A szén-monoxid (CO) hatékonyan enyhíti a diabéteszes nephropathiát (DN).
Mar 16, 2022
további információ:ali.ma@wecistanche.com
Ⅰ rész: A szén-monoxid enyhíti a diabéteszes nephropathia öregedését az autofágia javításával
Guibin Meil; Chunjie Jiang; Xueer Cheng; & at al.V
BEVEZETÉS
Diabéteszes nefropátia (DN) az egyik leggyakoribb és legsúlyosabb diabéteszes mikrovaszkuláris szövődmény. Statisztikailag a DN-ben szenvedő betegek 20 százaléka -40 százalékaDiabéteszes nefropátia) 14-szer gyorsabban fejlődik végstádiumú vesebetegséggé (ESRD), mint más vesebetegségek. Ezenkívül a DN fokozott kardiovaszkuláris kockázata (Diabéteszes nefropátia)betegek nagyban hozzájárul a magas mortalitáshoz.2A DN összetett patogenezise (Diabéteszes nefropátia)még mindig nem világos a rendelkezésre álló korlátozott kezelési megközelítés miatt. Ezért sürgősen azonosítani kell a patogenezist és a terápiás ágenseket a DN vesefunkciójának fokozatos elvesztésének megelőzésére. (Diabéteszes nefropátia).
Az öregedő sejtek, amelyeket a sejtciklus állandó leállása jellemez, „zombi sejtekként” széles körben felkeltették a figyelmet. Az apoptózissal szembeni rezisztencia és az öregedéssel összefüggő szekréciós fenotípus (SASP) folyamatos termelődése miatt az öregedő sejteket egyre inkább az életkorral összefüggő betegségek döntő okának tekintik. Az öregedéssel összefüggő veseműködési zavart gyakran figyelték meg a DN-ben (Diabéteszes nefropátia)betegek és kísérleti modellek, például STZ-indukált (1-es típusú cukorbetegség (T1D)) és db/db (2-es típusú cukorbetegség (T2D)) egerek. Fontos, hogy az idős egerek p16-pozitív sejtjeinek kiürülése javította a glomerulosclerosis kialakulását. Ezenkívül a p21 vagy p27 kiütése T1D egerekben enyhítette a proteinuriát és a glomeruláris dilatációt. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az öregedés fontos szerepet játszik a DN patogenezisében (Diabéteszes nefropátia). Az öregedés szabályozása azonban a DN-ben (Diabéteszes nefropátia)homályos marad.
Az újonnan felbukkanó bizonyítékok azt mutatták, hogy az autofágia, az intracelluláris tartalom lebomlásának mechanizmusa érvényes öregedésszabályozó." Bár arról számoltak be, hogy az autofágia elősegíti az öregedési fenotípus megszerzését, az autofágia öregedésgátló hatása szélesebb körben elfogadott. Az autofágia meghosszabbította az idős egerek és a legyek élettartamát.10 További vizsgálatok kimutatták, hogy az Atg7 kiütése súlyosbította az őssejtek öregedését.11 Ennél is fontosabb, hogy az Atg5 deléciója súlyosbította a proteinuriát és a fibrózist.vese12.13 Így az autofágiát célzó gyógyszerek az öregedés enyhítésére a DN egyik legígéretesebb stratégiája lehet. (Diabéteszes nefropátia)megelőzés és kezelés.
Szén-monoxid (COA hem oxigenáz enzimek által a hem katabolizmusa során keletkező ) endogén gáznemű molekula. Számos publikáció feltárta a CO gyulladáscsökkentő, antiapoptotikus és egyéb védő tulajdonságait.Szén-monoxid) kis dózisban alkalmazva.14 Bár CO (Szén-monoxid)alaposan tanulmányozták, hogy renoprotekciót biztosítson ischaemia-reperfúzióra vagyvesetranszplantációs egerek,15 a CO hatása és mechanizmusa (Szén-monoxid)a DN-en (Diabéteszes nefropátia)tisztázatlanok. A közelmúltban a szakirodalom kimutatta, hogy a CO (Szén-monoxid)autofágia aktivátorként citoprotektív szerepet kölcsönzött a hipoxia által kiváltott szigetecskékben,16 szepszises egerekben7 és szívleállásban szenvedő idős patkányokban.18 Ezenkívül a CO beadása (Szén-monoxid)enyhítette az endothel sejtek gyógyszertoxicitás által okozott öregedését.1 Ezek az eredmények láthatóan elősegítik a CO által megcélzott autofágia lehetséges közvetítését (Szén-monoxid)az öregedés enyhítésére.
Ezért azt feltételeztük, hogy az öregedő sejtek felhalmozódása avesea DN (Diabéteszes nefropátia)az egereket a CO visszafordíthatja (Szén-monoxid)autofágia aktiválása révén, ezt követően javítva a veseműködési zavarokat. Hipotézisünk tesztelésére és a mögöttes mechanizmusok feltárására a szén-monoxid-felszabadító molekula-2 (CORM-2) kezelését alkalmaztuk in vivo (a kísérleti DN). (Diabéteszes nefropátia)egerek) és in vitro (patkány mezangiális sejtek, humán tubuláris epiteliális sejtek és humán podocita).
Veseműködés: hogyan hat a szén-monoxid (CO)Diabéteszes nefropátia (DN)
Kattintson a Cistanches és Cistanche termékek vesebetegségre
ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
2.1|Állatkísérleti tervezés
Nyolc hetes hím C57BL/6J egereket (Charles River) normál világos/sötét ciklusban (12:12 óra) tartottak normál étrenddel (ND) vagy magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) (60 százalékos energia zsírból). ) 16 hétig.20 A vizsgálat 17. hetében a HFD-vel táplált egerek intraperitoneális STZ-injekciót (50 mg/kg) kaptak 7 napon keresztül, míg az ND-ben szenvedő egerek vivőanyagot (citrát puffer, pH{13}}) .5). Egy héttel az injekció beadása után egy farokszúrás vércukorszintjét kétszer mértük 24 órás időközönként. Ezután a DN (Diabéteszes nefropátia)a 16,9 mmol/l vagy annál magasabb glükózszintű egereket véletlenszerűen három csoportra osztották, mindegyik csoportban 15 állat volt (DN (Diabéteszes nefropátia), DN (Diabéteszes nefropátia)plusz CO és DN (Diabéteszes nefropátia)plusz iCO): a DN-kontrollnak nevezett csoport és más csoportok, akiket intraperitoneális injekciókkal kezeltek (hetente kétszer 16 héten át) CORM-2 (3 mg/kg) vagy érvénytelen CORM{4}}, amely CO kibocsátásával állítják elő (Szén-monoxid)a CORM{0}}-tól szobahőmérsékleten. A kísérleti időszak végén az egereket elaltattuk, a szemgolyók enukleációjával vérmintákat vettünk, és a veséket analízis céljából begyűjtöttük. Minden állatot az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete által közzétett, a laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó irányadó elvek szerint kezeltek, és az összes állatkísérletet jóváhagyta a Tongji Medical College Council on Animals Care Committee-je.
2.2|Plazma biokémiai és szövettani elemzés
Az összegyűjtött teljes vért és szérumot -80 fokon tároltuk elemzés céljából. A vér karbamid-nitrogénjét (BUN) a kereskedelemben kapható vizsgálati készletekkel (Jiancheng Bioengineering Institute, Kína) mérték. A vesék eltávolítása után a felületet sóoldattal mostuk. A veseszövetet hematoxilin-eozinnal és Masson-féle trikrómfestékkel festettük, végül mikroszkóppal figyeltük meg.
2,3|Elektronmikroszkópia
A vesekéreg kis darabjait glutáraldehidben (2,5%) rögzítettük, és Aralditba ágyaztuk. A szövetet ultravékony metszetekre (80-100 nm) polimerizáltuk ultramikrotómmal (Leica EM UC7). A rézhálón lévő vékony szeleteket megfestettük és transzmissziós elektronmikroszkóppal (Tecnai G220 TWIN) figyeltük meg.
2,4|Nyírási hullám elasztográfia
A kísérleti időszak végén az egereket elaltatták, és az ultrahangos laboratóriumba (Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Kína) küldték nyíróhullám-elasztográfiára, egy rövid távcsővel (Supersonic Imagine). A vese parenchyma merevségének mérésére az átlagos Young-modulust (Eman) alkalmaztuk.
2,5|SA- -gal festés
Fagyottveseegy 6-lyuklemezre oltott metszeteket és sejteket használtuk fel az SA- -gal aktivitás kimutatására egy kereskedelmi készlettel (Beyotime Biotechnology), a gyártó utasításai szerint. A kék foltot az öregedő sejtek akkumulációs területének tekintettük.
2,6|Valós idejű kvantitatív PCR az mRNS expressziójához
Az utasítások szerint (TaKaRa BIO INC) a veseszövet RNS-ét a TRlzol reagenssel extraháltuk. Az mRNS expresszióját TB zöld alapú gRT-PCR kittel és specifikus primerekkel határoztuk meg (1. táblázat). Mindegyik génexpressziót a saját standard görbéivel értékeltük, és a Gapdh mRNS szintjét endogén kontrollként számszerűsítettük.
2,7|Western blot és immunprecipitáció
A veseszövetet vagy -sejtet homogenizáltuk és lizáltuk, majd BCA protein assay kittel (Beyotime Biotechnology) mennyiségileg meghatároztuk. A fehérjét elválasztottuk, majd a PVDF membránokra (Millipore) vittük át. A blokkolást követően a membránokat egy éjszakán át elsődleges antitestekkel inkubáltuk (2. táblázat). Mosás után a membránokat megfelelő másodlagos antitesttel inkubáltuk. Az egyes célsávok sűrűségét Image Pro-Plus 6.0 szoftverrel számszerűsítettük, és optikai sűrűségként GAPDH-ra normalizáltuk. Az állatok vagy sejtek összes mintamérete 3-nál nagyobb vagy egyenlő volt.
A veseszövet lizátumát centrifugáltuk (14 000 g 4 °C-on 30 percig), a felülúszót 20 μL protein A/G agarózgyöngyökkel előtisztítottuk 2 órán át, majd egy éjszakán át inkubáltuk Bcl{{6} } vagy egér lgG antitest. Az immunprecipitátumokat mostuk, újraszuszpendáltuk, felforraltuk, és Western-blot segítségével elemeztük anti-Beclin-1 (Cell Signaling Technology) és anti-Bcl-2 (Proteintech) alkalmazásával, a korábban leírtak szerint. .21
1. TÁBLÁZAT Valós idejű kvantitatív PCR primer szekvenciák
2,8|Immunfluoreszcencia
Az OCT táptalajba ágyazott veseszövetet 6-8 μm vastagságú fagyasztott metszetekre vágtuk. 10%-os normál kecskeszérummal való blokkolást követően a metszeteket egy éjszakán át inkubáltuk elsődleges antitestekkel. A következő napon a szövetet másodlagos antitestekkel jelöltük. PBS-sel történő öblítés után a lemezeket DAPI-val inkubáltuk, majd fluoreszcens mikroszkóp alatt (Olympus) fényképeztük.
2,9|Sejttenyésztés
A HBZY-1-t DMEM-ben (Gibco), a HK-2-ot pedig DMEM/F12-ben (Gibco) tartottuk fenn 10 százalék magzati szarvasmarha-szérummal, 100 U ml-1 penicillin/sztreptomicinnel (Gibco) kiegészítve. ) 37 fokon, 95 százalék levegőt és 5 százalék CO-t tartalmazó párásított atmoszférában (Szén-monoxid). A Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem Chun Zhang professzora által biztosított HPC-t az RPMI 1640-ben (Gibco) tartották fenn. A HPC-t először 33 fokon szaporították, majd 37 fokra vitték át a differenciálódás érdekében, mielőtt a korábban leírt kísérletekben felhasználhatták volna.22
2.10|ELIS Assay
Miután a HPC-t másképpen kezeltük és 5 napig tenyésztettük, a felülúszó felét eltávolítottuk kimutatás céljából (felszabadult VEGF). A sejteket ultrahangos sejttörővel (SONICS) törtük, lehetővé téve a fehérjék teljes felszabadulását a maradék felülúszóba (teljes VEGF). Ezután a VEGF-koncentrációkat kereskedelmi forgalomban lévő ELISA készlettel (MEIMIAN) mértük. A felszabaduló VEGF és a teljes VEGF aránya a VEGF szivárgási arány volt.
2,11|Géncsillapítás
Az Atg7 leütését HK-2 sejtekben hatlyukú lemezeken végzett reverz siRNS transzfekciós eljárással érték el. Miután a sejteket 70 százalékos összefolyásig növesztettük, siRNS-sel vagy kódolt siRNS-sel (RiboBio) transzfektáltuk Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó protokollja szerint. 48 órás transzfekció után a transzfekció hatékonyságát Western blot segítségével ellenőriztük a szekvencia validálására (ACTCGAGTCTTTCAAGACT).
2. TÁBLÁZAT Minden antitestlista
2,12|Kövesse az autofág fluxust
Az RFP-GFP-LC3 (Genecopoeia) lentivírus vektort tartalmazó plazmidokat a gyártó utasításai szerint (GeneCopoeia) elkészítettük, majd HEK293T sejtekbe csomagoltuk. A vírus felülúszóját összegyűjtöttük, hogy megfertőzzük a HK-2 és HBZY-1 sejteket, és nyomon követjük az autofágia áramlását. Ez a próba megkülönbözteti az autofagoszómákat (GFP*/RFPt, sárga pont) és az autolizoszómákat (GFP-/RFPt, vörös pont).
2,13|Adatelemzés
Az adatokat Graph Pad Prism8 segítségével elemeztük, és átlag ± SEM-ként mutattuk be. A csoportok közötti különbségeket egyirányú varianciaanalízissel határoztuk meg. A jelentőségét P-ben határozták meg<>
EREDMÉNYEK
3.1|CO (Szén-monoxid)a DN legyengített veseműködési zavara (Diabéteszes nefropátia)egerek
A CO újravédelmének feltárása (Szén-monoxid), a DN (Diabéteszes nefropátia)modellt HFD és STZ indukálta (1A. ábra). 34 hét kísérleti etetés után a vércukorszint, a testsúly, avese-testarányt, kreatinint és BUN-t mértek. A DN-ben (Diabéteszes nefropátia)csoport,vese-testarány, kreatinin és BUN emelkedett, míg a CO kezelése (Szén-monoxid)fordított rendellenességek (3. táblázat). Következetesen a DN vesemorfológiája (Diabéteszes nefropátia)Az egerek rendkívül rendezetlenek voltak a hámsejtek hámlása, vakuoláris degenerációja, a glomeruláris Bowman-tér megnagyobbodása és a mezangiális expanzió miatt (1B. ábra). Ezenkívül a glomerulus ultrastruktúrája az alapmembrán megvastagodását és a podocita lábfolyamat kiürülését mutatta (1B. ábra). Éppen ellenkezőleg, CO (Szén-monoxid)A kezelés a negatív morfológiai változások felett normalizálódott (1B. ábra). Ezenkívül a vesekéregben lerakódott fibrilláris kollagén (1C. ábra) és a nyíróhullám-elasztográfiával mért vesekeménység egyaránt nőtt a DN-ben (Diabéteszes nefropátia)egerek (1D. ábra). Ahogy az várható volt, CO (Szén-monoxid)jelentősen javult a DN veseműködési zavara (Diabéteszes nefropátia)beleértve a fibrózist is.
1. ÁBRA CO (Szén-monoxid)a DN legyengített veseműködési zavara (Diabéteszes nefropátia)HFD és STZ által indukált egerek.
A kísérleti tervezés sémája. B, Reprezentatív képek aveseH&E-vel (skála: 50 μm), PAS-szal (skála: 10 μm) és transzmissziós elektronmikroszkóppal értékelt glomeruláris morfológiai ultrastrukturális változásokkal (skála: 1 μm) festett szövet.
És a statisztikai adatok a PAS-pozitív és a glomeruláris terület arányáról, a GBM vastagságáról, a lábnyúlvány szélességéről és a lábnyúlványok számáról GBM mm-enként (n=3).
C, A Masson-féle trikrómmal festett veseszövet reprezentatív képei és a pozitív terület statisztikai adatai (n=3). Skála: 25 μm.
D, Nyíróhullámú elasztográfia szonoszkóp segítségével és a Young-modulus mennyiségi meghatározása a vesefibrózis mértékeként (n=7). *P < ,05,="" **p="">< ,01,="" ***p=""><>
3. TÁBLÁZAT Az egerek metabolikus adatai minden csoportban
3.2|CO (Szén-monoxid)enyhült öregedés a DN-ben (Diabéteszes nefropátia)magas glükózzal kiváltott egerek és vesesejtek
Az öregedést egyre inkább a vesefibrózis fő okának tekintik, ami az öregedés egyik jellemzője.23 A CO öregedésgátló hatásának vizsgálata (Szén-monoxid), SA{0}}gal festést végeztünk a vesén. A megnövekedett SA- -gal* és p16* sejtek felhalmozódtak a vesekéregben a DN-ben (Diabéteszes nefropátia)csoport, míg a kontroll és a CO (Szén-monoxid)-a kezelt vesék esetenként pozitivitást mutattak (2A, B ábra). A vese anatómiai helyzetéből a p16 pozitív expresszióját mutatták ki a mezangiális sejtekben (sárga nyíl), a vese tubuláris epiteliális sejtjeiben (piros nyíl) és a podocitákban (fekete nyíl). DN-ben bekövetkezett öregedés (Diabéteszes nefropátia)Az egereket tovább támasztotta a klasszikus öregedéssel összefüggő fehérjék, köztük a p53, p21 és p16 nyilvánvaló felszabályozása (2C. ábra). Ezzel szemben a CO beadása (Szén-monoxid)enyhítette a fenti öregedő teljesítményt.
Az öregedéssel kapcsolatos szekréciós fenotípusról, az öregedő sejtek jellegzetes szekréciójáról számoltak be, hogy megzavarja a mikrokörnyezetet és elősegíti a betegség progresszióját.2 Ezért néhány reprezentatív SASP mRNS-szintjét mértük, beleértve az I-1, Il-6 , Tgf- , Tnf-a, Vegf, Icam-1 és Vcam-1. Az eredmények azt mutatták, hogy ennek a SASP-nek a rendellenes növekedését a CO megakadályozta (Szén-monoxid)beavatkozás (2D ábra).
Tekintettel a CO elnyomó öregedésére (Szén-monoxid)in vivo tovább vizsgáljuk öregedésgátló hatását 3 típusú vesesejtek in vitro modelljére, beleértve a patkány mezangiális sejteket (HBZY-1), a humán tubuláris epiteliális sejteket (HK-2) és a humán podocitákat. (HPC). A magas glükózszintnek (HG, 35 mmol/L) való expozíciót követően háromféle sejt mutatta az SA- -gal növekedését nagyobb morfológiával a 7. napon (2E. ábra), az 5. napon és a 14. napon (2l. ábra). , ill. Nevezetesen, a HBZY-1 LDH-szivárgási arányának növekedése azt jelezte, hogy a HG-indukálta sejtek öregedését és károsodását (2F. ábra). A megfelelő CO-dózis vizsgálatához (Szén-monoxid), a HBZY-1-t különböző koncentrációjú CORM-2-val kezelték. Az LDH (2F. ábra), az EdU-pozitív sejtek (2G. ábra) és az SA- -gal (2H. ábra) szivárgási sebességének mérésével azt találtuk, hogy az 1 μmol/L koncentráció jobb beavatkozási hatást fejt ki. Következetesen a CO (Szén-monoxid)(1 μmol/L) szintén csökkentette a SA- -gal pozitív expresszióját HK-2-ban és HPC-ben (2. ábra). Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CO (Szén-monoxid)figyelemre méltó öregedésgátló szerepet játszott mind in vivo, mind in vitro.
2. ÁBRA CO (Szén-monoxid)enyhült öregedés a DN-ben (Diabéteszes nefropátia)HG-vel fertőzött egerek és vesesejtek.
A, reprezentatív képeveseSA- -gal festett szövetet és a pozitív terület statisztikai adatait (n=3). A glomerulust a piros pontozott kör jelezte. Skála: 25 μm.
B, A p16 pozitív expressziója aveseimmunhisztokémiával kimutatták (n=3). A sárga nyilak a mezangiális sejteket, a piros a vese tubuláris epiteliális sejteket, a fekete nyilak a podocitákat jelezték. Skála: 25 μm.
C, A p53, p21 és p16 immunoblottjaival és denzitometriás elemzésével meghatározott öregedési markerek fehérjeszintjei (n=3).
D, A SASP mRNS expressziós szintjének hajtása (Il-1, Il-6, Tgf-, Tnf-, Vegf, Icam-1 és Vcam-1) (n 4-nél nagyobb vagy egyenlő).
Az NG-nek (5 mmol/L) vagy HG-nek (35 mmol/L) kitett E, HBZY{{0}} SA- -gal-lal festődött a 0. naptól a 7. napig, és az SA statisztikai adatai - -gal-pozitív sejtek 5. és 7. napon (n=3). Skála: 50 μm.
F, A HBZY{{0}} LDH felszabadulási sebessége különböző koncentrációjú CORM-2 (0,1, 1, 10 és 100 μmol/L) esetén (n=6).
G, Az EdU-pozitív HBZY-1 különböző koncentrációival kezelt CORM-2 aránya (n=3).
H, SA- -gal festődés HBZY-1-ban, különböző koncentrációjú CORM-2 kezelésben (n=3). Skála: 50 μm.
I. A HPC SA- -gal (5. nap) és HK-2 (14. nap) reprezentatív képei CORM-2 (1 μmol/L) beadásával és statisztikai adatok (n { {6}}). Skála: 50 μm. *P < ,05,="" **p="">< ,01,="" ***p=""><>
3,3|CO (Szén-monoxid)aktiválta az autofágiát és javította az autofágia áramlását in vivo és in vitro
Egyre több kutatás tárta fel az autofágia negatív szabályozását az öregedésig és a CO-ig (Szén-monoxid)autofágia aktivátornak tekintik. A COon autofágia hatásainak feltárása DN-ben (Diabéteszes nefropátia), egy sor autofágiával kapcsolatos fehérjét mértek. A cukorbeteg egerekhez képest a CO (Szén-monoxid)A kezelés szignifikánsan növelte a Beclin{0}} autofágia iniciációs fehérje expresszióját (3A. ábra) és csökkentette a p62 autofágia szubsztrátot (3B. ábra), de csökkentette az LC3Il és az LC3l arányát, amely az autofagoszóma markere (3C. ábra). Korábbi bizonyítékok azt sugallták, hogy ez az ellentmondás a lizoszóma diszfunkciója miatti blokkolt autofágia-áramlásnak tulajdonítható.25 Az eredmények azt mutatták, hogy a lizoszómához kapcsolódó fehérjék katepszin B és LAMP2 szintje megnövekedett a DN-ben. (Diabéteszes nefropátia)plusz CO-csoport a DN-hez képest (Diabéteszes nefropátia)csoport (3D. ábra). Ezenkívül az LC3 puncta és a LAMP2 együttes lokalizációs elemzése alátámasztotta, hogy a CO (Szén-monoxid)jelentősen csökkentette az autofagoszómák felhalmozódását és növelte az autolizoszómák számát (3E. ábra).
Következetesen az autofágia és a lizoszóma diszfunkcióját találták in vitro, amint azt a fehérjeszintek és a lizoszómális próbák mutatják (3F, G ábra). Továbbá a HK-2 és a HBZY-1 RFP-GFP-LC3 lentivírussal transzfektáltuk az autofágia áramlásának megfigyelésére. HG állapotában az autofagoszómák pontjai megnövekedtek és az autolizoszómák csökkentek HBZY-1-ban és HK-2-ban, amit a klorokin (CQ) kezelés nem változtatott tovább. CO (Szén-monoxid)növelte az autolizoszómák számát és csökkentette az autofagoszómákat, amit a CQ hozzáadása gátolt (3H. ábra, I). Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatták, hogy a CO (Szén-monoxid)aktiválta az autofágiát és javította az autofágia áramlását in vivo és in vitro.
3.4|CO (Szén-monoxid)enyhítette az öregedést az autofágia in vitro javításával
Az autofágia szerepének további feltárása a CO öregedésgátló mechanizmusában (Szén-monoxid), a CORM{0}} és az autofágia-gátlók kombinációját alkalmazták a HG-nek kitett vesesejtekben. Kétféle inhibitor, a wortmannin (WORT), amely blokkolja az autofágia beindulását, és a CQ, amely újrafeszíti az autofágia áramlását, hatékonyan visszafordította az SA- -gal CO általi csökkentését. (Szén-monoxid)3 típusú vesesejtekben (4A ábra). Következetesen a CO (Szén-monoxid)szignifikánsan megnövelte az EdU sejtek arányát, amit két inhibitor gátolt a HBZY-1(4B. ábra) és a HK-2(4C. ábra). A HBZY-1 esetében az öregedést enyhítő hatás a CO (Szén-monoxid), amit a p53, p21 és p16 csökkent expressziója mutat, az autofágia-gátlók hozzáadása után hiányzott (4D ábra). Hasonlóképpen, az immunfluoreszcencia analízis kimutatta, hogy az autofágia-gátlók blokkolják a p53- és p16- pozitív sejtek CO általi csökkenését. (Szén-monoxid)HK-2 (4. ábra印) és HPC (4F. ábra). Továbbá az Atg7 csendje (4G. ábra) blokkolta a CO védő hatásait (Szén-monoxid), amit a megnövekedett SA- -galt sejtek és a csökkent EdU*sejtek mutatnak a HK-2-ban (4H. ábra). A fent említett eredmények arra utalnak, hogy CO (Szén-monoxid)elnyomta az öregedést az autofágia javításával.
3,5|Az aktivált autofágia lebonthatja a SASP-t a DN-ben (Diabéteszes nefropátia)egerek
Tovább vizsgáltuk az autofágia és az öregedés közötti specifikus kapcsolatot. A kutatások kimutatták, hogy az autofágia enyhítette az öregedést azáltal, hogy szelektíven lebontotta a GATA4-et, amely pozitívan szabályozta az NF-KB-t a SASP felszabadítása érdekében.26 Ezzel összhangban nagy mennyiségű SASP fejlődött ki a DN-ben. (Diabéteszes nefropátia)csoportban (2D. ábra), és a p65 expressziója és nukleáris transzlokációja megnövekedett (5A. ábra). A GATA4 fehérjeszintje azonban változatlan maradt, ami arra utal, hogy a GATA4 nem közvetíti a SASP képződését magas glükóz állapotban (5B. ábra). Ezenkívül a vizsgálatok kimutatták, hogy az mTOR, a késői autofagoszóma és a lizoszóma kombinációjából létrejött TOR-autofágia térbeli csatolási kompartment (TASCC) felgyorsította az öregedést azáltal, hogy növelte a SASP szekrécióját.27 Az immunfluoreszcencia eredmények azonban azt mutatták, hogy az mTOR, LC3, nem volt hármas kolokalizáció. , és LAMP2, ami a TASCC sikertelen képződését jelzi a vesékben (5C. ábra).
Mint tudjuk, az autofágia a citoszol alkotórészek lebontásában működik, amelyet főként az autofagoszóma és a lizoszóma fúziójával létrejövő autolizoszóma hajt végre. Beszámoltak arról, hogy az autofágia csökkenti az IL-1 szekrécióját a pro-IL-1 lebontásával az LPS-stimulált makrofágokban.28 Érdekes módon azt találtuk, hogy az IL-1 (zöld) egy helyen található. LC3 punctával (piros) és LAMP2-vel (rózsaszín) a CON és a DN-ben (Diabéteszes nefropátia)plusz CO (Szén-monoxid)csoportok (5D. ábra, piros nyíl), jelezve a SASP és az autofágia degradáció közötti metszéspontot. Hasonlóképpen a DN-hez képest (Diabéteszes nefropátia)csoportban, a SASP egyéb citokinjei, beleértve az IL{0}}-t, a TGF-et és a VEGF-et, szintén szerény, de nyilvánvaló együttes lokalizációt mutattak az LC3 ponttal és a LAMP2-vel a CON-ban és a DN-ben és a CO-ban. (Szén-monoxid)csoportok (5E-G ábra, a piros nyíl), amelyek közül a VEGF a legnyilvánvalóbban autolizoszómákkal együtt lokalizált (5G. ábra). Azonban az átfedő sárga festés a DN-ben (Diabéteszes nefropátia)csoport azt mutatta, hogy a SASP csak az LC3 puncta-val együtt volt (5D-G ábra, a fehér nyíl). Továbbá a VEGF fehérjeszintjét HPC-ben mértük autofágia agonisták (ABT737 és rapamicin) vagy CORM{5}} hozzáadása után. Bár nem volt szignifikáns különbség a VEGF összfehérje szintjében (5H. ábra), mind az autofágia agonisták, mind a CO jelenléte (Szén-monoxid)jelentősen csökkentette a VEGF felszabadulását a HG által indukált HPC-ben (5I. ábra, J). Összességében ezek az eredmények azt mutatták, hogy néhány SASP lebomlik az autofágia révén.
4. ÁBRA CO (Szén-monoxid)enyhítette az öregedést az autofágia in vitro javításával. A HBZY-1-t, a HPC-t és a HK-2-t HG-vel, CORM-2-val és autofágia-gátlókkal kezelték (WORT: 200 nM és CQ: 5 μmol/L).
A, Az SA- -gal festődése és pozitív sejtjei 3 féle vesesejtekben (n=3). Skála: 25 μm.
B, C, EdU-festéssel értékelt sejtproliferáció HBZY-1-ban és HK-2-ban, valamint a pozitív sejtek arányának mennyiségi meghatározása (n=3). Skála: 50 μm.
D: Az öregedéssel kapcsolatos fehérje (p53, p16 és p21) expressziója HBZY-1-ban (n=5).
E, F, A p53 és p16 reprezentatív immunfluoreszcenciás képei és a pozitív sejtek arányának mennyiségi meghatározása HK-2-ban és HPC-ben (n=3). Skála: 50 μm.
G, Az Atg7 fehérje expressziós szintjei siRNS-sel elhallgatva HK-2-ban (három szekvencia).
H, A SA- -gal (Skála: 50 μm) és az EdU festés (Skála: 25 μm) reprezentatív képei, valamint a HK-2 pozitív sejtek arányának számszerűsítése (n {{4) }}). *P < ,05,="" **p="">< ,01,="" ***p=""><>
3,6|CO (Szén-monoxid)aktivált autofágia részben a Beclin-1-Bcl-2 komplex disszociációjával
A Beclin{0}}Bcl-2 komplex disszociációja javítja az autofágiát, valamint megakadályozza a korai öregedést, beleértve az életkorral összefüggő veseelváltozásokat.21 Ezenkívül a CO (Szén-monoxid)aktiválta az autofágiát a Beclin{0}} révén a szepszis egerekben.1/Ezért megvizsgáltuk, hogy a komplex disszociációja hozzájárul-e az autofágia CO általi aktiválásához (Szén-monoxid). A koimmunprecipitációs eredmények azt mutatták, hogy a CO (Szén-monoxid)csökkentett Beclin-1-Bcl-2 kötődés a DN-ben (Diabéteszes nefropátia) egerek (6A ábra). Továbbá, összehasonlítva a HG és a CO kezelésével (Szén-monoxid), a HG, CO kombinált használata (Szén-monoxid), valamint a Beclin-1-Bcl-2 komplex disszociációs ágens, az ABT737 tovább aktiválta a HBZY-1 autofágiáját, amit a változatlan LAMP2, csökkent p62 és megnövelt LC3ll/LC3l arány bizonyít (6B. ábra). Ezenkívül az eredmények azt mutatták, hogy a CO kombinált használata (Szén-monoxid)és az ABT737 tovább csökkentette a p53, p21 és p16 expresszióját HBZY-1-ban (6C. ábra), és csökkentette az SA- -galt sejtet a HBZY-1-ban, HK{{9} } és HPC (6D. ábra), ami azt jelzi, hogy az ABT737 fokozta a CO öregedésgátló hatását (Szén-monoxid). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy CO (Szén-monoxid)aktiválhatja az autofágiát a Beclin{0}}Bcl-2 komplex disszociációjával, hogy enyhítse az öregedést.
