Miért segítheti elő a Retinoic Acid Receptor Responder1 a glomeruláris betegségek kialakulását?

A Retinoinsav Receptor Responder1 elősegíti a glomeruláris betegségek kialakulását a nukleáris faktor-kB jelátviteli útvonalon keresztül

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katja Mo¨ller-Hackbarth1,2, Dina Dabaghie1,2, Emmanuelle Charrin1,2, Sonia Zambrano1,2, Guillem Genove´ 1,3, Xidan Li1,3, Annika Wernerson4, Mark Lal5 és Jaakko Patrakka1,2

1 KI/AZ Integrált Cardio Metabolic Centre, Karolinska Institutet at Karolinska University Hospital, Huddinge, Stockholm, Svédország; 2 Laboratóriumi Orvostudományi Osztály, Patológiai Osztály, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, Huddinge, Stockholm, Svédország; 3 Huddinge Orvostudományi Osztály, Karolinska Egyetemi Kórház Karolinska Intézete, Huddinge, Stockholm, Svédország; 4 Klinikai Tudományok, Beavatkozási és Technológiai Osztály, Vesegyógyászati ​​Osztály, Karolinska Institutet, Stockholm, Svédország; és 5 Bioscience Renal, Research and Early Development Cardiovascular, Renal and Metabolism (CVRM), K+F Biopharmaceuticals, AstraZeneca, Göteborg, Svédország

Kidney International (2021) 100, 809–823; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.05.036

Copyright ª 2021, International Society of Nephrology. Kiadó: Elsevier Inc. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk a CC BY licenc alatt

Levelezés: Jaakko Patrakka, Laboratóriumi Orvostudományi Osztály, Patológiai Osztály, Karolinska Institutet, Blickagången 6, SE-141 57 Huddinge, Svédország. E-mail: jaakko.patrakka@ki.se 2020. július 27-én érkezett; felülvizsgálva 2021. május 11-én; elfogadva 2021. május 20-án; online közzététel: 2021. június 18

KULCSSZAVAK: glomerulárisendoteliális sejt; NF-kB; podocita; Ritkaságok1

A legtöbb esetben a gyulladásos utak aktiválódnakglomeruláris betegségekde a veseszövetben ezeket mozgató molekuláris mechanizmusok kevéssé ismertek. Azonosítottukretinsavreceptor válaszadó 1 (Rarres1), mint podocitában erősen dús fehérje egészséges vesékben. A podocita-specifikus knockout állatokon végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a Rarres1-re nincs szükség a glomerulus filtrációs gát normális fejlődéséhez vagy fenntartásához, és nem modulálta a vesebetegség kimenetelét a glomerulonephritis modelljében. Érdekes módon kimutattuk a Rarres1 expresszió indukcióját glomeruláris és peritubuláris kapilláris endothel sejtekben IgA-ban és diabéteszes vesebetegségben, valamint ANCA-asszociált vasculitisben. A nyilvánosan elérhető RNS adatkészletek elemzése azt mutatta, hogy a Rarres1 expresszió indukciója gyakori molekuláris mechanizmus volt krónikus vesebetegségekben. Egy feltételesen beütő egérvonal, amely a Rarres1-et kifejezetten endothelsejtekben expresszálta, nem mutatott semmilyen nyilvánvaló vese fenotípust. A túlzott expresszió azonban elősegítette a vesekárosodás progresszióját a glomerulonephritis modelljében. Ezzel összhangban a feltételes knock-out egerek, amelyekből hiányzik az endothelsejtekből a Rarres1, részben védettek voltak a betegségmodellben. Mechanikailag a Rarres1 elősegítette a gyulladást és a fifibrózist a transzkripciós faktor Nuclear Factor-kB jelátviteli útvonalon keresztül az Axl receptor tirozin kináz aktiválásával. Így a Rarres1 expressziójának indukálása az endothel sejtekben egy elterjedt molekuláris mechanizmus a humán glomerulopathiákban, és úgy tűnik, hogy ennek patogén szerepe van a gyulladás és fifibrózis kiváltásában a Nuclear Factor-KB jelátviteli útvonalon keresztül.

Fordítási nyilatkozat

Azonosítottuk a felszabályozástretinsavreceptor válaszadó protein 1 (Rarres1) a közönséges humán glomerulopathiák endothel sejtjeiben (EC). Úgy tűnik, hogy az indukciónak kórokozó szerepe vanglomeruláris betegségmivel a glomerulonephritis progressziója (i) súlyosbodott olyan egérben, amely kifejezetten EC-ben túlzottan expresszálta a Rarres1-et, és (ii) javult az EC-specifikus Rarres1 kiütési vonal. A Rarres1 biomarker lehet a vesebetegségek mikrovaszkuláris károsodásának kimutatására, és potenciálisan új terápiás célpont lehet.

Glomeruláris betegségfolyamatok a végstádiumú vesebetegség egyik fő oka. A diabéteszes nephropathia (DN) világszerte a végstádiumú vesebetegség leggyakoribb oka, míg az IgA nephropathia (IgAN) a legelterjedtebb primer glomerulonephritis (GN). divat. Ez magában foglalja a glomeruláris endoteliális sejtek (GEC) aktiválását, az extracelluláris mátrix expanzióját, a mezangiális sejtek proliferációját, a podocita károsodását és végül a podocita elvesztését.

A humán vesebiopsziákon végzett globális transzkriptumprofilozó vizsgálatok erős gyulladásos jelet mutattak a glomeruláris rendellenességekben,4–7, az egérrel végzett vizsgálatok pedig azt, hogy a nukleáris faktor-kB (NF-kB) és a transzformáló növekedési faktor-b (TGF-b) aktiválása A jelátviteli útvonalak fontos szerepet játszanak a betegség progressziójában.8,9 Fontos, hogy az NF-kB útvonal gyógyszerészeti célba juttatása renoprotektív hatást fejt ki állatmodellekben, ami azt jelzi, hogy az útvonal potenciális célpont a kezelésre.glomeruláris betegségek.10,11 Podocitákban a közelmúltban azonosítottuk a G-fehérjéhez kapcsolt, C osztályú, 5. csoport B tagját, mint az NF-kB által közvetített gyulladásos válasz modulátorát.12 A glomerulopathiákban a gyulladásos folyamatok aktiválódását azonban valószínűleg több sejttípus is vezérli. . Valójában az NF-kB jelátviteli útvonal aktiválódása számos humán vesebetegségben kimutatható GEC-ben.13,14 A GEC-ekben az NF-kB aktiválásában szerepet játszó molekuláris mechanizmusok kevéssé ismertek.

A Retinoic Acid Receptor Responder1 elősegítheti a fejlődéstGlomeruláris betegségek

Ebben a tanulmányban az emberi molekuláris aláírásokat elemeztükglomeruláris betegségekés azonosította az indukciótretinsavreceptor válaszadó 1 (Rarres1) expressziója a GEC-ekben, mint gyakori molekuláris aláírás a DN, IgAN és anti-neutrofil citoplazmatikus autoantitest (ANCA)-asszociált vasculitisben. A Rarres1 expressziót aktiváló/inaktivált egérvonalakon végzett vizsgálatok endoteliális sejtekben (ECs) azt mutatják, hogy ennek az indukciónak patogén szerepe van a GN egérmodelljében. Mechanikailag a Rarres1 aktiválja az Axl receptor tirozin kinázt, ami az NF-kB jelátviteli útvonal aktiválásához vezet. A Rarres1-et a mikrovaszkuláris károsodás új biomarkereként javasoljuk, amely vonzó terápiás célpont lehetglomeruláris betegségfolyamatokat a gyulladásos válaszok modulálásával.

1. ábra|(Folytatás) (c) BackSPIN analízis, amely a Rarres1 expresszióját specifikusan podocitákban (PD) mutatja rágcsáló veseszövet RNAseq adataiban (Woroniecka et al.6 adatai). (d) A Rarres1 relatív mRNS-szintje humán mintákból izolált Tub-ban és Glom-ban. Az adatokat a Rarres1 expressziójának többszörös változásaként fejezzük ki a Glom-ban a Tub-hoz képest. *P < 0.05="" kontra="" tub.="" (e)="" a="" rarres1="" expressziójának="" reprezentatív="" konfokális="" fl="" fluoreszcens="" mikroszkópos="" képe="" (zöld)="" podociták="" által="" normál="" alanyokból="" származó="" emberi="" glomerulusokban.="" (f)="" reprezentatív="" konfokális="" mikroszkópos="" képek,="" amelyek="" a="" rarres1="" expresszióját="" mutatják="" humán="" alanyokból="" származó="" podocitákban;="" a="" vimentint="" a="" főbb="" folyamatok,="" a="" nefrint="" pedig="" a="" podociták="" lábfolyamatainak="" markereként="" használták.="" a="" cd31-et="" endoteliális="" sejtek="" markereként,="" a="" simaizom="" aktint="" (⍺sma)="" pedig="" mezangiális="" sejtmarkerként="" használták.="" rudak="50/10" mm.="" az="" adatokat="" átlag="" ±="" sem-ben="" fejezzük="" ki.="" a="" diák="" t-próbáját="" két="" csoport="" összehasonlítására="" alkalmaztuk.="" a="" kép="" megtekintésének="" optimalizálásához="" tekintse="" meg="" a="" cikk="" online="" változatát="" a="" www.kidney-international.org="">

MÓD

RNS extrakció és valós idejű polimeráz láncreakció

A glomerulusokat a korábban leírtak szerint izoláltuk.15 RNS-t TRIzol reagens (Invitrogen) és RNeasy Kit (Qiagen Inc.) segítségével extraháltunk. Az iScript cDNS szintézis készletet használtuk a cDNS előállításához. A kvantitatív polimeráz láncreakciót a CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System és SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) segítségével végeztük. A felhasznált primerek az S1 kiegészítő táblázatban vannak felsorolva. A relatív expressziós szinteket a 2-DDCT módszerrel számítottuk ki.

Sejttenyésztés

Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1[ORF011242]:T2A: Bsd – plazmid (VectorBuilder Inc. A klónok a puromicin (Merck KGaA) szelekció hatására szaporodtak. Az Axl/Rarres1-hez rövid interferáló RNS (siRNS) transzfekcióját Origene-ből származó siRNS-sel végeztük. A sejteket M3-mal transzfektáltuk siRNS, majd komplexképzés JetPEI transzfekciós reagenssel (Polyplus-transfection SA) TGF-b1 stimulussal vagy anélkül (10 ng/ml tápközegben) Az Axl-inhibitor R428 (Selleck Chemicals) 1 órával a kezelés előtt került hozzáadásra (3 mmol/). l).

Miért segítheti elő a Retinoic Acid Receptor Responder1 a fejlődésétGlomeruláris betegségek?

Western blot

A sejteket proteáz/foszfatáz gátló koktélokkal (Roche) kiegészített RIPA lízispufferrel lizáltuk. A nukleáris frakciókból származó fehérjéket Nuclear Extract Kit (Active Motif Europe) segítségével izoláltuk. A lizátumokat 4%-12%-os trisz-glicin-nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélen (Invitrogen) választottuk el, és polivinilidén-difluorid membránokra (Bio-Rad) vittük át. A membránokat 5 százalékos szarvasmarha-szérumalbuminnal (Merck) blokkoltuk. Az elsődleges antitestekkel való inkubációt egy éjszakán át végeztük (az antitestek az S2 kiegészítő táblázatban). Torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesteket és Clarity Western ECL szubsztrátot (Bio-Rad) használtunk a jelek kimutatására. Western blot analízist legalább kétszer végeztünk.

RNS in situ hibridizáció

Az RNAscope elemzéseket paraffinba ágyazott emberi vesékben végeztük a gyártó protokollja (ACD) szerint. A használt szondák az NPHS1 - Cat No. 416071-C2, PECAM1 - Cat No. 487381-C3, és a RARRES1 - testreszabott szonda célzó nukleotidjai voltak {{8 }}.

A vesekárosodás értékelése

A vizelet albumin és kreatinin arányát a Mouse Albumin ELISA Kit (Allbuwell M; Ethos Biosciences) és a QuantiChrom Creatinine Assay Kit (BioAssay Systems) segítségével értékelték ki. A veseszöveteket 10%-os semleges pufferolt formalinoldatban fixáltuk, és paraffinba ágyaztuk, majd vágást és periodikus sav-Schiff-festést végeztünk. Az elektronmikroszkópos vizsgálatot 2,5 százalékos glutáraldehidben fixált mintákon végeztük.

Immunfestések

A paraffinba ágyazott szöveteket 24 órán keresztül formalinban rögzítettük. Az 5 mikrométeres metszeteket paraffinmentesítettük és mikrohullámú sütőben kezeltük Trisz-etilén-diamin-tetraecetsav pufferben (10 mM Tris bázis, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav pufferoldat, 0.05 százalék Tween 20, pH 9.0) vagy nátrium-citrát puffer (10 mM nátrium-citrát, 0,05% Tween 20, pH 6,0), majd permeabilizálás 0,3% Triton X-100-el és blokkolt 10 százalék normál kecskeszérummal, 3 százalék hidrogén-peroxidázzal és a Vector Blocking Kit-tel (Vector Laboratories). A tárgylemezeket a DAB-peroxidáz (torma-peroxidáz) szubsztrátkészlet, a 3,30 -diaminobenzidin (Vector Laboratories) segítségével fejlesztettük ki.

A fagyasztott metszeteknél az acetonnal rögzített metszeteket 0,1 százalék Tween 20-zal permeabilizáltuk, és 10 százalék normál kecskeszérummal blokkoltuk. A felhasznált elsődleges antitestek az S1 kiegészítő táblázatban vannak felsorolva. Az immunfluoreszcenciához szükséges Alexa-Fluor másodlagos antitesteket a Molecular Probes (Life Technologies) cégtől szereztük be. A képeket Leica SP8 konfokális mikroszkóppal (Leica Microsystems) készítettük.

Emberi minták

A vesebiopsziákat a Karolinska Egyetemi Kórháztól (Stockholm, Svédország) vettük. A kontrollmintákat olyan egyének egészséges vesepólusaiból vettük, akiknél daganatos nefrektómiát végeztek. A helyi etikai bizottság jóváhagyta a tanulmányt (jóváhagyási szám: 2010/579-31/1, Stockholm, Svédország).

kontra kontroll (Ctrl.) vagy ***P < {{0}}.001="" kontra="" si-negatív="" kontroll="" (scramble)="" (rarres1,="" n="6" sirarres1,="" n="4)." (c)="" reprezentatív="" western="" blot="" dokumentumok="" és="" összefoglalt="" adatok,="" amelyek="" a="" pp65="" relatív="" fehérjeszintjét="" mutatják="" 10="" ng/ml="" tgf-b1-gyel="" kezelt="" podociták="" izolált="" magfrakcióiban.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{40}}.001="" kontra="" kontroll="" podociták="" (ctrl.="" )="" (n="3)." (d)="" reprezentatív="" western="" blot="" dokumentumok="" és="" összefoglalt="" adatok,="" amelyek="" a="" pp65="" relatív="" fehérjeszintjét="" mutatják="" 10="" ng/ml="" tgf-b1="" ±3="" mmol/l="" r428-cal="" kezelt="" podociták="" izolált="" sejtmag="" frakcióiban,="" n="2." (e)="" reprezentatív="" western="" blot,="" amely="" azt="" mutatja,="" hogy="" a="" rarres1="" túlzott="" expressziója="" konstitutívan="" aktiválja="" az="" axl-t.="" *p="">< 0,05="" (n="2)." (f)="" az="" emt-vel="" rokon="" gének="" relatív="" mrns-szintje="" a="" rarres1-et="" (rarres1)="" túlzottan="" expresszáló="" podocitákban="" (rarres1)="" vagy="" a="" kontroll="" podocitákat="" (ctrl.)="" axl-hez="" sirns-sel="" transzfektált="" (siaxl),="" si-negatív="" kontroll="" (scramble),="" ##p="">< 0,01,="" ##="" #p="">< 0,001="" a="" scramble-hez="" képest,="" n="3," vagy="" 3="" mmol/l="" r428-cal="" kezelve.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" versus="" ctrl.,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" versus="" rarres1,="" *p="">< 0,05="" versus="" rarres1,="" n="4." az="" adatokat="" átlag="" ±="" sd-ben="" fejezzük="" ki.="" a="" két="" csoport="" összehasonlítására="" student-féle="" t-tesztet="" alkalmaztunk.="" ut,="">

3. ábra|Podocita-specifikus Rarres1 knockout (CreD/Rarres1flfl/flfl) egerek létrehozása. (a) Feltételes knockout egerek generálása, amelyekben a Rarres1 specifikusan ablált podocitákban a Cre-LoxP rekombinációs rendszer segítségével. A 3. exon törlődik az NPHS2-Cre által közvetített rekombináció során. (b) A genotipizálást farokpreparációval és polimeráz láncreakcióval igazoltuk 4 hetes korban. (Folytatás)

3. ábra|(Folytatás) (c) Reprezentatív Western blot, amely a Rarres1 csökkent expresszióját mutatja podocita-specifikus Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) egerek izolált glomerulusaiban. (d) A Rarres1 podocita-specifikus elvesztése nem befolyásolja az albuminuria szintjét nefrotoxikus szérummal (NTS) kezelt egerekben, a vizelet albumin-kreatinin aránya alapján különböző egércsoportokban (NTS-ctrl., n {{1{{) 15}}}}–7; NTS-Rarres1_cKO, n - 7). (e) Fényképek és mennyiségi meghatározások, amelyek a glomeruláris szerkezet tipikus változásait mutatják különböző egércsoportokban. A glomeruláris elváltozásokat a periodikus sav-Schiff-festett metszetekben azonosították. #P < 0.0001="" kontra="" kezeletlen="" kontroll="" (ctrl.)="" (ctrl.,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl.,="" n="" -="" 9;="" nts-rarres1_cko,="" n="9)." (f)="" reprezentatív="" fotomikroszkópos="" felvételek="" és="" a="" glomeruláris="" alapmembrán="" (gbm)="" átlagos="" vastagságának="" és="" a="" rések="" számának="" a="" gbm-re="" jutó="" száma="" különböző="" egércsoportokban="" transzmissziós="" elektronmikroszkópos="" elemzésekkel.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001,="" ####p="">< 0,0001="" szemben="" a="" kezeletlen="" kontrollal="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ctrl.,="" n="4;" nts-rarres{="" {33}}cko,="" n="6)." az="" adatokat="" átlag="" ±="" sem-ben="" fejezzük="" ki.="" a="" 3="" vagy="" több="" fős="" csoportok="" esetében="" egyutas="" varianciaanalízist,="" majd="" tukey="" utótesztjét="" alkalmaztuk="" a="" többszörös="" összehasonlításhoz.="" a="" kép="" megtekintésének="" optimalizálásához="" tekintse="" meg="" a="" cikk="" online="" változatát="" a="" www.kidney-international.org="">

Egérvonalak

A C57Bl/6J hátterű Floxed Rarres1 egerek (Rarres1flfl/flfl; Cyagen) podocin (B6.Cg-Tg [NPHS2-cre] 295Lbh/J; Jackson Laboratory) és Tie2 cre egerek (B6.Cg-Tg() Tek-cre)12Flv/J) sejtspecifikus knockout egerek létrehozásához. A GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J egereket Tie2-cre vonallal keresztezték, hogy aktiválják a Rarres1 expresszióját specifikusan EC-ben.17 A tenyésztés és a genotipizálás a szabvány szerint történt. eljárások. Minden állatkísérletet a Preklinikai Laboratóriumban (Karolinska Institutet) végeztek a vonatkozó irányelvek és előírások szerint, és jóváhagyták a Kutatóállat-gondozás Etikai Bizottsága (Linköpings djurförsöksestiska nämd; DNR 1336).

Nefrotoxikus szérum (NTS) által kiváltott nefropátia egerekben

Hét-{1}} hetes egerek kaptak 50 ml Complete Freund-féle Adjuvánst (Merck) sc, majd NTS injekciót (iv; 6 ml/testtömeg-kg; Probetex Inc.) a 4. napon. 18. Vizeletet gyűjtöttünk 3., 7. 10 és 14 nappal az injekció beadása után, és az egereket a 14. napon leölték.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzés a Prism 9.{1}} szoftverrel (GraphPad) történt.

Az adatokat először a normalitás szempontjából vizsgáltuk (Shapiro-Wilk teszt). Ha az eloszlás Gauss-féle volt, az adatokat parametrikus teszttel elemeztük (Student-t-próba 2 csoportnál és varianciaanalízis Tukey utótesztjével több mint 2 csoport esetében). Ha az eloszlás nem Gauss-féle volt, nem paraméteres teszteket (Friedman teszt Dunn utótesztjével több mint 2 csoportra és Mann-Whitney U tesztet 2 csoportra) alkalmaztunk. A különbségeket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha P <>

EREDMÉNYEK

A Rarres1-et podociták fejezik ki

Először felmértük a Rarres1 expressziós mintázatát egér és emberi veseszövetben. A polimeráz láncreakció elemzése azt mutatta, hogy a Rarres1 szignifikánsan nagyobb mértékben expresszálódik a glomerulárisban, mint az egér vesekéreg tubulointersticiális frakciójában (1a. és b6. ábra). Az egér veseszövetének egysejtű RNS-szekvenálási elemzése kimutatta, hogy a Rarres1-et kizárólag a podociták expresszálják (1c. ábra). Emberben a Rarres1 glomeruláris szövetben is gazdagodott (1d. ábra). A normál emberi veseszövet immunfluoreszcenciájában a Rarres1 magas jelet mutatott a glomerulusokban (1e. ábra). A kettős festés azt mutatta, hogy a Rarres1 a nefrin reaktivitáson kívül található a kapilláris hurkokban, ami podocita expresszióra utal (1f ábra). A vimentinnel történő kolokalizáció a főbb folyamatok lokalizációját jelezte. Nem tapasztaltunk átfedő reaktivitást a CD31 EC marker vagy a mezangiális marker - simaizom aktin esetében (1f ábra).

A Rarres1 elősegíti az NF-kB és a TGF-b1 jelátvitelét az Axl receptor tirozin kinázon keresztül

A Rarres1 podocitákban betöltött szerepének tisztázása érdekében manipuláltuk az expressziós szintjeit immortalizált humán podocitákban.16 A Rarres1 szintje jelentősen megemelkedett a humán Rarres1 cDNS-sel stabilan transzfektált podocitákban, és lecsökkent a Rarres1-célzó siRNS-sel történő transzfekció után (ábra). 2a). A Rarres1 túlzott expressziója felfelé szabályozta az epiteliális-mezenchimális átmenettel kapcsolatos gének expresszióját, míg az endogén Rarres1 downregulációja ezzel ellentétes hatást fejtett ki (2b ábra). Mivel az NF-kB jelátvitelnek fontos szerepe van a GN-ben fifibrózishoz és gyulladáshoz vezető hám-mezenchimális átmenetben19, in vitro mértük a TGF-b1 által kiváltott NF-kB jelátviteli aktivációt. A Rarres1 túlzott expressziója az NF-kB útvonal fokozott aktivációját okozta a kiinduláskor és a TGF-b1 stimuláció után (2c. ábra). Mivel a Rarres1-ről beszámoltak arról, hogy aktiválja az Axl tirozin-kináz receptort, és ily módon elősegíti az NF-kB jelátviteli útvonalat gyulladásos emlőrákban20, megvizsgáltuk, hogy az Axl a Rarres1 potenciális funkcionális partnere-e a veseszövetben. A TGF-b1 által kiváltott NF-kB aktivációt az R428, az Axl-kináz21,22 szelektív kismolekulájú inhibitora gátolhatja (2d. ábra), és a Rarres1 túlzott expressziója pozitívan korrelált az Axl-kináz konstitutív aktiválásával (2e. ábra). Az Axl aktivitásának R428-cal történő kimerülése, de az Axl siRNS általi géncsendesítése nem csökkentheti az epiteliális-mezenchimális átmenettel kapcsolatos gének Rarres-indukált expresszióját, amit a csökkent mRNS-szint bizonyít (2f. ábra). Megjegyzendő, hogy a nem kanonikus NF-kB útvonalak aktiválódását nem észlelték (S1 kiegészítő ábra). Így a Rarres1 elősegítette az NF-kB jelátvitelt tenyésztett podocitákban az Axl kináz aktiválásával.

Miért segítheti elő a Retinoic Acid Receptor Responder1 a glomeruláris betegségek kialakulását?

A Rarres1 inaktiválása podocitákban nem vezet glomeruláris rendellenességekhez, és nem módosítja a nephropathia kimenetelét egy antiglomeruláris alapmembrán (GBM) GN modellben

A Rarres1 podocitákban betöltött szerepének in vivo elemzésére létrehoztunk egy új Rarres1flfl/flfl (floxed) egérvonalat, és kereszteztük azt podocin-Cre egerekkel, hogy Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl egereket (Creþ/Rarres1flfl/flfl) hozzunk létre (3. ábra). ). A floxed/Cre allélek genotípusait fül genotipizálással azonosítottuk (3b. ábra). A tubulointersticiális és glomeruláris frakciók, valamint a májszövet polimeráz láncreakciós elemzése megerősítette a 3. exon delécióját specifikusan a glomerulusban (S2A kiegészítő ábra), és a Rarres1 fehérje szintje csökkent a Creþ/Rarres1flfl/flfl egerek glomerulusaiban (ábra). 3c).

4. ábra|A Rarres1 upregulációja a glomeruláris és peritubuláris kapilláris endothel sejtekben krónikus vesebetegségben szenvedő betegeknél. (a) A Rarres1, kollagén1a2 (COL1A2) és nephrin (NPHS1) génexpresszió elemzése diabéteszes nephropathiában (DN), vasculitisben, IgA nephropathiában (IgAN) és kontroll (Ctrl.) betegekből izolált glomerulusok microarray adataiban. 4,6,24–26 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0="" .001="" a="" kontroll="" alanyokkal="" szemben.="" (b)="" kvantitatív="" polimeráz="" láncreakció="" analízis="" a="" rarres1,="" col1a2="" és="" nphs1="" génekre="" dn-ben="" szenvedő="" betegek="" (n="5)" és="" kontrollok="" (n="5)" izolált="" glomerulusaiban.="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" a="" kontroll="" alanyokhoz="" képest.="" (c)="" a="" rarres1="" és="" col1a2="" génexpresszió="" elemzése="" dn-ből,="" vasculitisből,="" igan-ból="" és="" kontroll="" betegekből="" izolált="" tubuláris="" frakció="" microarray="" adataiban.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" a="" kontroll="" alanyokhoz="" képest.="" (d)="" reprezentatív="" mikrofényképek="" a="" rarres1="" immunhisztokémiai="" festődéséről="" humán="" vesekéreg="" szövetében="" kontrolloktól="" és="" dn-ben="" (n="5)," antineutrofil="" citoplazmatikus="" autoantitest="" (anca)="" vasculitisben="" (n="4)" és="" igan-ban="" szenvedő="" betegektől="" n="5)." a="" nyilak="" a="" rarres{42}}pozitív="" podocitákat="" (kontroll)="" és="" az="" endothelsejteket="" (ec)="" (dn,="" igan="" és="" vasculitis)="" jelzik.="">

4. ábra|(Folytatás) (e) Reprezentatív konfokális mikroszkópos képek, amelyek a Rarres1 expresszióját mutatják DN-ben szenvedő betegek glomerulusaiban. A CD31-et használtuk az EC-k markereként. Rudak=50/10 mm. (f) Az RNAscope reprezentatív konfokális FL fluoreszcens képei, amelyek a Rarres1 gén expresszióját mutatják PECAM{6}} koexpresszáló sejtekben DN-ben szenvedő betegek tubuláris frakciójában. Az adatokat átlag±SEM-ben fejezzük ki. A diák t-próbáját két csoport összehasonlítására alkalmaztuk. Rudak=50/10 mm. A kép megtekintésének optimalizálásához tekintse meg a cikk online változatát a www.kidney-international.org címen.

A Creþ/Rarres1flfl/flfl egerek a várt mendeli öröklődési arány mellett születtek, életképesek és termékenyek voltak (az adatokat nem mutatjuk be). Rutin fény- és elektronmikroszkópos vizsgálattal elemezve a veséket nem lehetett megkülönböztetni a kontroll alomtársaktól (Cre-/Rarres1flfl/flfl ) (S2B és C kiegészítő ábra). Ezenkívül a podocita fehérjék nephrin és synaptopodin eloszlása ​​nem változott Creþ / Rarres1flfl / flfl egerekben (S2D kiegészítő ábra)

A Rarres1 in vivo vesekárosodásban játszott szerepének tisztázására a Creþ/Rarres1flfl/flfl-t NTS-sel kezelték, ami IgG-lerakódásokhoz vezetett a GBM-ben, albuminuria és progresszív GN.23 Az albuminuria szintje hasonló volt a Creþ/Rarres1flfl/flfl és a kontrollcsoportban. egerek (3d. ábra). A fénymikroszkópos vizsgálat nem mutatott ki szignifikáns különbséget az érintett glomerulusok arányában (3e. ábra). Az elektronmikroszkópos vizsgálat nem mutatott ki különbséget a GBM vagy a lábfolyamat vastagságában, és úgy tűnt, hogy a GEC-ek mindkét csoportban hasonlóan érintettek (3f ábra). A podocita markerek nephrin, Wt1 és synaptopodin mindkét csoportban hasonló módon érintettek (S3A kiegészítő ábra). Ezenkívül az EC-k festése CD31-gyel nem mutatott különbséget a glomerulusokban vagy a peritubuláris kapillárisokban a csoportok között (S3B és C kiegészítő ábra). Ezenkívül a fifibrózis és a gyulladással kapcsolatos gének expressziója hasonlóan emelkedett mindkét NTS-sel kezelt csoportban (S4 kiegészítő ábra).

A Rarres1 expressziója glomeruláris és peritubuláris kapilláris EC-ben indukálódik krónikus vesebetegségben (CKD)

A Rarres1 CKD-ben betöltött szerepének feltárása érdekében elemeztük expresszióját a nyilvánosan elérhető RNS-adatkészletekben. A DN-ben, ANCA-asszociált vasculitisben és IgAN-ban szenvedő betegekből izolált glomerulusokban szignifikánsan megemelkedett Rarres1 szintet figyeltünk meg (4a ábra), 4, 6, 24-26, míg a többi podocita-asszociált gének, például a nephrin szignifikánsan csökkent vagy nem változott. . DN-ben (n=5) szenvedő betegekből izolált glomerulusok kvantitatív polimeráz láncreakciós elemzése igazolta a Rarres1 expresszió indukcióját (4b. ábra). A podociták elvesztése miatt a podocita gének expressziója általában fokozatosan csökkenglomeruláris betegségek,6 és a glomeruláris Rarres1 és a nephrin expresszió aránya körülbelül 20--szeresére nőtt a DN-ben az egészséges glomerulusokhoz képest (4b. ábra). A DN, ANCA-asszociált vasculitis és IgAN tubulointerstitialis szöveti adatkészleteiben a Rarres1 expressziója is felfelé volt szabályozva (4c. ábra).8–11.

Ezt követően elemeztük a Rarres1 expresszióját immunhisztokémiai úton DN-ben (n ¼ 5), IgAN-ban (n ¼ 5) és ANCA-asszociált vasculitisben (n ¼ 4) szenvedő betegek vesebiopsziáiban. A beteg glomerulusokban a Rarres1 festődés a GEC-ekre lokalizálódott, amint azt a kapillárisfalak belső oldalán lévő immunreaktivitás mutatta (4d. ábra, betétek), míg a podocitáktól származó jel gyengébbnek tűnt. A tubulointersticiális térben a festődést a peritubuláris kapillárisokban mutatták ki (4d. ábra, betétek), ami EC expresszióra utal. A CD31-gyel végzett kettős immunjelölés mind a glomerulusokban, mind a peritubuláris kapillárisokban validálta az EC-k lokalizációját (4e. ábra). Hasonlóképpen, a kettős RNS-scope-kísérletek kimutatták a Rarres1 mRNS és a PECAM1 mRNS kolokalizációját a DN-ben (4f. ábra). Összességében a Rarres1 expressziójának indukciója a glomeruláris és peritubuláris kapilláris EC-ben gyakori jelenség volt a CKD-ben.

A Rarres1-et túltermelő egérvonal generálása és jellemzése EC-ben

Mivel a Rarres1 indukálódik humán CKD-ben, létrehoztunk egy új transzgenikus egérvonalat, amelyben a Rarres1 cDNS-t a Rosa26 lókuszba vittük be a CAG promoter alatt,27 egy lox-STOP-lox kazettával az illesztési akceptor helyek között (5a. ábra). A vonalat egy Tie2-cre vonallal keresztezték, hogy Rarres1_Tie2_KI egereket hozzunk létre, és az egereket a knockin és Cre allélek fül genotipizálásával azonosították (5a. ábra). A Rarres1_Tie2_KI egerekben a Rarres1 fehérje szignifikánsan megnövekedett szintje volt a veseszövetben (5b. ábra), és a sikeres knockin stratégiát tovább igazolták a Rarres1 mRNS expressziójának elemzése FACS-válogatott GFP-pozitív sejtekben. GEC-ek (5c. ábra).

Fenotipizáltuk a Rarres1_Tie2_KI egerek veséit, és a kontrollegereket az életkor szerinti csoportokban. Fénymikroszkópos vizsgálattal a vese morfológiája nem volt megkülönböztethető a Rarres1_Tie2_KI egerekben a kontroll alomtársaktól (5d. ábra). Hasonlóképpen, az elektronmikroszkópos vizsgálat változatlan GBM vastagságot és podocita láb folyamatszélességet mutatott (5e. ábra). Ezenkívül a podocita markerek, a nephrin és a synaptopodin expressziója úgy tűnt, hogy a Rarres1 túlzottan expresszáló glomerulusokban nem változott (5f ábra). Megjegyzendő, hogy más nagyobb szervek makroszkóposan vagy mikroszkóposan nem mutattak nyilvánvaló rendellenességeket (az adatokat nem mutatjuk be).

5. ábra|Endothelsejt-specifikus Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) egerek létrehozása. (a) Feltételes knockin egerek generációja, amelyekben a Rarres1 expresszióját specifikusan indukálják az endotélsejtekben (EC) a Cre-LoxP rekombinációs rendszer segítségével. Tie2-Cre egereket kereszteztünk a célvektort expresszáló egerekkel (Rarres1_casetteþ), amelyek egy lox-STOP-lox kazettát tartalmaztak a splice között (folytatás)

5. ábra|(folytatás) akceptor helyeket és a CAG promoter alatt található Rarres1 cDNS-t, amelyet a Rosa26 lókuszba vittek be, fül genotipizálással azonosították. A genotipizálást fülpreparációval és polimeráz láncreakcióval (PCR) igazoltuk 4 hetes korban. (b) Reprezentatív Western blot, amely a Rarres1 fokozott expresszióját mutatja a vesekéregben EC-specifikus Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI) egerekből. **P < 0.01="" kontra="" kontroll="" (ctrl.;="" cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="5," mann-whitney="" u="" teszt).="" (c)="" kvantitatív="" pcr="" a="" rarres1-re="" izolált="" ec-kben.="" **p="">< 0,01="" a="" kontrollhoz="" képest="" (cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="3," student-féle="" t-teszt).="" (d)="" reprezentatív="" mikrofényképek="" a="" periodikus="" sav-schiff-festett="" metszetekről,="" amelyek="" tipikus="" glomeruláris="" struktúrákat="" mutatnak="" különböző="" egércsoportokban.="" (e)="" reprezentatív="" fotomikroszkópos="" felvételek="" és="" a="" glomeruláris="" alapmembrán="" (gbm)="" átlagos="" vastagságának="" és="" a="" rések="" száma="" gbm="" mm-enkénti="" számszerűsítése="" különböző="" egércsoportokban="" transzmissziós="" elektronmikroszkópos="" elemzésekkel="" (student="" t-teszt).="" (f)="" reprezentatív="" konfokális="" mikroszkópos="" képek,="" amelyek="" a="" podocita-specifikus="" marker="" szinaptopodin="" és="" nephrin="" expresszióját="" mutatják="" ec-specifikus="" rarres1="" knock-in="" egerekben="" (rarre1_tie2_ki)="" és="" ctrl.="" egerek.="" rudak="10" mm.="" az="" adatokat="" átlag="" ±="" sem-ben="" fejezzük="" ki.="" a="" kép="" megtekintésének="" optimalizálásához="" tekintse="" meg="" a="" cikk="" online="" változatát="" a="" www.kidney-international.org="">

A Rarres1 indukciója az EC-kben modulálja az NF-kB jelátviteli útvonalat és a nephropathia kimenetelét az Axl aktiválásának szabályozásával

Annak értékelésére, hogy a Rarres1 expressziója az EC-ben modulálja-e a betegség progresszióját, egyetlen NTS injekcióval indukáltuk a GN-t transzgenikus egerekben és alomtársaikban. A ritka1_- Tie2_KI egerekben 3 nap után szignifikánsan magasabb albuminuriaszint alakult ki, mint a kontrolloké, míg az albuminuria tekintetében a 7., 10. és 14. napon nem volt szignifikáns különbség (6a. ábra). A szövettani elemzés 14 nappal az indukció után azt mutatta, hogy a Rarres1_Tie2_KI egerekben nem volt több glomeruláris elváltozás, például szklerotikus és félhold elváltozások (6b. ábra). Az elektronmikroszkópos értékelés azonban lényegesen vastagabb GBM-et és több lábfejlődést mutatott ki Rarres1_Tie2_KI egerekben (6c. ábra). Ezenkívül a Rarres1_Tie2_KI egerek a vesekéregben megnövekedett simaizom-aktinszintet mutattak (6d. ábra). A podocita markerek, a nephrin, a synaptopodin és a WT1 elemzése mélyreható csökkenést mutatott, ami dedifferenciálódásra és a podociták jelentős csökkenésére utal (6d. ábra). Fontos, hogy a Rarres1_Tie2_KI glomerulusok kevesebb WT1-pozitív podocitát mutattak a kontrollállatokhoz képest, ami azt jelzi, hogy az EC-expresszált Rarres1 elősegítette a podocita károsodását. Ezenkívül több fibrin trombust észleltek a Rarres1_Tie2_KI glomerulusokban (6e. ábra). Ezzel összhangban a különböző gyulladásokkal, fifibrózissal és vesetubuláris sérüléssel összefüggő gének expressziója jelentősen megnövekedett a Rarres1_- Tie2_KI egerekben, amint azt az Il valós idejű polimeráz láncreakciós analízise mutatja. -1béta, Col1a1, TGF-b1 és vesekárosodás molekula-128 a vesekéreg szövetében (6f. ábra). A vér karbamid-nitrogén- és S-kreatinin-értékeiben azonban nem észleltünk különbséget a csoportok között (6g. ábra). Ezenkívül az EC-k festése CD31-gyel nem mutatott különbséget a glomerulusokban vagy a peritubuláris kapillárisokban a csoportok között (S5A és B kiegészítő ábra). Összességében a Rarres1 expresszió EC-specifikus indukciója súlyosbította a glomeruláris patológiát NTS-indukált nephropathiában.

Mechanikailag elemeztük, hogy a Rarres1 túlzott expressziója az EC-kben elősegítette-e az Axl és NF-kB jelátvitel aktiválását in vivo, hasonlóan in vitro megfigyeléseinkhez (2. ábra). Mind a Rarres1_Tie2_KI, mind az NTS-sel kezelt kontroll egerek az Axl jelátviteli útvonal aktiválódását mutatták, amint azt az Axl fokozott foszforilációja mutatja (6.h ábra). Ez az aktiválás azonban jelentősebb volt a Rarres1_- Tie2_KI egerekben (6.h ábra). Ennek megfelelően ezekben az egerekben az NF-kB útvonal aktivációja elősegítette, amint azt a glomerulusokban lévő pP65-pozitív magok száma mutatja (6i. ábra). Amikor Western-blottal mértük a pP65 szinteket, hasonló tendenciát észleltünk az NF-kB útvonal aktivációjában, bár ez nem volt szignifikáns, valószínűleg egy kiugró érték miatt (S5C kiegészítő ábra).

A Rarres1 inaktiválása EC-ben csökkenti a glomeruláris károsodást az anti-GBM glomerulonephritis modellben

Az EC-eredetű Rarres1 CKD-ben betöltött patogén szerepének igazolására létrehoztunk egy egérvonalat, amelyben a Rarres1-et törölték az EC-kből a Tie2-Cre segítségével (7a. ábra). A floxed és a Cre allélek genotípusait fül genotipizálással azonosítottuk (7b. ábra). Az NTS-kezelt egerekben megfigyelhető volt a Rarres1 fokozódásának tendenciája, amely a Rarres1_Tie2_KO egereknél megszűnt (7c. ábra). Az egerek nem mutattak nyilvánvaló veserendellenességet (az adatokat nem mutatjuk be). Az NTS injekciója hasonló albuminuriát váltott ki a Rarres{11}}Tie2_KO-ban és a kontrollokban (7d. ábra). Az indukció után 14 nappal végzett szövettani elemzés azonban kevesebb glomeruláris elváltozást mutatott a Rarres1_- Tie2_KO egerekben (7e. ábra). Az elektronmikroszkópos vizsgálat során a Rarres1_Tie2_KO egereken kisebb mértékű kiszáradást és a GBM megvastagodását mutatták ki (7f. ábra). Az immunfestés nem mutatott szignifikáns különbséget az aSMA, a nephrin vagy a synaptopodin esetében (7g. ábra). A WT1-pozitív podociták száma azonban lényegesen több volt a Rarres1_Tie2_KO egerekben (7g. ábra). A pP65 festése a Rarres1_Tie2_KO glomerulusokban a pozitív sejtmagok számának csökkenését mutatta, ami az NF-kB jelátviteli útvonal részvételére utal (7.h ábra).

6. ábra|(folytatás) a glomeruláris alapmembrán (GBM) átlagos vastagságának és a rések számának meghatározása GBM mm-enként különböző egércsoportokban transzmissziós elektronmikroszkópos elemzési metszetekkel (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n { {3}}; NTS-Rarres1_Döntetlen2_KI, n=12). (d) Reprezentatív konfokális mikroszkópos képek, amelyek a nephrin, a synaptopodin, a ⍺-simaizom aktin (⍺Sma) és a WT1 expresszióját mutatják a vesében különböző egércsoportokból. Rudak {{10}}/10 mm. A ⍺Sma-pozitív területet kérgi keresztmetszetenként, a WT1-et pedig glomerulusonként számoltuk (Ctrl., n=2; NTS-ctrl., n=3; NTS-Rarres{{18} }Döntetlen2_KI, n {{20}}). (e) Fibrin trombusok jelenléte a glomerulusokban trichome festéssel kimutatva (glomeruláris keresztmetszetenként számolva) (Ctrl., n=3; NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres{{ 26}}Döntetlen2_KI, n=5). (f) A különböző gyulladásokkal, fifibrózissal és vesetubuláris sérüléssel összefüggő gének relatív mRNS szintjei NTS-kezelt egerek vesekéregében (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n=6 –10; NTS-Rarres1_Döntetlen2_KI, n=6–10). (g) A szérum kreatinin és a vér karbamid-nitrogén (BUN) szintje az NTS-ctrl-ben. (n=3) és NTS-Rarres1_Tie2_KI (n=3) egerek. (h) Reprezentatív Western blot dokumentumok és összesített adatok, amelyek a Paxil relatív fehérjeszintjét mutatják a vesekéregben NTS-kezelt egerek különböző csoportjaiban (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_) Döntetlen2_KI, n=5). (i) Reprezentatív mikrofényképek a pP65 immunhisztokémiai festődésről a vesekéreg szövetében NTS-kezelt egerek különböző csoportjaiból. A pP65-pozitív sejtmagokat glomerulusonként számszerűsítettük a különböző egércsoportokban (Ctrl., n=7; NTS-ctrl., n=8; NTS-Rarres1_Tie 2_KI, n=14). EC-specifikus Rarres1 knock-in egerek (Rarres1_Tie2_KI egerek); Rarres1 kazettával és Cre expresszió nélküli egereket (Ctrl.) használtunk kontrollként. #P < 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" szemben="" a="" kezeletlen="" kontrollal="" (ctrl.),="" *p="">< 0,05="" szemben="" az="" nts-sel="" kezelt="" kontrollal="" (nts-ctrl.).="" az="" adatokat="" átlag="" ±="" sem-ben="" fejezzük="" ki.="" a="" diák="" t-próbáját="" két="" csoport="" összehasonlítására="" alkalmaztuk.="" a="" 3="" vagy="" több="" fős="" csoportok="" esetében="" egyutas="" varianciaanalízist,="" majd="" tukey="" utótesztjét="" alkalmaztuk="" a="" többszörös="" összehasonlításhoz.="" a="" kép="" megtekintésének="" optimalizálásához="" tekintse="" meg="" a="" cikk="" online="" változatát="" a="" www.kidney-international.org="">

VITA

A Rarres1-et először tazaroténnel kezelt bőrtutaj-tenyészetekben azonosították29, és kimutatták, hogy invázió represszorként működik prosztatarák sejtvonalakban.30 Gyulladásos emlőrák esetén a Rarres1 in vitro szabályozza a rákos sejtek invázióját az Axl jelátviteli útvonal közvetítésével. . Részletesen, a Rarres1 stabilizálja az Axl-t az Axl proteaszóma-függő lebomlásának gátlásával. Ezenkívül a Rarres1 kimerülése a SUM149 sejtekben leszabályozza az Axl expresszióját és inaktiválja az NF-kB-t, ami a gyulladásos emlőráksejtek inváziójának csökkenéséhez vezet.20 Ezenkívül a Rarres1 expressziója előrehaladott fifibrózisban szenvedő betegekben indukálódik, és a Rarres1 profibrotikus szerepét is kimutatták. patkány tüdőfibrózis modellben és a máj csillagsejtek fibrogén aktiválása során javasoltak.31 Összességében a korábbi in vitro vizsgálatok azt sugallják, hogy a Rarres1 szerepet játszik fifibrózisban, gyulladásban és rák invázióban.

Kezdetben a Rarres1 felkeltette érdeklődésünket, mivel podocita sejtekben nagymértékben dúsított. Megmutattuk, hogy a Rarres1 elősegítette a gyulladásos és profibrotikus jelátvitelt podocitákban az Axl által közvetített NF-kB útvonal aktiválásával. Másrészt a podocita-specifikus kiütött állatok nem mutattak nyilvánvaló különbséget a kontrollokhoz képest egészséges körülmények között, valamint a GN egérmodelljében. Ennek oka lehet a kompenzációs mechanizmus, mivel az NF-kB jelátviteli útvonalat számos molekula és biológiai folyamat szabályozza.

A cukorbetegek molekuláris profilja azt mutatta, hogy a DN-ben a Rarres1 glomeruláris és peritubuláris kapilláris EC-kben indukálódott. Fontos, hogy a Rarres1 expresszióját nem mutatták ki nephropathia nélküli cukorbetegek EC-iben. Ezért azt feltételezzük, hogy a Rarres1 új markere lehet a diabéteszes mikrovaszkuláris betegségeknek, és plazma- és vizeletmintákkal végzett vizsgálatok szükségesek a Rarres1 mint nem invazív biomarker megvalósíthatóságának feltárására. A Rarres1 indukcióját IgAN-ban és vasculitisben szenvedő betegekben is azonosítottuk. Csábító az a feltételezés, hogy a Rarres1 patogén szerepet játszik ezekben a glomerulopathiákban, és hozzájárul a betegség progressziójához. Funkcionálisan kimutattuk, hogy a Rarres1 indukciója az EC-kben fokozta a vesekárosodást a GN egérmodelljében, míg a Rarres1 inaktiválása EC-ben javította a sérülést. A fenotípusos elemzés azt mutatta, hogy a podociták érintettek azokban az egerekben, amelyek túlzottan expresszálják a Rarres1-et EC-ben. Ez lehet a Rarres1 közvetlen hatása a podocitákra, mivel a Rares oldható formáját leírták.32 Alternatív megoldásként a podocita sérülése másodlagos lehet a glomerulus filtrációs gát károsodása miatt.

Korábban kimutatták, hogy az endoteliális NF-kB aktiváció patogén szerepet játszik a vesebetegség kialakulásában vasculitisben.13 Nevezetesen, az endoteliális NF-kB útvonal gátlása egy félhold GN modellben megsemmisítette a progressziót. Az Axl-gátlók jótékony hatásúnak bizonyultak kísérleti anti-GBM nephritisben. A legszelektívebb kis molekulájú inhibitorral, az R428-cal kezelt egerek a vesefunkció jelentős megőrzését és a gyulladásos citokintermelés csökkenését mutatták.33 Ez azt jelzi, hogy ez az útvonal terápiás lehetőség lehetglomeruláris betegségfolyamatokat. Mindazonáltal, mivel mind az Axl, mind az NF-kB számos különböző sejtfolyamatot modulál a szervezetben, nem valószínű, hogy jó jelölt lenne a krónikus vesebetegség gyógyszeres célzására. A Rarres1 inkább vesével kapcsolatos célpontot jelenthet.

Kimutatták, hogy a Tie2-Cre fokozza az expressziót a vérképző sejtek egy alpopulációjában.34 Ezen sejtek némelyike ​​modulálhatja a gyulladásos választ az NTS-indukált modellben, ezért nem zárhatjuk ki, hogy a vérképző sejtekből származó Rarres1 hozzájárul a betegség progressziója a Tie2-Cre vonalakban. Mivel azonban nem észleltünk nyilvánvaló Rarres1 expressziót a beszivárgó immunsejtekben, úgy gondoljuk, hogy ez kevésbé valószínű.

Amíg ez a kézirat előkészítés alatt állt, Chen és munkatársai32 beszámoltak a Rarres1 oldható formájáról, amely elősegítiglomeruláris betegségprogresszió. Hozzánk hasonlóan azonosították a Rarres1 upregulációját gyakori humán glomeruláris betegségekben. A tanulmány alátámasztja azt a megállapításunkat, hogy a megnövekedett Rarres1 expresszió korrelál a vesefunkció csökkenésévelhumán glomeruláris betegség. Eredményeinkkel ellentétben azonban arra a következtetésre jutottak, hogy a Rarres1 felszabályozása a podociták túlzott expressziójának köszönhető. Nem zárhatjuk ki ezt a lehetőséget, de humán betegségekben kimutattuk a Rarres1 expresszió egyértelmű indukcióját az EC-kben. Eredményeinket magyarázó egyik mechanizmus az lehet, hogy a podociták által termelt Rarres1 oldható formáját a GEC-ek felveszik. Mindazonáltal azok az eredmények, amelyek szerint in situ hibridizációval kimutattuk a Rarres1 mRNS-t EC-kben, és hogy a Rarres1-et peritubuláris kapilláris EC-kben is indukáltuk, erősen alátámasztják azt az elképzelést, hogy a Rarres1 expressziója vesebetegségekben elsősorban endoteliális eredetű.

7. ábra|A Rarres1 endothel-specifikus ablációja gyengíti a vesekárosodást nefrotoxikus szérummal (NTS) kezelt egerekben. (a) Feltételes knockout egerek generálása, amelyekben a Rarres1 specifikusan ablált endotélsejtekben a Cre-LoxP rekombinációs rendszer segítségével. A Tie2-Cre által közvetített rekombináció során a 3. exon törlődik. (b) A genotipizálást farokpreparációval és polimeráz láncreakcióval igazoltuk (folytatás)

7. ábra|(folytatás) 4 hetes kor. (c) Reprezentatív Western blot dokumentumok és összesített adatok, amelyek a Rarres1 relatív fehérjeszintjét mutatják a vesekéregben NTS-kezelt egerek különböző csoportjaiban (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_). Döntetlen 2_KO, n=4) és a kezeletlen egerek (Control [Ctrl.], n {{10}}). **P < 0.01.="" (d)="" uacr="" (vizelet="" albumin-kreatinin="" arány)="" különböző="" egércsoportokban="" nts-kezelés="" alatt="" (ctrl.,="" n="7–11;" rarres1_tie2_ko,="" n="" {="" {19}}–8).="" (e)="" fényképek="" és="" mennyiségi="" meghatározások,="" amelyek="" a="" glomeruláris="" szerkezet="" tipikus="" változásait="" mutatják="" különböző="" egércsoportokban.="" glomeruláris="" elváltozásokat="" azonosítottak="" a="" periodikus="" sav-schiff-festett="" metszetekben="" (ctrl.,="" n="3;" nts-kezelt="" kontroll="" [nts-ctrl.],="" n="12;" nts="" rarres1_tie{="" {27}}ko,="" n="8)." (f)="" reprezentatív="" fotomikroszkópos="" felvételek="" és="" a="" glomeruláris="" alapmembrán="" (gbm)="" átlagos="" vastagságának="" és="" a="" rések="" számának="" meghatározása="" a="" gbm="" mm-enként="" különböző="" egércsoportokban="" transzmissziós="" elektronmikroszkópos="" elemzési="" metszetekkel="" (ctrl.,="" n="6;" nts-ctrl.="" ,="" n="13;" nts-rarres1_döntetlen2_ko,="" n="16)." (g)="" reprezentatív="" konfokális="" mikroszkópos="" képek,="" amelyek="" a="" nephrin,="" a="" synaptopodin,="" a="" -simaizom="" aktin="" (sma)="" és="" a="" wt1="" expresszióját="" mutatják="" a="" vesében="" különböző="" egércsoportokból.="" rudak="50/10" mm.="" a="" sma-pozitív="" területet="" kérgi="" keresztmetszetenként="" számoltuk="" (nts-ctrl.,="" n="8;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="4)." (h)="" reprezentatív="" mikrofényképek="" a="" pp65="" immunhisztokémiai="" festődésről="" a="" vesekéreg="" szövetében="" nts-kezelt="" egerek="" különböző="" csoportjaiból.="" a="" pp65-pozitív="" sejtmagokat="" glomerulusonként="" számszerűsítettük="" a="" különböző="" egércsoportokban="" (nts-ctrl.,="" n="7;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="" {{="" 56}}).="" ####p="">< 0,001="" a="" kezeletlen="" ctrl-vel="" szemben,="" *p="">< 0,05="" az="" nts-ctrl-hez="" képest.="" az="" adatokat="" átlag±="" sem-ben="" fejezzük="" ki.="" a="" diák="" t-próbáját="" két="" csoport="" összehasonlítására="" alkalmaztuk.="" a="" 3="" vagy="" több="" fős="" csoportok="" esetében="" egyutas="" varianciaanalízist,="" majd="" tukey="" utótesztjét="" alkalmaztuk="" a="" többszörös="" összehasonlításhoz.="" a="" kép="" megtekintésének="" optimalizálásához="" tekintse="" meg="" a="" cikk="" online="" változatát="" a="" www.kidney-international.org="">

Ebben a tanulmányban van néhány korlátozás, amelyet el kell ismerni. Először is, in vitro vizsgálatokat végeztünk podocitákon, míg in vivo manipuláltuk az expressziót EC-kben. Ezért nem tudjuk közvetlenül összekapcsolni a Rarres1-et az Axl aktiválásával az EC-kben. Másodszor, bár sikerült azonosítani az NF-kB jelátvitel Rarres1- által kiváltott (Axl-függő) aktiválását podocitákban, nem vizsgáltuk a folyamat mögött meghúzódó molekuláris mechanizmust. További vizsgálatokra van szükség annak a korábbi megállapításnak a feltárásához, hogy a Rarres1 elősegíti az Axl aktiválását azáltal, hogy gátolja annak proteaszóma-függő lebomlását. Végül csak az NTS-indukált nephropathia modellel támadtuk meg a knockout/-in állatainkat. Ezért több állatmodellben végzett vizsgálat szükséges annak megállapítására, hogy a Rarres1-nek más betegségfolyamatokban is van-e patogén szerepe.

Összefoglalva, tanulmányunk azt mutatja, hogy a közönséges humán glomerulopathiákban a podocitákkal dúsított Rarres1 fehérje indukálódik EC-ben, ami gyulladáshoz, podocita sérüléshez és fifibrózishoz vezet. Ezt potenciálisan az NF-kB jelátviteli útvonal fokozása közvetíti az Axl receptor tirozin kináz aktiválása révén (7. ábra). A Rarres1 a mikrovaszkuláris sérülés új biomarkere, és potenciálisan új terápiás célpont lehet a gyulladás és a fifibrózis visszaszorítására CKD-ben.

KÖZZÉTÉTEL

ML az AstraZeneca (Göteborg, Svédország) alkalmazottja. A JP kutatását az AstraZeneca támogatja. A többi szerző nem nyilatkozott egymással versengő érdekekről.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a tanulmányt a Diabetes Wellness Sverige KM-H és a KI/AZ Integrated Metabolic Center JP, a Marianne és Marcus Wallenberg Alapítvány, a Svéd Diabetes Alapítvány, a Svéd Vese Alapítvány és az Innovatív Orvostudományi Központ támogatta.

SZERZŐI HOZZÁJÁRULÁSOK

KM-H, ML és JP tervezte a kutatást; KM-H, DD, EC, SZ és GG végezte a kutatást; KM-H és XL elemezte az adatokat; Az AW emberi mintákat biztosított; valamint a KM-H és a JP írta a lapot.

Miért segítheti elő a Retinoic Acid Receptor Responder1 a glomeruláris betegségek kialakulását?

KIEGÉSZÍTŐ ANYAG

Kiegészítő fájl (PDF)

S1 táblázat. Ebben a vizsgálatban a célgének primer párjait használtuk a valós idejű RT-PCR-hez.

S2 táblázat. Ebben a vizsgálatban antitesteket használtak. Kiegészítő fájl (PowerPoint)

S1 ábra. A Rarres1 túlzott expressziója nem aktiválja a nem kanonikus NF-kB jelátviteli útvonalat. Reprezentatív Western blot dokumentum és összefoglaló adatok, amelyek azt mutatják, hogy a Rarres1 túlzott expressziója nem aktiválja a p100/p52-t 10 ng/ml TGF-b1-gyel kezelt podocitákban (n=2). Az adatokat átlag ± SD-ben fejezzük ki. A diák t-próbáját két csoport összehasonlítására alkalmaztuk. UT, kezeletlen.

S2 ábra. Podocita-specifikus Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) egerek létrehozása. (A) Hagyományos PCR analízis tubuláris és glomeruláris frakciókban, valamint májszövetben. (B) A vesepatológia szövettani vizsgálata (PAS-festés) Cre–/Rarres1flfl/flfl és Creþ/Rarres1flfl/flfl egerekben. (C) Reprezentatív transzmissziós elektronmikroszkópos felvételek (TEM) és a glomeruláris alapmembrán (GBM) átlagos vastagságának és a rések számának meghatározása GBM mm-enként különböző egércsoportokban (n=3). (D) Reprezentatív konfokális mikroszkópos képek, amelyek a podocita-specifikus markerek, a szinaptopodin és a nephrin expresszióját mutatják podocita-specifikus Rarres1 knockout (Creþ/Rarres1flfl/flfl) és kontroll (Cre–/Rarres1flfl/flfl) egerekben. Bar=10 mm.

S3 ábra. A podocita markerek és a CD31 expressziós szintje NTS-kezelt egerek veséjében. (A) Reprezentatív konfokális mikroszkópos képek, amelyek a nephrin, a WT-1 és a szinaptopodin expresszióját mutatják podocitákban NTS-kezelt Rarres1 podocitaspecifikus kiütéses egerekből (Creþ/Rarres1flfl/flafl ) és kontroll alomtársakból (Cres1flR/reflar) flfl ). Bar=10 mm (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=5). (B) A CD{15}}pozitív kapillárisok aránya a peritubuláris területeken. Egerenként harminc peritubuláris területet értékeltünk ki. (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n= 4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Diák t teszt. (C) A CD31 jel szemikvantitatív pontozása glomerulusokban: 0=nincs jel, 1=gyenge jel, 2=közepes jel, 3=erős jel. Minden egérből tíz glomerulus értékelt (NTS Cre–/Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Diák t teszt.

S4 ábra. A fifibrózis, gyulladás és tubuláris sérülés markereinek expressziós szintjei NTS-kezelt egerek veséjében. (A) Reprezentatív konfokális mikroszkópos képek, amelyek a -Sma expresszióját mutatják a vesében NTS-kezelt Rarres1 podocita-specifikus knockout egerekből (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) és kontroll alomtársakból (Cre–/Rarres1flfl/flfl). Bar=100 mm. (B) Különböző gyulladásos, fifibrózisos és vesetubuláris sérülésekkel összefüggő gének relatív mRNS szintjei NTS-sel kezelt egerek vesekéregében. #P < 0.05,="" ##p="">< 0,01="" kontra="" kontroll="" (ctrl.);="" az="" adatokat="" átlag="" ±="" sem-ben="" fejezzük="" ki.="" student-féle="" t-tesztet="" alkalmaztunk="" két="" csoport="" összehasonlítására="" (hamis="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creþ/rarres1flfl/flfl,="" n="3">

S5 ábra. A C31 és az aktivált P65 expressziója NTS-kezelt vesékben. (A) A CD31-pozitív kapillárisok aránya a peritubuláris területeken. Egerenként harminc peritubuláris területet értékeltünk ki (NTS Cre–/Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Student-féle t-próba. (B) A CD31 jel szemikvantitatív pontozása glomerulusokban: 0=nincs jel, 1=gyenge jel, 2=közepes jel, 3 =erős jel. Minden egérből tíz glomerulust értékeltünk ki (NTS Cre –/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n= 4). Student-féle t-próba. (C) Reprezentatív Western blot dokumentumok és összefoglalt adatok, amelyek a pP65 relatív fehérjeszintjét mutatják a vesekéregben NTS-kezelt egerek és kezeletlen kontrollok különböző csoportjaiban (ctrl.) (ctrl., n=3; NTS-ctrl. , n=9; NTS-Rarres1_Döntetlen2_KI, n=10). Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. A diák t-próbáját két csoport összehasonlítására alkalmaztuk.

IRODALOM

1. Reidy K, Kang HM, Hostetter T, Susztak K. Diabéteszes vesebetegség molekuláris mechanizmusai. J Clin Invest. 2014;124:2333–2340.

2. Lai KN, Tang S, Schena F, et al. IgA nefropátia. Nat Rev Dis alapozók. 2016;2:16001.

3. Lal MA, Patrakka J. Podocita biológia megértése új veseterápiák kifejlesztéséhez. Front Endokrinol (Lausanne). 2018;9:409.

4. Ju W, Greene C, Eichinger F és mtsai. A sejttípus-specifitás meghatározása transzkripciós szinten humán betegségekben. Genome Res. 2013;23:1862–1873.

5. Ju W, Nair V, Smith S és mtsai. Az epidermális növekedési faktor szöveti transzkriptom által vezérelt azonosítása krónikus vesebetegség biomarkerként. Sci Transl Med. 2015;7:316ra193.

6. Woroniecka KI, Park A, Mohtat T et al. Humán diabéteszes vesebetegség transzkriptom elemzése. Cukorbetegség. 2011;60:2354–2369.

7. Wiggins JE, Patel S, Shedden K és mtsai. Az NFkappaB elősegíti a gyulladást, a koagulációt és a fifibrózist az öregedő glomerulusban. J Am Soc Nephrol. 2010;21:587–597.

8. Prakoura N, Kavvadas P, Korman R et al. Az NFkappaB által indukált periosztin aktiválja az integrin-béta3 jelátvitelt, hogy elősegítse a vesekárosodást a GN-ben. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1475–1490.

9. Chang AS, Hathaway CK, Smithies O, Kakoki M. Transforming growth factor-beta1 and diabetic nephropathia. Am J Physiol Renal Physiol. 2016;310:F689–F696.

10. Mudge SJ, Paizis K, Auwardt RB et al. A nukleáris faktor-kappa B aktiválása podociták által a passzív Heymann nephritis autológ fázisában. Kidney Int. 2001;59:923–931.

11. Tomita T, Takano M, Tomita R és mtsai. Az NFkappaB transzkripciós faktor csali gátolja a citokin és az adhéziós molekula expresszióját a rheumatoid arthritisből származó szinoviális sejtekben. Reumatológia (Oxford). 2000;39:749–757.

12. Zambrano S, Möller-Hackbarth K, Li X et al. A GPRC5b modulálja a gyulladásos választglomeruláris betegségekNF-kappaB útvonalon keresztül. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1573–1586.

13. Choi M, Schreiber A, Eulenberg-Gustavus C és munkatársai. Az endoteliális NF-kappaB blokád megszünteti az ANCA által kiváltott GN-t. J Am Soc Nephrol. 2017; 28:3191–3204.

14. Zheng L, Sinniah R, Hsu SI. Az aktivált NF-kappaB in situ glomeruláris expressziója humán lupus nephritisben és egy másik nem proliferatív proteinurikus glomerulopathiában. Virchows Arch. 2006;448:172–183.

15. Takemoto M, He L, Norlin J et al. A vese glomerulusok fejlődésében és működésében szerepet játszó gének nagyszabású azonosítása. EMBO J. 2006;25:1160–1174.

16. Saleem MA, O Hare M, Reiser J et al. Feltételesen halhatatlanná tett humán podocita sejtvonal, amely nephrin és podocin expressziót mutat. J Am Soc Nephrol. 2002;13:630–638.

17. Kisanuki YY, Emoto N, Ohuchi T és társai. Alacsony vérnyomás endothelsejt-specifikus endothelin 1 knockout egerekben. Magas vérnyomás. 2010;56:121–128.

18. McAdoo SP, Pusey CD. Anti-glomeruláris alapmembrán betegség. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12:1162–1172.

19. Qi XM, Wang J, Xu XX és munkatársai. Az FK506 csökkenti az albuminuriát azáltal, hogy javítja a podocita nephrin és podocin expresszióját cukorbeteg patkányokban. Inflflamm Res. 2016;65:103–114.

20. Wang X, Saso H, Iwamoto T és munkatársai. A TIG1 elősegíti a gyulladásos emlőrák kialakulását és progresszióját az Axl kináz aktiválásával. Cancer Res. 2013;73:6516–6525.

21. Holland SJ, Pan A, Franci C, et al. Az R428, az Axl-kináz szelektív kis molekulájú inhibitora, blokkolja a tumor terjedését és meghosszabbítja a túlélést az áttétes emlőrák modelljeiben. Cancer Res. 2010;70:1544–1554.

22. Myers SH, Brunton VG, Uniti-Broceta A. AXL-inhibitorok rákban: a gyógyászati ​​kémia perspektívája. J Med. Chem. 2016;59:3593–3608.

23. Salant DJ, Darby C, Couser WG. Kísérleti membrános glomerulonephritis patkányokban. Kvantitatív vizsgálatok a glomeruláris immunlerakódás kialakulásáról izolált glomerulusokban és egész állatokban. J Clin Invest. 1980;66:71–81.

24. Berthier CC, Bethunaickan R, Gonzales-Rivera D, et al. A fajok közötti transzkripciós hálózatelemzés közös gyulladásos válaszokat határoz meg egér és humán lupus nephritis esetén. J Immunol. 2012;189:988–1001.

25. Grayson P, Eddy S, Taroni J és mtsai. Metabolikus útvonalak és immunmetabolizmus ritka vesebetegségekben. Ann Rheum Dis. 2018;77: 1226–1233.

26. Liu P, Lassen E, Nair V és mtsai. A transzkriptomikus és proteomikus profilalkotás betekintést nyújt a mezangiális sejtek működésébe IgA nephropathiában. J Am Soc Nephrol. 2017;28:2961–2972.

27. Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Hatékony szelekció nagy expressziójú transzfektánsokhoz egy új eukarióta vektorral. Gén. 1991;108:193–199.

28. Loefflfler I, Wolf G. Epithelial-to-mesenchymális átmenet diabéteszes nephropathiában: tény vagy fikció? Sejtek. 2015;4:631–652.

29. Nagpal S, Patel S, Asano A et al. Tazaroten-indukált gén 1 (TIG1), egy újretinsavreceptor-érzékeny gén a bőrben. J Invest Dermatol. 1996;106:269–274.

30. Jing C, El-Ghany M, Beesley C és mtsai. A tazarotén által kiváltott 1-es gén (TIG1) expressziója prosztata karcinómákban és kapcsolata a tumorogenitással. J Natl Cancer Inst. 2002;94:482–490.

31. Teufel A, Becker D, Weber SN és mtsai. A RARRES1 azonosítása a májfifibrózis központi szabályozójaként. J Mol Med (Berl). 2012;90:1439–1447.

32. Chen A, Feng Y, Lai H és mtsai. Az oldható RARRES1 elősegíti a podocita apoptózistglomeruláris betegségprogresszió. J Clin Invest. 2020;130:5523–5535.

33. Zhen Y, Lee IJ, Finkelman FD, Shao WH. Az Axl receptor tirozin kináz célzott gátlása javítja az anti-GBM által kiváltott lupus-szerű nephritist. J Autoimmun. 2018;93:37–44.

34. Tang Y, Harrington A, Yang X és mtsai. A Tie2® vonal hozzájárulása a primitív és végleges vérképzősejtekhez. Genesis. 2010;48:563–567