A kaempferol enyhíti az LD-mitokondriális károsodást az autofágia elősegítésével: A Parkinson-kór következményei 1. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:Az újabb bizonyítékok azt mutatják, hogy a váratlan lipidcseppek (LD) lerakódása és peroxidációja felgyorsíthatja az organellák stresszét, és döntő szerepet játszik a neurodegeneratív betegségek (NDD-k) patogenezisében. Korábbi vizsgálatunkban megerősítettük, hogy a kaempferol (Ka), egy természetes flavonoid kismolekula, neuroprotektív hatást fejtett ki LPS-indukálta Parkinson-kórban (PD) szenvedő egereken. Emellett korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az autofágia fontos szerepet játszik a sejtes LD lerakódás szabályozásában. A jelenlegi tanulmányban kimutattuk, hogy a Ka védelmet nyújtott az MPTP/p-indukált PD egerekben a neuronok elvesztésével és viselkedési hiányosságaival szemben, amelyet a substantia nigra pars compacta (SNpc) csökkent lipidoxidatív stressz kísér. A tenyésztett neuronális sejtekben a Ka viszonylag biztonságos koncentrációtartományt mutatott, és jelentősen elnyomta az LD-felhalmozódást és az MPP plusz által kiváltott sejtes apoptózist. További vizsgálatok azt mutatták, hogy a Ka védő hatása az autofágiától, különösen a lipofagiától függ. Kritikusan a Ka elősegítette az autofágiát, hogy közvetítse az LD lebomlását a lizoszómákban, ami aztán enyhítette a lipidlerakódást és a peroxidációt, valamint az ebből eredő mitokondriális károsodást, következésképpen csökkentve az idegsejtek halálát. Ezenkívül az AAV-shAtg{3}}közvetített Atg5 leütés megszüntette a Ka neuroprotektív hatását a lipidoxidációval szemben PD egerekben. Ez a munka azt bizonyítja, hogy a Ka megakadályozza a dopaminerg neuronális degenerációt PD-ben a lipid-peroxidáció által közvetített mitokondriális károsodás gátlásán keresztül, elősegítve a lipofagiát, és potenciális új terápiás stratégiát kínál a PD és a kapcsolódó NDD-k számára.

További információért kattintson ide

1. Bemutatkozás

A Parkinson-kór (PD) egy gyakori neurodegeneratív betegség (NDD), amelyet kórosan a dopaminerg (DA) neuronok progresszív elvesztése jellemez a substantia nigra pars compactában (SNpc). Bár ennek a betegségnek a pontos etiológiája és természetes lefolyása még nem teljesen tisztázott,számosrendszerszintű folyamatok és diszfunkciók, beleértve a mitokondriális funkciókat, a dopamin homeosztázist, a neuroinflammációt és az autofágiát, szerepet játszanak a PD patogenezisében [1,2]. A legújabb jelentések felfedték, hogy lipidcseppek (LD) kapcsolatosaklipotoxicitásrészt vehet a PD patológiájában [3,4]. Az LD-k rendkívül dinamikus organellumok, amelyek az endoplazmatikus retikulum (ER) membránból emelkednek ki, és általában a semleges lipidraktározás intracelluláris helyeiként szolgálnak [5]. A közelmúltban kimutatták, hogy az LD-k sokkal szélesebb szerepet játszanak, mint a zsírsav (FA) raktározása, és számos betegségben részt vesznek. Például a mieloid sejtek, köztük a makrofágok, leukociták és eozinofilek, LD-ket képeznek válaszul a gyulladásra és a stresszre, az LD-k pedig a gyulladásos citokintermelés és -raktározás helyszínei, és további szerepet játszanak az antigénprezentációban és a kórokozók eltávolításában [6]. Fontos, hogy ateroszklerózisban az LD-ben gazdag habsejtek a betegség minden szakaszában károsak [7].

A Cistanche javíthatja az immunitást

Az LD-ket azonban nem vizsgálták alaposan a központi idegrendszerben (CNS), és kevés írás számol be az LD-k szövettani jelenlétéről az emberi agyszövetben [8,9]. Ennek ellenére az LD-k fontos funkciókat tölthetnek be az agyban, mivel a legújabb tanulmányok megerősítették, hogy a glia aggregált LD-k felgyorsították a neurodegenerációt egy Drosophila modellben [10]. A közelmúltban arról számoltak be, hogy egerekben olajvörös O-pozitív lipiddel terhelt sejtek, köztük neuronok, gliafibrilláris savas fehérje (GFAP) és asztrociták, valamint ionizált kalciumkötő adaptermolekula-1 (IBA{{7}) }) plusz mikroglia, számos agyi régióban jelen vannak, és kimutatták, hogy részt vesznek az életkorral összefüggő folyamatokban [1]. Korábbi munkánk egy PD egérmodellben is kimutatta az LD fokozott felhalmozódását az agyban [12]. Összességében ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy az LD-k részt vehetnek a PD, valamint más NDD-k patogenezisében.

Normális esetben az intracelluláris LD-k lebomlanaklizoszómákés FA-kat szállítanak a mitokondriumokba, hogy alternatív energiaforrásként fogyaszthassák őket tápanyag-kimerülés időszakában [13]. A neuronok azonban kevéssé képesek mitokondriális FA-felhasználásra energiatermeléshez [14]. Ez a tulajdonság különösen érzékenysé teszi a neuronokat az LD felhalmozódására és peroxidációjára. Ezenkívül az LD-k felhalmozódása fokozza az FA oxidációs sebességét, és tartós nyomást gyakorol a mitokondriális elektrontranszport láncra, ami növeli a reaktív oxigénfajták (ROS) termelését az I. és II. elektrontranszport lánc komplexek [15] által az oxidatív stressz felerősítése érdekében. A lipid túlterhelés extramitokondriális források, például nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH) oxidázok és más oxidatív oxidázok ROS-termeléséhez is vezet.enzimek. Az antioxidáns enzimek csökkent expressziójával és a neuronok FA-felhasználásának alacsony kapacitásával kombinálva az LD felhalmozódása közvetíti az oxidatív stresszt, és tovább vezethet a mitokondriális károsodáshoz,lizoszóma diszfunkció, hibás autofágia és a gyulladásos válaszok aktiválódása [6,17]. Hacsak a felhalmozódott LD-k nem gátolhatók vagy eltávolíthatók, a nagyon aktív neuronok patofiziológián mennek keresztül, ami neurodegenerációhoz vezet [17]. A bizonyítékok azt mutatják, hogy a lizoszóma által közvetített katabolikus folyamat, az úgynevezett autofágia kulcsszerepet játszik a sejtes LD homeosztázis fenntartásában több szövetben [17,18]. Részletesebben, az LD-k szelektíven szekvesztrálhatók az autofagoszómákban, és a lizoszómákba juttathatók lebontásra a lizoszómális savas lipázok által, amely folyamat kifejezetten lipofágiaként ismert [19]. Ezért az LD-k megcélzása és autofágiás eltávolítási útvonala új megközelítést jelenthet a neurodegeneráció kezelésében.

A természetes termékek és diétás hatóanyagok mint potenciális NDD-kezelések és stratégiák forrásainak tanulmányozása óriási érdeklődést váltott ki az elmúlt években [20]. A kaempferol (Ka) egy természetes polifenolos kis molekula, amely számos kínai gyógynövényben és étrendi forrásban megtalálható [21]. A Ka antibakteriális, öregedésgátló és immunmoduláló hatást, valamint antioxidáns és neuroprotektív hatást fejt ki [20,22,23]. Korábban arról számoltak be, hogy a Ka in vitro gátolja a BV2 mikrogliasejtek gyulladását [24], és in vivo növeli a DA neuronok ideggyulladással szembeni rezisztenciáját [25]. A Kaon LD-k hatását PD-ben azonban még nem vizsgálták.

Tekintettel az LD-k fontosságára, valamint az LD-k, a mitokondriumok és az autofágia közötti bensőséges kapcsolatra [16], amelyek mind részt vesznek a PD-ben, feltételezzük, hogy a Ka gátolja az LD-peroxidációt és megakadályozza a DA neurodegenerációját PD-ben. Jelen tanulmányunkban kimutattuk, hogy a Ka szignifikánsan védett a neurodegeneráció ellen egér PD modellben az LD felhalmozódás gátlásával. További tanulmányok kimutatták, hogy a Ka autofágiát váltott ki és csökkentette az oxidált LD-k felhalmozódását, hogy enyhítse a mitokondriális diszfunkciót és a mitokondriális ROS (mtROS) termelődését, ezáltal megelőzve az idegsejtek apoptotikus halálát. Az ebben a tanulmányban kapott eredmények segíthetnek a klinikai döntések meghozatalában a természetes Ka molekula NDD-kben, például PD-ben való felhasználásával kapcsolatban.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Kísérleti állatok

A C57BL/6J egereket (hím, 4-hónapos) a Nanjing Medical University Animal Core-tól (Nanjing) szereztük be. Az egereket a Nanjingi Orvostudományi Egyetem Orvostudományi Karának Állattenyésztési Központjában, valamint a Nanjing Drum Tower Hospital állattenyésztési központjában tartották és tenyésztették. 2°C és 12:12 órás világos/sötét ciklus Minden állatkísérletet szigorúan a National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals irányelveinek megfelelően végeztünk.

2.2. Reagensek

MPTP(M0896),3-MA (M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC> 95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 százalék,96 353) az in vitro kísérletekhez a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be. A BODIPY 493/503(D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) a Thermo Fisher Scientific cégtől vásárolt. Állatkísérletekhez a Ka-t 10% DMSO-t 16% SBE- -CD-vel steril sóoldatban tartalmazó oldatban oldottuk fel. A sejtkísérletekhez a Ka-t DMSO-ban (Sigma-Aldrich) és PBS-ben (végső DMSO-koncentráció 0,01%) állítottuk elő, pH 7,4.

2.3. Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) által indukált PD egérmodell indukciója és kezelése

Az MPTP/p-toxicitás PD-modelljében a Ka hatásának értékelése érdekében az egereket (hím, 4-5 hónapos) véletlenszerűen osztottuk a sóoldattal kezelt, MPTP-vel kezelt csoportra, valamint az MPTP plusz Ka-val kezelt csoportokra. csoport, és a Ka egyedül kezelt csoport. Az MPTP-vel kezelt csoportban az egerek krónikus MPTP-t kaptak a korábban leírthoz hasonló protokoll szerint [26]: az MPTP-t sóoldatban oldották fel, és 25 mg/kg-os dózisban szubkután injektálták, majd 250 mg/kg probenecidet (dimetil-szulfoxidban oldva) intraperitoneális (ip) injekció 3,5 naponként 1 órás időközönként 5 héten keresztül. A kontroll egerek sóoldatot és probenecid injekciót kaptak. Az MPTP plusz Ka-val kezelt csoportban az egerek kaptak Ka-t (50 mg/kg, egyetlen injekció/nap a kísérletek során, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Kína) intraperitoneálisan (ip) naponta 3 nappal az MPTP-kezelés előtt és az 5 MPTP felett. injekciós hetek. Egy héttel az utolsó MPTP-injekció után az egereket viselkedési tesztnek vetettük alá, vakon csoportosítva. Ezt követően az összes egeret 40 mg/kg nátrium-pentobarbitállal elaltattuk, és leöltük agyi fehérjék kimutatására és immunhisztokémiára vagy qPCR analízisre.

2.4. In vivo sztereotaxiás sebészet és kísérleti kezelések

A sztereotaxiás műtétet nátrium-pentobarbitál érzéstelenítésben (40 mg/kg, ip) a leírtak szerint [25] végeztük. Az egér Atg5-öt és a kontroll shRNS-t csomagoló vektorokkal (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP) transzfektáltuk, hogy AAV-t hozzunk létre. A mikroinjekcióhoz érzéstelenített egereket sztereotaxiás készülékbe helyezünk. Az 1 μL-es AAV-t üvegelektródával fecskendezték be a DG(AP:-0,3 mm; ML: ±0,13 mm; DV: -0,45 mm) pontra. 0,25 μl/perc sebességgel, majd a tűt még további 2-percig megtartottuk 2 héttel a vírus mikroinjekciója után, az egereket MPTP-indukált PD modellvezetési és (vagy)Ka kezelésnek vetettük alá.

Az Atg5 shRNS-t a Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd.-től szereztük be. Az Atg5 csendhez a primereket az 1. kiegészítő táblázatban mutattuk be.

2.5. Viselkedéselemzés

Egy héttel az MPTP vagy sóoldat utolsó injekciója után a rotarod tesztet és a pólustesztet a korábban leírtak szerint [27] végezték el. A rotarod teszthez az egereket a kísérlet megkezdése előtt két egymást követő napon keresztül napi két kísérletben (6 perc, 12-20 fordulat/perc gyorsított sebességgel) akklimatizáltuk a rotarodhoz. Ezután az egereket 20 fordulat/perc mellett 300 másodpercig teszteltük további 3 egymást követő napon. Az esés késleltetését a Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, Kína) segítségével rögzítettük. A pólusteszthez az egereket fejjel felfelé egy függőleges faoszlop tetejére helyeztük (durva felületű, magassága 50 cm, átmérője 1 cm). Minden egeret hozzászoktattunk a berendezéshez 2 nappal a tesztelés előtt, majd a harmadik napon háromszor teszteltük. Feljegyeztük a teljes időt (T-összesen, amíg az egér négy mancsával elérte a padlót) és az elfordulási időt (T-turn, amíg az egér teljesen lefelé fordítja a fejét). A kísérletet az egércsoportokra vakon vettük minden viselkedési tesztnél, és a tesztet háromszor végeztük el.

2.6. Agymintagyűjtés

Az utolsó viselkedési tesztek után az egereket nátrium-pentobarbitállal (40 mg/kg, ip) érzéstelenítettük. A qPCR, Western blot és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) analízishez a teljes agyat gyorsan kinyertük az állatokból, majd a középagy és a striatum szöveteit gyorsan feldaraboltuk, folyékony nitrogénnel előfagyasztva. Minden mintát -80 fokon tároltunk az elemzésig.

Az immunhisztokémiai analízishez az egereket transzkardiálisan perfundáltuk 4 százalékos paraformaldehiddel (PFA). Az agyakat extraháltuk, utólag fixáltuk, dehidratáltuk, OCT-be ágyaztuk (Tissue-Tek), és az agy sorozatos metszeteit kriometszetek (szeletenként 30 μm) minden teljes rétegen és középagyon keresztül fagyasztó mikrotom segítségével (Leica CM1950, Nussloch, Németország) ). Minden metszetet hat külön sorozatba gyűjtöttünk, és az agyszeleteket 50 százalékos glicerinben tároltuk, és -20 fokon lefagyasztottuk az elemzésig.

A TEM-hez az egereket 2,5% glutáraldehiddel és 2% paraformaldehiddel perfundáltuk a 【12】 leírása szerint. Egy kis adag (<1 mm²）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Immunhisztokémiai elemzés

Az agyszeleteket PBS-ben öblítettük, majd 3 százalékos vízzel 10 percig, majd 1 órán át inkubáltuk 0,3 százalék Triton X-100 PBS-ben, kiegészítve 5 százalék BSA-val. Ezt követően a tárgylemezeket a primer antitestekkel 4 fokon egy éjszakán át inkubáltuk 5% BSA-t tartalmazó PBS-ben 4 fokon egy éjszakán át, majd mostuk és másodlagos antitestekben inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd diaminobenzidinnel (DAB) inkubáltuk vagy DAPI (Life Technologies, Cat P36931) immunfluoreszcens festésként 5 percig. A Nissl festéshez a lemezeket krezilibolya(CV) oldatban (0,1 g krezilibolya, 99 ml H, O és 1% ecetsav 1 ml-ben) egyesítettük. 30 percig szobahőmérsékleten, majd alkohollal és xilollal dehidratáljuk. A képeket megfigyeltük, és a fényképeket Olympus BX52 mikroszkóp alatt rögzítettük (Olympus America Inc., Melville, NY, Egyesült Államok). Az SNpc-ben található TH-pozitív és Nissl-pozitív neuronok összlétszámát szerológiai úton határoztuk meg, optikai frakcionáló módszerrel MicroBrightField Stereo-Investigator szoftverrel (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) elemzés

Az egerek striatális mintáit {{0}},1 M perklórsavval (1 mg szövetek 100 μl perklórsavban) és 0,1 mM EDTA-ban homogenizáltuk, ultrahanggal kezeltük és centrifugáltuk. 20, 000 ford./percnél 30 percig, ahogy azt közölték [27]. Ezután a felülúszó folyadékokat összegyűjtöttük méréshez. A mozgófázis kevert oldat, amely 90 mM egybázisú nátrium-foszfátot, 1,7 mM 1-oktánszulfonsavat, 50 mM citrátot, 50 µM EDTA-t, 10 százalékos acetonitrilt tartalmaz, áramlási sebessége 0,2 ml/perc. Ezzel párhuzamosan a kvantitatív standard görbe kiszámításához dopamin és dihidroxi-fenil-ecetsav (DOPAC) törzsoldatot (Sigma-Aldrich, USA) készítettünk 0,1 M HClO4-ben, majd 10 ul elkészített felülúszót vagy standard oldatot injektáltunk. a mozgófázisba, és ESA Coulochem ⅢI elektrokémiai detektorral (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific) teszteltük.A mintákat mértük és a csúcsokat számszerűsítettük.A monoaminok koncentrációját a standarddal való összehasonlítással kvantifikáltuk ClarityChrom szoftverrel (Knauer, Németország), majd A DA és DOPAC standard görbéjét az 1a és b kiegészítő ábrákon mutatjuk be.

2.8. Sejtkultúrák és kezelések

A mesencephalic primer neurontenyészeteket a korábban leírtak szerint végeztük [12]. Röviden, a C57BL/6 egerek mesencephalis szöveteit a 14/15. embrionális napon (E14/15) óvatosan eltávolítottuk, mechanikusan disszociáltuk, hogy eltávolítsuk a membránokat és a nagy vérereket. majd felboncolták. Ezt követően tripszin-EDTA-val (Amresco, Solon, OH, USA) emésztettük, majd egy 100- μm-es szűrőn átszűrtük, hogy egysejtű szuszpenziót kapjunk. Ezt követően a sejteket poli-L-lizinre szélesztettük. - Előre bevont 12-/24-lyuk lemezek 2,5×10 fokos sejt/ml-ben, amelyek Neurobasal táptalajt (Cat 21103049, GibcoTM, Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) tartalmaznak B27-tel kiegészítve (2% v:v, Cat 17504044, GibcoTM) és penicillin/sztreptomicin (0,5% v:v). A tenyészeteket párás kamrában (37 °C, 5% CO2 inkubátorban) tartottuk. A táptalajt 3 naponta cserélték és a cellák 7-10 napon belül használhatók.

Sejtvonalak: Az SH-SY5Y sejtvonalakat 1% FBS-ben és 1% penicillin/sztreptomicinben tenyésztettük párásított inkubátorban 37 fokos hőmérsékleten és 5% CO2 mellett. A kísérletekben az SH-SY5Y sejteket MPP-vel (200 μM) vagy különböző dózisú Ka-val (0, 3, 30, 60, 100, 300 600 μM) kezeltük 24 órán keresztül. Ka (3, 10, 30, 60 μM, 3 óra) A primed-SH-SY5Y sejteket MPp plusz (400 μM) stimulálták 24 órán keresztül. Ka (30 μM, 3 óra) (vagy anélkül) 3-MA (3 mM, 1 óra) vagy -tokoferollal (50 μM, 1 óra, Sigma-Aldrich, 47783) Az alapozott SH-SH5Y sejteket stimuláltuk MPP plusz (200 μM) 24 órán keresztül.

2.9. Sejtéletképességi CCK8 vizsgálat

A Ka-kezelés megváltozott sejtéletképességét a Cell Counting Kit{0}}(CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA) kimutatta. Röviden, az SHSY5Y sejteket egy 96- lyukú lemezt, majd különböző koncentrációjú Ka (3,30,60,100,300,600 μM)-val kezeljük 24 órán keresztül. Ezután 10 ul CCK-8 reagenst adtunk mindegyik lyukba 4 órán keresztül. Végül az abszorbanciát a Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) 450 nm-en detektáltuk.

2.10.ATP vizsgálat

A celluláris ATP-szinteket ATP Bioluminescence Assay Kit (Beyotime Biotechnology Co., Kína) segítségével detektáltuk a gyártó utasításai szerint. A kezelés után a sejteket lizáltuk, és 12, 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 5 percig 4 fokon. A felülúszót összegyűjtöttük, 20 µl mintához adtunk munkaoldatot (100 µl) a 96-üreges lemezen, és azonnal megmértük a lumineszcenciát egy automata mikrolemez-leolvasóval.Minden minta méréseit fehérjekoncentrációra normalizáltuk.

2.11. Na plus -K -ATPáz vizsgálat

A Na plusz -K plusz -ATPáz méréshez (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Kína) a sejteket ultrahanggal kezeltük, és 6000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 10 percig, hogy a felülúszót megkapják. Na plus -K plusz -ATPáz detektáló reakcióoldatokat adtunk hozzá, és a gyártó utasításai szerint inkubáltuk. Ezután az abszorbanciát 660 nm-en detektáltuk. Az összes minta mérését a fehérjekoncentrációra normalizáltuk.

2.12. Western blot elemzés

A sejteket vagy agyszöveteket RIPA pufferben lizáltuk (50 mM Tris(pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% NP-40 (FNNO021, Thermo), 0,5% nátrium dezoxikolát (D6750, Sigma), 0,1% SDS (74255, Sigma), kiegészítve proteáz- és foszfatáz-gátlókkal (Roche, Shanghai, Kína). A fehérjekoncentrációt a Micro BCA Kit-tel (Beyotime, Shanghai, Kína) határoztuk meg. A {{13 Minden mintából SDS-PAGE-val választottuk el poliakrilamid TGX gélek (Bio-Rad, Hercules, California, USA) segítségével, majd polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra (Millipore, Bedford, MA) vittük át.. Blokkolás után PVDF A membránokat különböző specifikus primer antitestekkel inkubáltuk TBST-ben 4 fokon egy éjszakán át, majd mostuk és megfelelő torma-peroxidázzal (HRP) konjugált másodlagos antitestekkel inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten.Az immunreaktív sávokat tettük láthatóvá és detektáltuk fokozott kemilumineszcencia (ECL) plus detektáló reagenssel (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) és az ImageQuantM LAS 4000 képalkotó rendszer (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) segítségével elemeztük.

2.13. Valós idejű kvantitatív (Q) és reverz transzkripciós (RT)-PCR

A teljes RNS-t az agyszövetekből és a tenyésztett sejtekből Trizol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) extraháltuk. A reverz transzkripciót a TAKARA PrimeScript RT reagenskészlettel (TaKaRa, Japán) végeztük. A valós idejű qPCR-t SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) segítségével végeztük StepOnePlus készülékben (Applied Bio-systems). A primereket a General (Sanghaj, Kína) vásárolta és validálta. A qPCR-hez használt primereket a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza.

2.14. Laktát-dehidrogenáz (LDH) vizsgálat

A gyártó utasításai szerint a sejteket egy 96-lyukú lemezre szélesztettük 5000 sejt/lyuk sebességgel, és a táptalajt összegyűjtöttük az LDH-szintek mérésére egy tesztkészlettel (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Ezután a minták abszorbanciáját a Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) 450 nm-en detektáltuk.

2.15.BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 és MitoTracker mélyvörös festés

Az élő sejteket PBS-sel mostuk, és 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) vagy BODIPY 581/591 C11 (BD-Cl1）(2.{15}} μM) oldattal inkubáltuk. , InvitrogenTM, Cat D3861）PBS-ben 15 percig 37 fokon A MitoTracker Deep Red festéshez az élő sejteket 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) PBS-ben inkubáltuk 30 percig, majd 37 fokon. kétszer mostuk PBS-ben, és 10 percig 3,5 százalékos PFA-ban fixáltuk, majd 10 percig mostuk és ellenfestettük Hoechst 33342-vel (Sigma, Cat B2261), majd lefedtük a lemezekre képalkotás céljából. (Olympus, Tokió, Japán).

2.16. Hoechst és PI festés

A sejteket Hoechst 33 342 (1 ul, 500 ul PBS-ben, Sigma, Cat B2261) és PI (0,1 ul 500 ul PBS-ben hígított, Solarbio, CA11020) hígítással festettük meg. és fluoreszcens mikroszkóppal (Olympus, Tokió, Japán) figyeltük meg.

2.17. Áramlási citometria

A sejteket emésztettük és D-hank-kal öblítettük, majd 5 µl Annexin V-FITC-vel (5 µl, 5{4}}0 ul PBS)/PI-ben (0,1 µl, 500 ul PBS-ben hígítva) megfestettük apoptózis kittel (CA1020, Solarbio, Peking, Chian) a gyártó protokollja szerint. Ezt követően az apoptotikus sejteket áramlási citometriával (guava easyCyteTM 8, Millipore, USA) elemeztük. A mitokondriális ROS és a mitokondriális membránpotenciál méréseket a 【12】 közzététel szerint végeztük. Az SH-SY5Y sejteket MitoSOX-szal (2,5 μM, Invitrogen, USA) vagy Jul-val (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA) festettük 37 fokon 30 percig. Kétszer PBS-sel történő mosás után a sejteket 1% FBS-t tartalmazó hideg PBS-ben újraszuszpendáltuk áramlási citometriás elemzésekhez. Az adatokat az FCS Express szoftverrel (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, USA) elemeztük.

2.18. Csikóhal légzési tesztjei

Élő SH-SY5Y sejtekben a mitokondriális légzésfunkciót Seahorse extracelluláris fluxus (XFe96) analizátorral (Agi-lent, Santa Clara, USA) mértük az oxigénfogyasztási ráta (OCR) változása révén. SH-SY5Y sejtek 3×103-nál. A sejteket/lyukakat hagytuk tapadni a Seahorse sejttenyésztő lemezekhez, és a kísérlet idejére megközelítőleg 80%-os összefolyást érnek el. A következő napon a sejteket előkezeltük Ka-val, majd további 24 órán át MPp plusznak tettük ki. Az OCR-t alapkörülmények között detektáltuk, majd egymás után 1 μM oligomicint, 1 μM FCCP-t, valamint 1 μM rotenont és antimycin A-t adtunk hozzá.

2.19. Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM formában adtuk meg. A különbség szignifikanciáját a Student-féle t-próba, a kétirányú varianciaanalízis vagy az egytényezős varianciaanalízis (ANOVA), majd Tukey-féle post hoc teszt követte. A különbséget szignifikánsnak tekintették P<>

3. Eredmények

Eredmény 1. A Ka helyreállítja a motoros diszfunkciót és növeli a dopaminszintet az MPTP/p PD modell egerek striatumában

A Kaon PD patogenezisének neuroprotektív hatásának vizsgálatára 4-hónapos hím C57BL/6 egereket injektáltunk MPTP neurotoxinnal, hogy létrehozzuk az MPTP/p PD modellt, és Ka-val kezeljük őket (la ábra). A modellindukciót követően a rotarod tesztet és a pólustesztet használtuk az egerek motoros és viselkedési teljesítményének értékelésére a különböző csoportokban. Amint látható, a rotarod teljesítményének ideje jelentősen csökkent az MPTP-vel kezelt egerekben, és ezt a hatást a Ka megakadályozta (1b. ábra). Ka helyreállította az MPTP által kiváltott viselkedési hiányosságokat, amint azt a pólustesztben a fordulási idő és a teljes idő csökkenése jelzi (lc. és d. ábra), anélkül, hogy befolyásolta volna az egerek testtömegét (le ábra). Továbbá a HPLC analízis azt mutatta, hogy a dopamin szintje a striatumban szignifikánsan csökkent MPTP/p-vel kiváltott egerekben, és ezt a szintet a Ka-kezelés helyreállította (1f. ábra. A Ka-kezelés szintén enyhítette az MPTP/p által kiváltott dihidroxi-csökkenést -fenil-ecetsav (DOPAC, a dopamin metabolitja) szintje a striatumban (1g. ábra) Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Ka helyreállítja a motoros diszfunkciót és növeli a dopaminszintet a striatumban MPTP-indukált PD egerekben.

2. eredmény: A Ka enyhíti a DA neuronok elvesztését MPTP/p PD modell egerek SNpc-jében

Ezt követően a Kaon MPTP/p által kiváltott DA neuronális károsodásának neuroprotektív hatásának további értékelése érdekében a tirozin-hidroxilázt (THD plusz neuronok az egér SNpc-ben immunfestéssel) vizsgáltuk. Amint a 2a és b ábrákon látható, az MPTP/p szignifikáns csökkenést indukált a TH plusz neuronok számában, amit a Ka-kezelés csökkentett, továbbá az SNpc-ben lévő összes neuron sztereológiai száma Nissl szerint

1. ábra. A Ka-kezelés enyhíti a motoros diszfunkciót és növeli a dopaminszintet az MPTP/p PD modell egerek striatumában.

(a) A kísérleti terv sematikus diagramja. (b) A rúdon töltött időt három egymást követő napon mértük a rotarod teszthez. (cd) A rúdteszthez feljegyeztük a megfordulás (fordulás ideje) és a rúdon való leereszkedés idejét (mászás ideje). (e) A vizsgálat végén megmértük az egerek testtömegét. (fg) A dopamint (DA) és a dihidroxi-fenil-ecetsavat (DOPAC) a striatumban nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával elemezték. Az adatok átlag ± SEM.n =9-10 a (b,c,d); n =6-8 minden csoporthoz (f, g).ns-ben, nem szignifikáns, *P<><><0.001,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

festést, igazolta, hogy a TH-sejtek elvesztése a sejthalált tükrözi, de nem a TH-expresszió csökkenését, és kimutatta, hogy a Ka-kezelés visszaállította a Nissl-pozitív neuronok számának csökkenését MPTP-kezelt egerek SNpc-jében 43,3 százalékról 25,4 százalékra. 2c. és d. ábra. Ezenkívül a Ka szignifikánsan javította a TH- és DAT-fehérje-expresszió MPTP-indukálta csökkenését, Western-blottal mérve (2e-g. ábra). Ez a bizonyíték megerősíti a Ka neuroprotektív hatását a PD egérmodellre.

3. eredmény: A Ka csökkenti az LD vakuolák felhalmozódását és az oxidatív stresszt az MPTP/p-vel kezelt egerek SNpc-jében

Egyre több bizonyíték támasztja alá az LD-k szerepét az NDD-kben[10], és korábbi munkáink következetesen megnövekedett LD-értékeket azonosítottak az MPTP-indukált PD egerek SNpc-jében[12]. Az LD-k könnyen azonosíthatók, és kerek, kis sűrűségű struktúrákat mutatnak homogén amorf tartalommal [28]. Normális esetben az LD-k autofágiával lebonthatók a felhalmozódás elkerülése érdekében [29]. Annak vizsgálatára, hogy a Ka szabályozhatja-e az LD-ket PD-ben, transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) elemeztük az LD-k felhalmozódását a kontroll, MPTP/p és MPTP/p plusz Ka egerek SNpc-jében. Amint azt korábbi munkánkból [12] mutattuk, az LD-k száma és mérete nőtt MPTP/p egerekben a sóoldattal kezelt kontrollokhoz képest (3a. és b. ábra), és jelentősen csökkent a Ka-val kezelt egerekben (3c. ábra). e). Ezenkívül a Ka-kezelt egerekben az LD-ket gyakrabban figyelték meg az autolizoszómák közelében, azokba zárva vagy lebontva, amelyeket elektronsűrű lipofuscin granulátumként határoztak meg. A TH* neuronok további szövettani festése BODIPY-val, egy olyan festékkel, amely specifikusan jelöli a semleges lipideket, és általánosan használt LD-k kimutatására [30], azt mutatta, hogy a BODIPY LD-k száma és mérete az SNpc-ben magasabb volt PD egerekben, mint a kontrollokban. és szignifikánsan csökkent a Ka-kezelés (3f-h ábra).

Ha az LD-ket nem lehet időben lebontani, a felhalmozódott LD-k peroxidáción eshetnek át, és hozzájárulhatnak a mitokondriális ROS által közvetített stresszhez [4], ami felerősíti a neurotoxicitást és a betegség progresszióját. Ezért tovább vizsgáltuk a szabad FA toxicitás (Gpx8), a semlegesítő oxidatív fajok, a szuperoxid gyökök (Sod3) és a hidrogén-peroxid (Cat) és az FA metabolizmus (Acsbg1 és Dbi) elleni védelemmel kapcsolatos gének expressziós profilját, ahogyan azt közölték [31] , amelyek mindegyike feltűnően csökkent az MPTP-vel kezelt egerek SNpc-jében a kontrollokhoz képest, és ezek a hatások javultak a Ka-val kezelt PD egerekben (3i. ábra). Hasonlóképpen, az MPTP/p is növelte az mRNS expressziós szintjét

2. ábra. A Ka javítja a DA neuronok elvesztését MPTP/p PD modell egerek SNpc-jében.

(ab) A tirozin-hidroxiláz(TH)-pozitív neuronok mikrofotói (a) és a TH-pozitív neuronok sztereológiai száma a substantia nigra pars compacta-ban (SNpc)(b). A léptékek a jelzettek szerint vannak.(cd) Krezilibolya mikrofényképek -pozitív sejtek(c) és a krezilibolya-pozitív sejtek sztereológiai száma az SNpc(d)-ben. Skálasáv, 120 μm. (pl.) Western blot analízis a TH és DAT fehérje expressziójáról az SNpc-ben (e) és kvantitatív analízis (f,g). A számszerűsített adatokat a sóoldat-kontrollcsoportra normalizáljuk. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki.*P<0.05,><0.01,by one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine..(for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.)="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" noxl,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

4. eredmény: A Ka megvédi az SH-SY5Y sejteket az MPP plusz által kiváltott apoptózissal szemben

Az MPP plus, az MPTP aktív metabolitja gátolja a mitokondriális komplex enzimeket, és a PD-vel közvetlenül összefüggő sejthalált okoz[32]. Ezt követően azt vizsgáltuk, hogy a Ka képes-e megakadályozni az MPP plusz által kiváltott neuronális apoptózist in vitro. Ahogy a 4a. és b. ábrán látható, az MPPt (400 μM, 24 óra) indukálta az LDH felszabadulását az SH-SY5Y sejtekből, a Ka (30 és 60 μM) pedig jelentősen gyengítette az LDH felszabadulását anélkül, hogy befolyásolta volna a sejtek túlélését (4a. ábra). Mivel a Ka 30 μM koncentrációban jelentős védőhatást váltott ki (4b. ábra), ezt a koncentrációt alkalmaztuk a következő kísérletekben A Hoechst/PI festési eredmények azt is mutatták, hogy a Ka jelentősen csökkentette az MPP plusz által kiváltott kromatinkondenzációval rendelkező sejtek százalékos arányát (4c. és d. ábra) és celluláris apoptózis, amint azt a megnövekedett Hoechst fluoreszcencia intenzitás (4c. ábra) és a Hoechst/PI-vel festett sejtek százalékos aránya (Hoechst plus /PI plus ) (4e. ábra) bizonyítja. áramlási citometriával kimutatható, az MPPt által indukált sejt apoptózis, amit az annexin V-vel festett sejtek (AV plusz /PI- és AV plusz /Prt) megnövekedett százalékos aránya bizonyít, védte a Ka-val (4f. és g. ábra). Ezenkívül a Ka jelentősen megfordult Az MPP plusz által kiváltott változások az apoptózissal összefüggő fehérje expressziójában, amint azt a B növekedése bizonyítja cl-2, a Bax leszabályozása (4hi-j ábra), és a kaszpáz-3 csökkent hasadása (4h, k ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a Ka megszüntetheti az MPp plus káros hatásait a sejtek túlélésére.

Eredmény 5. A Ka elnyomja az MPp plusz által indukált LD felhalmozódást és lipidperoxidációt, amelyek közvetítik a mitokondriális károsodást az SH-SY5Y sejtekben

A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a váratlan LD-felhalmozódás fokozhatja a lipid-peroxidáció által közvetített stresszt, és felgyorsíthatja a mitokondriális diszfunkciót, ami elősegíti a neurodegenerációt [10]. Korábbi munkánk azt is kimutatta, hogy az SNpc-ben megnövekedett LD-k összefüggést mutatnak a PD-patológiával egerekben [12]. Annak vizsgálatára, hogy a Ka védő hatása összefüggésben van-e az LD-felhalmozódással in vitro, először LD-specifikus festést végeztünk SH-SY5Y sejtekben BODIPY 493/503 segítségével, és megfigyeltük a megnövekedett LD-lerakódást (a semleges lipidek fokozott szintje).

3. ábra. A Ka csökkentette az elektronsűrű LD vakuolák felhalmozódását és a lipidoxidációt az MPTP/p-vel kezelt egerek SNpc-jében.

(ac) Reprezentatív EM-képek, amelyek elektronfényes vakuolákat (lipidcseppeket), autolizoszómákat (ALS) tartalmazó elektronsűrű autofág vakuolákat vagy lipofuscin tartalmú lizoszómákat (Lys) mutatnak sóoldattal kezelt egerek SNpc-jében (a), MPTP/p (b) és MPTP/p plusz Ka (c). Skálasávok, 500 nm. Az(a,b)-vel, amint azt korábbi munkánkban jeleztük (PMID:29967574). (de) Az elektronfényes LD vakuolák mennyiségi meghatározása neurononként az SNpc-ben a jelzett egerekben. n =3 egér, 10-12 neuron csoportonként. (fh) Sóoldattal, MPTP/p- és MPTP/p plusz Ka-val kezelt egerek középső agymetszeteit megfestettük BODIPY (LD) és TH (DA) neuronokra. A jobb szélső panelek a BODIPY plusz TH plusz neuronok nagyításait mutatják. A nyilak jelzik az LD-ket.(gh), a BODIPY mennyiségi meghatározása, valamint az LD száma és mérete. (ii) Elemezték az FFA toxicitással kapcsolatos gének (Gpx8, Sod3, Gat, Acsbg1 és Dbi) (i) és az oxidatív stressz gének (Nox1, Nox2 és Nox4) (j) mRNS expresszióját a jelzett egerek SNpc-jében valós idejű qPCR.n=4-5 csoportonként, három független kísérlet. Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki; ns, nem szignifikáns, *P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" ka,="" kaempferol;="" mptp,="">

Ez a cikk innen származikhttps://doi.org/10.1016/j.redox.2021.1019112020. november 23-án érkezett