A Cistanche Tubulosa-ból származó fenil-etanol-glikozidok interferenciája az MTT-vizsgálattal

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu és Yu-Qi Gao

Absztrakt:

Az MTT assay-t, mint szűrési módszert széles körben alkalmazzák a sejtek életképességének és proliferációjának mérésére. Meg kell azonban jegyezni, hogy az MTT-vizsgálat nem feltétlenül tükrözi pontosan a hatásátCistanche tubulosaetanolos kivonat az EA.hy926 sejtek életképességére. Az MTT assay ellentmondásos megfigyeléseiért felelős komponensek, az echinakozid és az akteozid vizsgálatára és azonosítására a C. tubulosa etanolos kivonatból két fő fenil-etanol-glikozidot izoláltunk. A CCK-8, a Hoechst 33342 és az annexin V-FITC/PI vizsgálatokból származó adatok arra utalnak, hogy a két izolált vegyületben jelenlévő koffeoilcsoport volt felelős az MTT-vizsgálat ellentmondó eredményeiért. Ezek az adatok hangsúlyozzák a különböző módszerek alkalmazásának szükségességét a gyógyászati ​​szerek sejtek életképességére gyakorolt ​​hatásának meghatározására a félrevezető eredmények elkerülése érdekében.

Kulcsszavak: MTT vizsgálat;feniletanoid glikozid; kávésav; sejt életképesség; interferencia

Bevezetés

A parazita növényCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceae család) széles körben elterjedt észak-afrikai, arab és ázsiai országokban [1]. Az abból eredCistanche tubulosaésCistanche deserticolafontosak a hagyományos kínai orvoslásban, mivel impotencia, sterilitás, lumbágó és a vastagbél tehetetlensége miatti székrekedés kezelésére használták [2]. Ezenkívül a Cistanche tubulosa etanolos kivonatáról kimutatták, hogy jelentős védőhatást fejt ki egerekben az agyi hypoxia ellen [3].

Az endoteliális sejtek döntő szerepet játszanak a hypoxiás pulmonalis hypertonia patogenezisében. Az EA.hy926 endothel sejtvonal nagymértékben hasonlít az elsődleges endoteliális sejtekhez. Saját vizsgálatunk során a hipoxia ellenes hatásárólCistanche tubulosaetanolos kivonattal az EA.hy926 endoteliális sejten észleltük, hogy a 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) Assay, amelyet gyakran használnak a sejtek életképességének értékelésére a citotoxicitás és a citosztatikus aktivitás vizsgálataiban, ellentmondó eredményeket produkált azáltal, hogy a kezelés után megnövekedett EA.hy926 sejtek életképességét mutatta.

A sejtek életképességének pontos értékelése elengedhetetlen egy gyógyszer potenciális citotoxikus vagy citoprotektív hatásának azonosításához. Ezért megvizsgáltuk, hogy a C. tubulosa etanolos kivonatában mely komponensek lehetnek felelősek az MTT assay során megfigyelt ellentmondó eredményekért. A C. tubulosa etanolos kivonatából két fő fenil-etanoid glikozidot (PhG) izoláltunk, az echinakozidot (továbbiakban 1. vegyület) és az akteozidot (továbbiakban 2. vegyület), és különféle módszerekkel meghatároztuk hatásukat az EA.hy926 sejtek életképességére. Ezen túlmenően annak tisztázása érdekében, hogy az 1-es és 2-es vegyület melyik szubsztituense lehet felelős az ellentmondásos eredményekért, megvizsgáltuk ezek aglikonjait, a kávésavat (a továbbiakban: 3. vegyület) és a 3-as 4-dihidroxi-fenil-etanolt (a továbbiakban: 4. vegyület). az EA.hy926 sejtek életképességére vonatkozóan ugyanezekkel a módszerekkel.

Eredmények és megbeszélés

A vegyületek azonosítása

A C. tubulosa etanolos kivonatból izolált két vegyület szerkezetét mágneses magrezonancia (NMR) és tömegspektrometriás (MS) analízissel azonosítottuk, és az 1. ábrán mutatjuk be. Az 1. vegyületet echinakozidként azonosítottuk a korábban közölt NMR-rel (táblázat) 1) és MS (m/z 785 [M−H]− ) adatok [4]. A 2. vegyület NMR-spektrumai nagyon hasonlóak voltak az 1. vegyületéhez, kivéve a -D-glükopiranozil-csoport hiányát (1. táblázat). A 2. vegyületet (m/z 623 [M−H]−) akteozidként azonosították [5]. Fontos, hogy mindkét vegyület ugyanazt az aglikont tartalmazza, amely magában foglalja a kávésavat (3. vegyület) és a 3-as 4-dihidroxi-fenil-etanolt (4. vegyület).

Sejtéletképességi vizsgálatok

Az 1–4. vegyületek EA.hy926 sejtek életképességére gyakorolt ​​hatásának elemzésére MTT és CCK{{0}} vizsgálatokat használtunk. Az MTT vizsgálat kimutatta, hogy az EA.hy926 sejtek életképessége szignifikánsan megnőtt a 25 és 50 μM 1., 2. vagy 3. vegyülettel végzett kezelés után (166,3 százalék és 174,1 százalék az 1. vegyületnél, 205,8 százalék és 224,3 százalék a vegyületnél). 2, illetve 164,8% és 189,6% a 3. vegyület esetében, p < 0,05,="" a="" kontrollsejtekkel="" összehasonlítva="" (2a.="" ábra).="" továbbá="" a="" sejtek="" morfológiai="" vizsgálata="" megállapította,="" hogy="" az="" 50="" μm="" 1-es,="" 2-es="" vagy="" 3-as="" vegyülettel="" végzett="" kezelés="" fokozta="" a="" lila="" formazánkristályok="" képződését,="" amelyek="" az="" élő="" sejtek="" arányát="" közvetlenül="" jelzik="" (3.="" ábra).="" ezzel="" szemben="" a="" cck-8="" vizsgálat="" azt="" sugallta,="" hogy="" a="" sejtek="" életképessége="" szignifikánsan="" csökkent="" a="" 12,5,="" 25="" és="" 50="" μm="" 1.,="" 2.="" vagy="" 3.="" vegyülettel="" végzett="" kezelés="" után="" (75,5%,="" 45,1%="" és="" 43,7%="" az="" 1.="" vegyületnél,="" 85,5%,="" 51,8%,="" illetve="" 34,3%="" a="" 2.="" vegyületnél,="" illetve="" 64,5%,="" 48,2%="" és="" 36,4%="" a="" 3.="" vegyületnél;="" p="">< 0,05,="" a="" kontrollsejtekhez="" képest="" (2b.="" ábra).="" a="" 4.="" vegyület="" nem="" befolyásolta="" a="" sejtek="" életképességét="" sem="" az="" mtt,="" sem="" a="" cck{66}}="" vizsgálatban.="" a="" két="" vizsgálattal="" kapott="" eredmények="" közötti="" eltérés="" arra="" utal,="" hogy="" a="" két="" vizsgálat="" közül="" az="" egyik="" nem="" tükrözi="" pontosan="" az="" 1.="" és="" 2.="" vegyületnek="" az="" ea.hy926="" sejtek="" életképességére="" gyakorolt="">

Apoptózis értékelése Hoechst festéssel

A Hoechst 33342 egy sejtpermeábilis DNS-festék, amelyet ultraibolya fénnyel gerjesztenek, és 460-490 nm-en kék fluoreszcenciát bocsátanak ki. Az apoptotikus sejtek kondenzált kromatinja fényesebben festődik, mint a normál sejtek kromatinja [6]. Míg a kontrollsejtek egyenletesen diszpergált kromatint, normál organellumokat és ép sejtmembránokat mutattak, addig az 50 μM 1, 2 vagy 3 vegyülettel 48 órán át inkubált sejtek az apoptotikus sejtek tipikus festődését mutatták (4A. ábra). Ezzel szemben a sejtek 50 μM 4-es vegyületnek való kitétele nem növelte az apoptotikus sejtmagok számát a kontroll kezeléshez képest.

Apoptotikus sejtek áramlási citometrikus elemzése

Az annexin V-FITC/PI kettős festés vizsgálata az annexin V-FITC foszfatidil-szerinhez való nagy affinitású kötődése alapján azonosítja az apoptotikus sejteket, amely az apoptózison áteső sejtekben külsődlegessé válik [7]. Ebben a vizsgálatban az életképes sejtek nem kötődnek sem az annexin V-hez, sem a PI-hez, ezért nem festődnek meg (bal alsó negyed), a korai apoptotikus sejtek zöldre festődnek az annexin V-FITC kötődése révén (jobb alsó negyed), és a késői apoptotikus sejtek. zöldre és vörösre festődnek az annexin V-FITC foszfatidil-szerinhez, illetve a PI-nek a nekrotikus sejtekhez való kötődésével (jobb felső negyed). Amint a 4B. ábra mutatja, az 50 μM 1., 2. vagy 3. vegyülettel 48 órán át inkubált sejteket az apoptotikus sejtek százalékos aránya 3,74%-ról (kontrollsejtek) 10,32%-ra, 12,95%-ra, illetve 11,30%-ra nőtt. A kontrollsejtekhez képest a 4-es vegyület nem növelte az apoptotikus EA.hy926 sejtek százalékos arányát.

A CCK-8 vizsgálattal és a Hoechst 33342 festéssel kapott eredményekkel összhangban az áramlási citometriás vizsgálat azt mutatta, hogy az 1., 2. és 3. vegyületek apoptózist indukáltak EA.hy926 sejtekben. Összességében ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy az EA.hy926 sejtek életképességének az 1–3.

Vita

1983-ban Mosmann kifejlesztett egy kolorimetriás MTT mikrolemezes vizsgálatot a sejtproliferáció és a citotoxicitás mérésére [8]. Ezt az egyszerű vizsgálatot és annak módosításait ma már széles körben alkalmazzák a sejtbiológiai laboratóriumokban szerte a világon. Az emlőssejteken végzett frakcionálási vizsgálatok azt mutatták, hogy a redukált piridin nukleotid kofaktor, a NADH felelős a legtöbb MTT redukcióért. Ezt egész sejteket használó vizsgálatok is alátámasztották [9]. Az MTT redukciója ezért a metabolikusan aktív sejtekhez kapcsolódik, és nem csak a mitokondriális légzéssel, hanem a citoplazmával és a nem mitokondriális membránokkal is, beleértve az endoszóma/lizoszóma kompartmentet és a plazmamembránt is [10]. Az MTT-molekula nettó pozitív töltése a plazmamembrán potenciálon keresztüli sejtfelvételének elsődleges tényezője.

Nevezetesen, az MTT vizsgálat alkalmanként nem tükrözi pontosan azt a tényleges hatást, amelyet a vizsgált vegyület adott sejtekre gyakorol. Azonban nem azonosították azokat a kémiai szerkezeteket vagy csoportokat, amelyek ellentmondó eredményeket okozhatnak az MTT vizsgálatban. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az MTT-teszt alábecsülheti a (-)-epigallocatechin-3-gallát, a zöld teában leggyakrabban előforduló polifenol antiproliferatív hatását [11]. A tumor kemoszenzitivitásának kimutatására az MTT assay-t használó vizsgálatokban a rákellenes kemoterápiás szerek, például az epirubicin, paklitaxel, docetaxel és imatinib-mezilát (Gleevec) fokozott sejtéletképességet mutattak [12,13]. Ezenkívül számos tanulmány beszámolt arról, hogy bizonyos növényi kivonatok és redox-aktív polifenolok zavarhatják az MTT-tesztet, mivel közvetlenül csökkentik az MTT-tetrazólium-sót sejtek hiányában [14].

Az MTT formazánkristályok szolubilizálásának szükségessége a spektrofotometriás analízis előtt mikrolemez-leolvasóban, valamint a reakció eredendő végpont-jellegét korlátozza az MTT-vizsgálat bizonyos alkalmazásokra. Ez tetrazólium analógok kifejlesztéséhez vezetett, amelyekben a fenilcsoportokat negatív töltésű szulfonátcsoportok díszítik, mint például 2,3-bisz-(2-metoxi-4-nitro- 5- szulfofenil)-2H-tetrazólium-5-karboxamid (XTT), negatív töltésű belső só [15] és 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il) -5-(3-karboxi-metoxi-fenil)-2-(4-szulfofenil)-2H-tetrazólium (MTS), az MTT-vel szoros rokonságban álló, gyengén savas belső só [16] . Ezek a módosítások olyan tápközegben oldódó formazántermékek előállítását eredményezték, amelyek kiküszöbölték a mennyiségi meghatározás előtti szolubilizálási lépést. Ennek megfelelően, mivel ezeken a molekulákon a megnövekedett negatív töltés csökkentette a sejtmembránokon való áthaladási képességüket [17], a köztes elektronakceptorok (IEA), például a 1-metoxi-5-metil-fenazinium-metil-szulfát ({{25) }}metoxi PMS) volt szükség a tetrazol festék redukciójának elősegítésére vagy a redukció sebességének fokozására.

A közelmúltban a vízoldható tetrazóliumsók új generációját fejlesztették ki, amelynek prototípusa a WST-1 [18]. A WST-1, egy jódmaradékot tartalmazó, negatív töltésű, diszulfonált belső só, stabilabb, mint az XTT és az MTS 1-metoxi-PMS, kötelező IEA jelenlétében. Ez vezetett a WST{5}}/1-metoxi PMS-nek, mint kényelmes egyetlen reagens sejtproliferációs készletnek a forgalomba hozatalához. A WST sorozatból számos további tetrazóliumsót fejlesztettek ki, amelyek közül a leghasznosabb talán a WST-8 [19]. Úgy tűnik, hogy a WST-8 sejtredukciós tulajdonságai nagyon hasonlóak a WST-hez A WST-8 sejt impermeábilis, ezért extracellulárisan redukálódik, az intracelluláris NADH-ból a WST{13}}-ba történő elektrontranszport révén a plazmamembránon keresztül, a 1-metoxi PMS közvetítésével. Bár mind az MTT, mind a WST-8/1-metoxi PMS redukcióját az intracelluláris NADH vezérli, úgy tűnik, hogy a NADH forrása e két módszeren belül különbözik. A WST-8/1-metoxi PMS redukciója nagyobb mértékben függ a malát/aszpartát transzfertől, amely összeköti a mitokondriális trikarbonsavciklust-NADH-t az extramitokondriális térrel [20].

Az előzetes kísérletekben megerősítettük, hogy az 1., 2., 3. és 4. vegyület nem képes közvetlenül redukálni az MTT tetrazólium sót (nincs ábrázolva). Jelen tanulmányban maguknak a vegyületeknek a reagensre gyakorolt ​​közvetlen hatását úgy küszöböltük ki, hogy a mikrolemezeket foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) alaposan megmostuk, mielőtt MTT-t vagy CCK-8-oldatot adtunk hozzá, a gyártói protokollok szerint. Ennek ellenére a két módszerrel kapott eredmények továbbra is ellentmondásosak voltak (2. ábra). Ahogy az várható volt, a sejteknek az 1., 2. és 3. vegyülettel való inkubálása megnövelte a tetrazólium só redukcióját lila formazánná a kontrollcsoporthoz képest (3. ábra), ami arra utal, hogy a tetrazóliumsó puszta redukciója egy adott vegyület jelenlétében. nem elegendő annak megítéléséhez, hogy a vegyület képes-e befolyásolni az MTT vizsgálatot.

Annak meghatározására, hogy az 1., 2., 3. és 4. vegyületek képesek-e apoptózist indukálni az EA.hy926 sejtekben, sejtmorfológiai változásokat és foszfatidil-szerin-externalizációt vizsgáltunk. A sejtek életképességének a CCK-8 vizsgálattal megfigyelt csökkenésével összhangban a Hoechst-festés és az annexin V-FITC/PI-t alkalmazó áramlási citometriás analízis eredményei arra utaltak, hogy az 1., 2. és 3. vegyülettel végzett kezelés után megfigyelt növekedésgátlás legalábbis részben az EA.hy926 sejt apoptózisának köszönhető. Eredményeink is alátámasztották azt az elképzelést, hogy az 1-es és 2-es vegyületben is jelenlévő koffeoilcsoport volt felelős az MTT-vizsgálattal kapott ellentmondásos eredményekért.

Eredményeinkhez hasonlóan a Rottlerin, egy erős, nagy vezetőképességű káliumcsatorna-nyitó, nem mutatott reaktivitást az MTT-vel szemben in vitro. Azonban erősen fokozta a formazánkristályok képződését a sejtekben, ami nyilvánvalóan ellentmond az NF-κB Rottlerin gátlásának és a sejtproliferációnak, amelyet a [3H]-timidin DNS-be való beépülésének elemzésével figyeltek meg [21]. A mechanizmus, amellyel a Rottlerin fokozta az MTT redukcióját, a mitokondriális szétkapcsoló hatásának tulajdonítható [22]. A Rottlerin cinnamoilsav szubsztituens csoporttal rendelkezik. A cinnamoilsavhoz képest a 3. vegyület két további hidroxilcsoportot tartalmaz, amelyek a C-3 és C-4 helyen találhatók. Ezért feltételezzük, hogy az a mechanizmus, amellyel az 1. és 2. vegyületek ellentmondó eredményeket adnak az MTT vizsgálatban, összefüggésbe hozható a mitokondriális szétkapcsoló hatásukkal is. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez összehasonlító vizsgálatokra van szükség az 1., 2. vegyületek és egy kémiai szétválasztó, például trifluor-karbonil-cianid-fenil-hidrazon (FCCP) között.

Kísérleti szakasz

Reagensek és vegyszerek

A 3. vegyületet (kávésav-por, tisztaság=98,6 százalék) a Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd.-től (Chengdu, Kína) vásároltuk. A 4. vegyületet (3, 4-dihidroxi-fenil-etanol–olaj, tisztaság=98,5 százalék) a Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd.-től (Chengdu, Kína) szereztük be. Az MTT-t és a dimetil-szulfoxidot (DMSO) a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be. A CCK{11}} vizsgálatot a Dojin Laboratories-tól (Kumamoto, Japán) vásároltuk. A Hoechst 33342 és az annexin V-FITC/PI apoptózis kimutatására szolgáló készleteket a Beyotime Institute of Biotechnology-tól (Haimen, Kína) vásároltuk.

Növényi anyag

A C. tubulosa szárakat a kínai Xinjiang Ujgur Autonóm Régió Yutian prefektúrájából gyűjtöttük. Az utalványmintákat a Harmadik Katonai Orvostudományi Egyetem (Chongqing, Kína) Kulcslaboratóriumában helyezték letétbe, és Yi Zhang, a Chengdui Hagyományos Kínai Orvostudományi Egyetem (Chengdu, Kína) hitelesítette.

Növényi anyagok kinyerése és izolálása

Légszárított C. tubulosa (0,6 kg) töveket porítottunk, és 50 százalékos etanollal 2 órán át 70 fokon extraháltuk. Az oldószer csökkentett nyomáson történő eltávolítása után a 212,5 g etanolos extraktumot feloldottuk, 2 liter vízben szuszpendáltuk, majd n-butanollal (2 x 3) extraháltuk. A n-butanolos kivonatot (110 g) poliamid oszlopon kromatografáltuk, és etanol/víz (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) eleggyel eluáltuk, így öt frakciót kaptunk (A-E). . A B-frakciót (65 g) ODS-oszlopon frakcionáltuk; etanol:víz (1:9) eleggyel eluálva az 1. vegyületet (3 g) választjuk el. A D frakciót (10,5 g) ODS oszlopon frakcionáltuk; etanol/víz (1:4) eleggyel eluálva a 2. vegyületet (1 g) választjuk el.

Az NMR-spektrumokat Bruker Avance 600 spektrométeren vettük fel CD3OD-ben, belső standardként tetrametil-szilánt (TMS) használva. A tömegspektrumokat BioTOF-Q tömegspektrométeren vettük fel.

Sejtkultúra

Az EA.hy926 sejtvonalakat az American Type Culture Collection-től (Manassas, VA, USA) szereztük be. A sejteket RPMI 1640 tápközegben tenyésztettük, kiegészítve 10% (v/v) magzati szarvasmarha-szérummal és 1% (v/v) penicillin-sztreptomicinnel párásított környezetben, 5% CO2-val 37 °C-on.

Sejt életképesség

A sejtek életképességét az MTT és a CCK{{0}} tesztekkel értékeltük. Az 1. és 2. vegyületet és ezek aglikonjait, a kávésavat (3) és a 3-as 4-dihidroxi-fenil-etanolt (4) DMSO-ban oldottuk fel 0,1% (v/v) alatti végső DMSO-koncentrációig a tápközegben.

Az EA.hy926 sejteket 96-lyuklemezekre oltottuk 4 × 103 sejt/lyuk mennyiségben. 24 órás inkubálás után a sejteket 6,25–50 μM 1., 2., 3. vagy 4. vegyülettel kezeltük 24 órán át. A táptalajt eltávolítottuk, és a sejteket kétszer mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS). Alikvot részeket (10 μL) MTT törzsoldatból (5 mg · ml-1 ) adtunk minden 100 μl táptalajt tartalmazó mérőhelyhez, és 4 órán át inkubáltuk a sejtekkel. Inkubálás után a tápközeget eltávolítottuk, és 150 µl DMSO-t adtunk minden egyes lyukba a formazánkristályok szolubilizálására. Az abszorbanciát 490 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). A sejtek életképességét az MTT csökkenés százalékában fejeztük ki, a 100 százalékos értéket a kontrollsejtek abszorbanciájához rendelve. Minden kísérletet háromszor végeztünk el, és átlag ± standard eltérésként (SD) adtuk meg.

A CCK-8 vizsgálatot a szakirodalmat követve, kis módosításokkal végeztük [23]. Pontosabban, a sejteket 6,25–50 μM 1., 2., 3. vagy 4. vegyülettel kezeltük 24 órán keresztül, és kétszer mostuk PBS-sel, mielőtt hozzáadtunk 10 µl CCK-8 oldatot és 100 µl táptalajt. A mikrolemez 37 fokos 2 órás inkubálása után az abszorbanciát 450 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval. A sejtek életképességét az életképes sejtek arányában fejeztük ki a kontrollsejtekhez viszonyítva (100%). Minden kísérletet háromszor végeztünk, és átlag ± SD-ben fejeztük ki.

Apoptózis értékelése Hoechst 33342 festéssel

Apoptotikus morfológiai változásokat figyeltünk meg Hoechst 33342 festéssel. Röviden, az EA.hy926 sejteket 48-lyukú lemezekre oltottuk (2 × 104 sejt/lyuk), és 50 μM 1., 2., 3. vagy 4. vegyülettel kezeltük 48 órán át 37 fokon, majd kétszer mostuk PBS-sel. és 4%-os (v/v) paraformaldehiddel 15 percig szobahőmérsékleten rögzítjük. Kétszer PBS-sel végzett öblítés után a sejteket Hoechst 33342-vel (10 ug·mL-1) festettük 5 percig szobahőmérsékleten, és kétszer mostuk PBS-sel. A Hoechst-festett sejtmagokat fluoreszcens mikroszkóppal (Olympus, Tokió, Japán) tettük láthatóvá.

Apoptózis elemzés áramlási citometriával

Az apoptotikus sejteket annexin V-FITC/PI kettős festéssel és áramlási citometriás analízissel detektáltuk. Röviden, 50 μM 1., 2., 3. vagy 4. vegyülettel 48 órán át végzett kezelés után a sejteket összegyűjtöttük, és újraszuszpendáltuk PBS-ben 1 × 105 sejt · ml-1 mennyiségben. 500×g-vel 5 percig 25 fokon végzett centrifugálás után 195 µl annexin V-FITC kötőpuffert és 5 µl annexin V-FITC-t adtunk hozzá. Gyengéd vortex-keverés után az elegyet 10 percig szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk. 500×g-vel 5 percig 25 fokon végzett centrifugálás után 190 µl FITC-konjugált annexin V kötőpuffert és 10 µl PI-t adtunk hozzá. Gyengéd örvénykeverés után a mintákat FACSCalibur áramlási citométerrel (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) elemeztük 30 percen belül.

Statisztikai analízis

Minden kísérleti adatot átlag ± SD-ben fejeztünk ki. A kísérleti minták és a megfelelő kontroll közötti különbségek szignifikanciáját az SPSS szoftver (11.5-ös verzió) segítségével egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) értékeltük. A statisztikai szignifikancia értéke p <>

Következtetések

Eredményeink arra utalnak, hogy az életképes sejtek számának az MTT vizsgálatban megfigyelt túlbecslése elfedheti bizonyos vegyületek citotoxicitását. Ezért a gyógyszerszűrési folyamatok során számos módszer alkalmazását javasoljuk az adott vegyület sejtéletképességre gyakorolt ​​hatásának meghatározására (például CCK-8 és 3 H-TdR vizsgálatok), hogy elkerüljük a félrevezető eredményeket.