamat alatti nagyon lassú elektrontranszfer miatt (az N plusz esetén lassabb). A PT méri a referenciaelektróda és a mérőelektróda közötti potenciálkülönbséget a titrálószer egyes részeinek hozzáadása után. Az állandósult potenciál azt jelenti, hogy a titrálószer és az analit közötti reakció (Q) hányadosa stabil (Q= állandó). Ha a reakció során a töltésátvitel sebessége alacsony (alacsony áramok voltammetriában), akkor hosszú időbe telik a Q stabilizálása PT-ben. Következésképpen nagyon lassú reakciók esetén a potenciometrikus titrálási görbe nehezen elérhető, és így az E" talált értéke kevésbé megbízható.

Antioxidáns aktivitás differenciális impulzus voltammetriával,

Az alkalmazott kémiai vizsgálatok azt sugallták, hogy a polifenolok antioxidáns hatásának tisztázása során figyelembe kell venni a kinetikai szempontokat, ahol a köztes gyökök stabilitása is szerepet játszhat. Amint az 1. ábrán látható, a flavanol-oxidáció első szakaszában képződő szemikinon gyökök sokkal jobban stabilizálódnak, mint a flavanon oxidációja során keletkező fenoxicsoportok. Ezt az összefüggést az 1. ábra szemlélteti, és befolyásolhatja a redox folyamatok sebességét. Ezért a vizsgált tiszta antioxidánsok és keverékeik redukciós-oxidációs tulajdonságait differenciális pulzus voltammetria (DPV) segítségével tovább elemeztem. Mivel ez a technika lehetővé teszi az oxidációs reakciók termodinamikai és kinetikai aspektusainak nyomon követését, végül mindkettőt egy antioxidáns teljesítménynek (AOP) nevezett paraméterben egyesítik15.

A DPV mérésekkel végzett megfigyelések (2B-F. ábra) ellentmondtak a DPPH teszttel szerzett megfigyeléseknek (2A. ábra). Meglepő módon a DPV feltárta, hogy az irodalomban kiváló redukálószerként leírt Q, ha csak termodinamikai szempontokat vesszük figyelembe (anódos csúcspotenciál, E.), a leggyengébb antioxidánsnak bizonyult (2B. ábra, C). Termodinamikailag az R valamivel erősebb antioxidáns volt. Érdekes módon az irodalomban az N- és N pluszt gyenge antioxidánsnak tekintik, termodinamikailag a legmagasabb E értéket mutatták, ami azt jelenti, hogy nagyon erős redukálószerek voltak. Mindkét flavonoid osztály esetében a glikozid rész növelte az aglikonok antioxidáns aktivitását. A kinetikával kapcsolatos paraméterek (2E, F ábra), azaz az anódáram (I,.) és a töltéssűrűség (Q) azonban azt mutatják, hogy az N plusz oxidációja lassabb folyamat, mint a Q és R oxidációja. , az anódáram (I) alacsonyabb volt az N-nél, mint a Q és R esetében, de ennek a vegyületnek a töltésátvitele elérte a legmagasabb értéket.

A keverékek esetében két anódos csúcsot (1. és 2.) detektáltunk a voltammetriás görbéken, ahogy az a kétkomponensű keveréknél várható volt. Az anódos csúcspotenciálok (E.) meghatározott értékei azt mutatták, hogy az első megfigyelt csúcs a flavonolok oxidációját tükrözi, míg a 2"d csúcs a flavanonok oxidációját (kiegészítő anyagok - S1 ábra). A legtöbb esetben a másik komponens jelenléte keverék befolyásolta a redox folyamat termodinamikáját és/vagy kinetikáját a tiszta vegyületek oxidációjához képest, például QN- esetén az E. értéke az 1. oxidációs csúcsnál egyenlő volt a Q anódos csúcspotenciáljával Az N-oxidációnak megfelelő 2"-os anódos csúcs és ennek az átmenetnek a potenciálja magasabb volt, mint a tiszta N anódos potenciálja (2C. ábra). Ennek a reakciónak a kinetikájánál az ellenkező helyzetet figyelték meg. A QN 1s anódos csúcsának I és Q értéke közel volt a tiszta komponensek oxidációjának kinetikai paramétereihez (2E, F ábra), míg az ON-oxidáció 2n lépése során kicserélődött töltés sokkal alacsonyabb volt, mint az N-oxidációé (2F. ábra). Ezek a kombinált termodinamikai és kinetikai hatások ennek a keveréknek az AOP-jának (2D. ábra) növekedését eredményezték, ami összhangban van a DPPH teszt eredményeivel.

Citotoxicitás értékelése.

A vizsgált flavonoid aglikonok (Q, N-), glikozidok (R, N plusz) és keverékeik (QN-, RN plus ) bélsejtek növekedésére gyakorolt ​​hatását MTT teszttel értékeltük. A humán vastagbél-adenokarcinóma HT29 sejtvonalat választották az emésztőrendszeri epitélium modelljéül, azaz a lenyelt élelmiszer-összetevőkkel, például polifenolokkal közvetlenül érintkező szövetként. A sejteket egyedi flavonoidokkal és azok keverékeivel kezeltük a vérben potenciálisan előforduló fiziológiás koncentrációban (0.01-1 uM)22-2 vagy a tápcsatornában elérhető koncentrációban (10-100). uM) étel elfogyasztása után25-27. A 6, 24 és 72 órás kezelések dózis-válasz görbéit a 3. ábra mutatja be.

Az egyes vegyületek egyik vizsgált koncentrációban sem befolyásolták szignifikánsan a sejtnövekedést, sem rövid, sem elhúzódó kezelések esetén. A kivétel a legmagasabb N koncentráció volt, amely 72 óra elteltével 75%-kal gátolta a sejtnövekedést a kontrollhoz képest. Ezzel szemben a vizsgált keverékek (QN-, RN plusz) szignifikánsan stimulálták a sejtnövekedést koncentrációfüggő módon minden vizsgált expozíciós időre. Ezt a hatást figyelték meg alacsony koncentrációknál (0.01-1 uM), amelyek a véráramban elérhetők voltak, és még erősebb volt magasabb koncentrációknál (10-100 uM), amelyhez az emésztőrendszer hámsejtjei ki lehet téve. Csak a legmagasabb QN-koncentráció esetén, 72 órás kezelés után szűnt meg a stimuláció, valószínűleg az ilyen körülmények között megfigyelt N- gátló hatások miatt. Celluláris antioxidáns aktivitás. A tisztított flavonoidok és keverékeik hatékonyságát a HT29 sejtek endogén antioxidáns gátjának támogatásában CAA assay segítségével igazoltuk. Ez a módszer azon alapul, hogy egy redox-aktív vegyületeket tartalmazó minta képes gátolni vagy elősegíteni a felszívódott szonda oxidációját. sejtek által fluoreszcens formájába. A szonda oxidációjának gyengülése, amelyet a fluoreszcencia kioltásaként figyeltek meg, a sejtekben lévő antioxidánsok redukáló képességének mértéke (pozitív CAA-értékek), míg a szonda oxidációjának növekedése a prooxidatív aktivitásukat (negatív CAA-értékek) jelöli28 . A meghatározásokat az aglikonokra és glikozidokra olyan koncentrációkban végezték, amelyek tükrözik a fiziológiás – endogén – és az élelmiszer eredetű – exogén – bélexpozíciót. A vizsgált flavonoidokkal végzett inkubálást az aglikonok és glikozidok standard javasolt időtartama, 1 óra 18 óra. Az alkalmazott sejtmodellben a redox válasz kinetikájának nyomon követését célzó elhúzódó (3 és 6 órás) kezeléseket csak az aglikonok esetében alkalmaztuk, mivel azok a celluláris antioxidáns aktivitásra nagyobb mértékben hatnak.

A vizsgált flavanonok és flavonolok különböztek a HT29 sejtek redox státuszára gyakorolt ​​hatásukban. Az egyes aglikonok esetében a meghatározott koncentrációfüggő válaszokat 1 órás expozíció után figyeltük meg. A flavonol-Q antioxidáns aktivitása azonban az alkalmazott koncentrációval nőtt, míg a flavanon-N- esetében a prooxidatív hatás fokozatos erősödése volt megfigyelhető (4A. ábra). Az egyes glikozidok dózisfüggősége kevésbé volt nyilvánvaló; csak a legmagasabb koncentrációban lévő R növelte meggyőzően a celluláris antioxidáns aktivitást (4A. ábra). Érdekes módon mindkét keverék fokozott antioxidáns aktivitást mutatott, amit nyilvánvalóan nem befolyásolt az egyes vegyületeknél tapasztalt prooxidatív hatás.

A 4B. ábra a HT29 sejtek 1, 3 és 6 órás aglikonos kezelését követően meghatározott CAA értékek változásának kinetikáját mutatja be. A legalacsonyabb koncentrációnál (1 μM), amely megfelel a fiziológiás expozícióknak, az időfüggést sem az egyes aglikonok, sem a keverékeik esetében nem figyelték meg. A magasabb koncentráció CAA-értékekre gyakorolt ​​hatása azonban egyértelműen időfüggő volt. A hosszan tartó expozíció csökkentette mind az N- prooxidatív hatását, mind a Q és QN- antioxidáns aktivitását.

A vizsgált aglikonok eltérő nutrigenomikus aktivitást mutattak, amit a sejteken alkalmazott koncentráció is módosított.

A flavanon N-1 μM-nál szignifikánsan csökkentette a CCL5, CYGB, GTF2I, MT3 expresszióját (p<0.05) as="" well="" as="" showing="" some="" tendency="" to="" down-regulate="" alox12="" and="" ucp2="" transcription=""><><0.09). the="" increased="" expression="" caused="" by="" n-was="" observed="" for="" the="" ncf2="" gene="" only=""><0.05). these="" genes,="" though="" in="" one="" or="" another="" way,="" related="" to="" cellular="" redox="" status,="" do="" not="" fall="" into="" any="" specific="" common="" pathway="" nor="" are="" involved="" in="" any="" coordinated="" process.="" the="" protein="" encoded="" by="" ccl5="" belongs="" to="" a="" group="" of="" inflammation-relevant="" genes,="" while="" the="" cytoglobin="" gene(cygb)functions="" as="" a="" tumor="" suppressor="" gene2930.="" gtf2i="" protein="" acts="" as="" a="" general="" transcription="" factor="" and="" is="" involved="" in="" the="" coordination="" of="" cell="" growth="" and="" division31.="" so,="" the="" other="" gene="" down-regulated="" by="" the="" n-at="" l="" um="" gene—mt3—may="" cooperate="" with="" it,="" because="" although="" it="" plays="" a="" role="" in="" zinc="" and="" copper="" homeostasis,="" it="" is="" also="" known="" as="" growth="" inhibition="" factor2.="" the="" enzyme="" encoded="" by="" alox12="" acts="" on="" different="" polyunsaturated="" fatty="" acid="" substrates="" to="" generate="" bioactive="" lipid="" mediators3.="" the="" protein="" coded="" by="" ucp2="" has="" been="" described="" as="" a="" mitochondrial="" scavenger="" of="" ros.="" the="" only="" up-regulated="" gene="" by="" n-at="" 1="" um="" was="" ncf2="" which="" encodes="" a="" cytosolic="" protein="" required="" for="" the="" activation="" of="" the="" nadph="" oxidase="" system="" responsible="" for="" superoxide="">

Ez a HT29 sejtekre 10 uM-ban alkalmazott flavanon 5 gén expresszióját befolyásolta, amelyeket alacsonyabb dózisa szintén leszabályozott, nevezetesen: CCL5, CYGB.MT3(p<0.05)as well="" as="" gtf2i="" and=""><><0.09).additionally,in contrast="" to="" lower="" dose,="" n-at="" 10="" um="" showed="" tendency="" to="" decrease="" expression="" of=""><><0.09). the="" latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" with="" superoxide="" dismutase="" activity,i.e.,="" the="" antioxidant="" enzyme="" catalyzing="">

szuperoxid gyökök dismutációja hidrogén-peroxiddá és oxigénné6. Az N- által okozott expresszió enyhe növekedése 10 uM-nál csak a VIMP génnél volt megfigyelhető (0,05<><0.09)that is="" involved="" in="" the="" degradation="" process="" of="" misfolded="" endoplasmic="" reticulum(er)luminal="">

Ez a cikk a www.nature.com/scientificreports webhelyről származik