Laccase-Mediátor rendszer természetes közvetítőt használó fehérítőszerként a melanin elszíntelenítésére 1. rész
Apr 27, 2023
Absztrakt: Ebben a tanulmányban egy természetes közvetítőt használó lakkáz-mediátor rendszert (LMS) fejlesztettek ki fehérítőszerként a melanin elszíntelenítésére. Hét természetes mediátort alkalmaztak a szintetikus mediátorok helyettesítésére, és sikeresen leküzdve a lakkáz alacsony redoxpotenciálját és a melanin korlátozott hozzáférését a lakkáz aktív helyéhez. A Trametes versicolor (lacT) és a Myceliophthora thermophila (lacM) lakkázok melanin elszíneződési aktivitása szignifikánsan fokozódott természetes mediátorok, köztük acetosyringon, syringaldehid és acetovanillon alkalmazásával, amelyek alacsony citotoxicitást mutattak. A természetes mediátorok metoxi- és ketoncsoportjai fontos szerepet játszanak a melanin elszíneződésében. A lacT és lacM melanin elszíneződésére vonatkozó specificitási állandója 247-tel, illetve 334-gyel nőtt, amikor acetosyringont alkalmaztunk mediátorként. A csipkét és acetosyringont használó LMS a cellulóz hidrogél filmben lévő melanint is elszíntelenítheti, ami a bőr állapotát utánozza. Ezenkívül az LMS nemcsak a tirozin oxidációjával előállított szintetikus eumelanin analógokat, hanem a melanomasejtek által termelt természetes melanint is elszíntelenítheti.
A vonatkozó tanulmányok szerintcistancheegy közönséges gyógynövény, amelyet "az életet meghosszabbító csodanövényként" ismernek. Fő összetevője azcisztanozid, melynek különféle hatásai vannak, mint plantioxidáns, gyulladáscsökkentő, ésaz immunrendszer működésének elősegítése. A mechanizmus a cistanche ésbőrfehérítésa cistanche antioxidáns hatásában rejlikglikozidok. Melaninaz emberi bőrben a tirozin oxidációja révén keletkezik, amelyet atirozináz, az oxidációs reakcióhoz pedig oxigén részvétele szükséges, így a szervezetben lévő oxigénmentes gyökök a melanintermelést befolyásoló fontos tényezővé válnak. A Cistanche tartalmazcisztanozid, amely antioxidáns és képes csökkenteni a szabad gyökök képződését a szervezetben, ígygátolja a melanin termelését.
Kattintson a Rou Cong Rong előnyei a fehérítéshez elemre
További információért:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
1. Bemutatkozás
A lakkázok (EC 1.10.3.2, benzoldiol: dioxigén oxidoreduktázok) olyan multiréz fehérjék, amelyek katalizálják a különböző fenolos és nem fenolos vegyületek oxidációját egy gyök által katalizált reakciómechanizmuson keresztül a molekuláris oxigén redukciójával [1,2]. A lakkázokat biokatalizátorként használták olyan biológiai lebontási folyamatokhoz, mint a festékek [3,4], a gyógyszerek [5,6], a herbicidek [7] és a lignifikáció [8–10] bioremediációja. A lakkázokat festékprekurzorok és szerves vegyületek polimerizációjának katalizálására is alkalmazták [11]. Különösen vonzó tulajdonságaik, mint például az alacsony szubsztrát-specifitás, az oxigén felhasználása végső elektronakceptorként, víz keletkezése melléktermékként, valamint a peroxidok iránti igény hiánya (vagy termelés hiánya) teszik érdekessé őket a biotechnológiai, ill. környezeti területek [1,11,12].
Az aktív helyen négy rézion vesz részt a lakkáz katalitikus aktivitásában. A "kék" réz (T1 hely) oxidálja a szubsztrátot, és a hárommagvú rézklaszter (T2/T3) fogadja az elektronokat a T1 helyről, hogy redukálja a molekuláris oxigént [1,12,13]. A T1 hely Cu redoxpotenciálját tekintik fő tényezőnek a lakkázok katalitikus képességének meghatározásában [14]. A lakkázok viszonylag alacsony redoxpotenciállal (0,4–0,8 V) rendelkeznek a ligninolitikus peroxidázokhoz (1 V felett), mint például a mangán-peroxidáz és a lignin-peroxidáz. A lakkázok nem képesek közvetlenül oxidálni az 1,3 V feletti redoxpotenciálú, nem fenolos szubsztrátumokat [13,14]. Ezért a lakkáz korlátainak leküzdése érdekében a lakkáz-közvetítő rendszerek (LMS) olyan kis molekulájú vegyületeket használnak, mint a 2,20 -azinobis(3- etilbenztiazolin-6-szulfonát) (ABTS), { {24}}hidroxi-benzotriazolt (HOBt), violursavat (VLA), N-hidroxi-ftálimidet (HPI), N-hidroxi-acetanilidet (NHA) és TEMPO-t javasoltak, amelyek redox mediátorként működnek [15–17].
Ezek a mediátorok lehetővé teszik a terjedelmes vegyületek oxidációját különböző oxidációs utakon keresztül. A lakkáz-ABTS rendszer oxidálja a szubsztrátokat azáltal, hogy egy elektrontranszfer (ET) mechanizmuson keresztül kationos ABTS-gyököt hoz létre. A HOBt-t, VLA-t, HPI-t vagy NHA-t tartalmazó LMS-ek a hidrogénatom transzfer (HAT) mechanizmuson keresztül nitroxil gyököket termelnek [1,12,17]. Ezenkívül az olyan mediátorok, mint a TEMPO és analógjai, ionos útvonalakon keresztül oxoammónium-ionokat generálnak [1,12,18]. Ezeknek a közvetítőknek a használata sokféle vegyületet oxidálhat különböző alkalmazásokban, mint például a festéklebontásban [3,4], a gyógyszerlebontásban [5,6] és a lignin lebontásában [8–10]. Mindazonáltal a szintetikus mediátorok alkalmazása az ipari területeken korlátozott volt lehetséges toxicitásuk, magas költségük és enziminaktiváló hatásuk miatt. A közelmúltban a ligninből származó fenolos molekulákat, mint természetes közvetítőket (pl. sziringaldehid, acetosziringon, vanillin, acetovanillon, metil-vanillát, ferulinsav, szinapinsav, p-kumársav stb.) tanulmányozták a szintetikus mediátorok helyettesítésére [1,12] . A természetes mediátorok előnye az alacsony költség és az alacsony toxicitás, mivel természetes és megújuló forrásokból nyerik őket [19].
A melanin természetes pigmentek csoportja, amelyet a melanogenezis, a tirozin melanociták általi oxidatív polimerizációja során állítanak elő. A természetes melanin öt kategóriába sorolható: eumelanin, pheomelanin, összes melanin, pheomelanin és neuromelanin [20]. A közelmúltban különféle orvosi és elektrokémiai alkalmazásokat tanulmányoztak melanin vagy melanin prekurzorok felhasználásával [20,21]. Az emberi bőr színét leginkább a melanin jelenléte határozza meg. A kozmetikai iparban a melanin enzimek segítségével történő közvetlen depigmentációját javasolták bőrfehérítő szerek kifejlesztésére. Számos peroxidázt tanulmányoztak a melanin színtelenítésére. Woo et al. kimutatták, hogy a szintetikus melanin közvetlenül színteleníthető a P. chrysosporiumból származó lignin-peroxidáz segítségével [22]. A Keneko és Mohorˇciˇc csoport a gombákból (Sporotrichum pruinose és Phlebia radiata) izolált mangán-peroxidáz hatására a melanin enzimatikus elszíneződéséről is beszámolt [23,24]. Kim et al. beszámoltak arról, hogy a mangán-peroxidázt, lignin-peroxidázt és lakkázt tartalmazó nyers enzimkeverékek melanin depigmentációs aktivitást mutattak [25]. Amikor a peroxidázok elszíntelenítik a melanint, hidrogén-peroxidra (H2O2) van szükségük kofaktorként, amely irritálhatja a bőrt. Így a H2O2 felhasználás csökkentésére glükóz-oxidázt vagy lakkázt vezettek be az enzimkombinációs rendszerbe [26,27]. A lakkázok hidrogén-peroxid használata nélkül is színteleníthetik a melanint. Khammuang és Sarnthima arról számolt be, hogy a Lentinus polycarpous Lév-ből származó lakkáz melanin színtelenítő aktivitást mutatott ABTS, vanillin és vanillinsav mediátorként [28].
2. Anyagok és módszerek
2.1. Anyagok
2.2. Melanin színtelenítés LMS-sel
A telített melaninoldatot (1,4 mg/ml) úgy állítottuk elő, hogy 3 mg szintetikus melanint 1,3 ml 10 mM NaOH-ban oldottunk. Az oldatot 85 00 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 5 percig, hogy eltávolítsuk a fel nem oldott melanint, majd a felülúszót 0,1 M citromsav-foszfát pufferrel (pH 3, 4, 5, 5,5, 6 vagy 7), és szubsztrát oldatként használják az LMS-hez. A melanin koncentrációja a szubsztrát oldatban 63 µg/ml volt, és spektrofotometriásan 475 nm-en igazoltuk. A 0,8 ml melanin szubsztrát oldatot 0,1 ml mediátor oldattal (0-1 mM) kevertük egy 1,5 ml-es Eppendorf csőben. A melanin elszíneződési reakcióját úgy indítottuk el, hogy 0,1 ml lakkázoldatot (15,8 µg (0,6 U) lacT vagy 19,2 µg (1,8 U lacM) adtunk a melanin és a mediátor elegyéhez 25 °C-on rázó vízfürdőben 120 fordulat/perc sebességgel. . A reakció után a reakcióelegyet centrifugáltuk, és a felülúszó abszorbanciáját 475 nm-en mértük. A színtelenítési hozamot ( százalék ) a következő egyenlettel számítottuk ki:
Elszíneződés ( százalék ) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)
2.3. A melanin elszíneződésének kinetikai vizsgálata LMS-sel
2.4. Természetes mediátorok citotoxicitása
A B16F10 melanoma sejtvonalat (Korea Cell Line Bank, Szöul, Korea) használtuk az LMS természetes mediátorainak citotoxicitásának meghatározására. A mediátorok citotoxicitásának mérésére neutrális vörös (NR) vizsgálatot végeztünk [29]. Az NR az élő sejt lizoszómák életképességét méri. 3 × 104 sejt koncentrációjú melanomasejteket adagoltunk egy 96-lyukú lemez minden egyes lyukába. 24 órás tenyésztés után a sejteket természetes mediátorokkal (1, 2, 5, 10, 22 és 46 mM) kezeltük. További 2 napos tenyésztés után a sejteket DMEM-ben oldott 50 µg/ml NR-oldattal kezeltük, és 3 órán át inkubáltuk. A felülúszót leszívással eltávolítottuk, majd NR-deszorpciós oldatot (1% jégecet, 49% etanol és 50% desztillált víz) használtunk a színextrakcióhoz. Az extrakció után az abszorbancia változását 540 nm-en mértük.
2.5. A melanin/cellulóz hidrogél film előkészítése és színtelenítése
Az LMS melanin/cellulóz film színtelenítő aktivitásának mérésére az elkészített hidrogél filmet 1 × 2 cm-es lapra vágtuk. A hidrogél filmet 4 ml 0,1 M citromsav-foszfát pufferbe (pH 5,5) merítettük; ezt követően 0,5 ml 1 mM acetosyringont és 0,5 ml csipkeoldatot (2,5 U) adtunk a pufferhez. A színtelenítési reakciót vízfürdőben, rázatás közben 120 órától és 25 °C-on 3 órán át végeztük. A reakció után a filmet desztillált vízzel mostuk, és a küvetta belső oldalához rögzítettük, hogy UV/Vis spektrofotométerrel mérjük a spektrum változását 400-800 nm tartományban. A kontroll reakciókat lacM vagy mediátorok nélkül is végrehajtottuk azonos körülmények között. A reakciókörülmények között nem volt kimutatható a melanin felszabadulása a filmből vagy a melanin/cellulóz film színváltozása. Továbbá a melanin/cellulóz fólia színparamétereinek (L*, a* és b* értékek) változását az LMS-sel végzett színtelenítési reakció után szintén koloriméterrel rögzítettük (KONICA MI NOLTA, Tokió, Japán). A ∆L (metrikus világosságkülönbség), ∆E (teljes színkülönbség), YI (sárgasági index) és WI (fehérségi index) értékeket a következő egyenletekkel kaptuk [30–32]:
2.6. Természetes melanin előállítása
A természetes melanint B16F10 melanoma sejtekből nyertük. A sejteket alfa-melanocita-stimuláló hormonnal kezelték, melanint termelve. 4 napos inkubáció után a sejteket tripszin-EDTA segítségével befogtuk, és 10 percig ultrahanggal kezeltük. A felülúszót 8000 rpm-en 10 percig végzett centrifugálással nyertük ki, majd pH-ját 1,5-re állítottuk be 6 M HCl-dal. Az oldatot 100 ◦C-on 4 órán át forraltuk, hogy a maradék fehérjefrakciókat hidrolizáljuk. A természetes melanint tartalmazó oldatot acetonnal, majd kloroformmal és etanollal mostuk, majd ionmentesített vízzel mostuk, hogy eltávolítsuk a maradványokat, például sejteket, táptalajkomponenseket és fehérjefrakciókat [33,34]. Az összes mosási folyamatot több mint kétszer végezték el. Végül a természetes melanint fagyasztva szárítással nyerték ki, és az LMS szubsztrátumaként használták.
3. Eredmények és megbeszélés
3.1. A közvetítők hatása a melanin elszíneződésére LMS segítségével
Különféle mediátorok hatását a melanin színtelenítési reakciójára LMS segítségével vizsgáltuk két T. versicolor (lacT) és M. thermophila (lacM) lakkáz segítségével (1. ábra).Ha a lacT-t mediátor nélkül használtuk a melanin elszíneződéséhez, az elszíneződési hozam 5 óra reakció után csak 1 százalék volt. Ha HOBt-t használtunk a lacT közvetítőjeként, a színtelenítési hozam enyhén, 2%-ra nőtt 5 óra reakció után. A különböző szintetikus mediátorok, mint például a HOBt, ABTS, VLA és TEMPO alkalmazása fenolos vagy nem fenolos vegyületek lakkáz-katalizált oxidációjában jelentősen megnövelte a reakciósebességet [10,15]. Ha a célvegyületek bejutását a lakkáz aktív helyére korlátozza sztérikus gátlásuk, a lakkáz által képzett mediátor gyökök hatékonyan oxidálhatják a célvegyületeket az elektrontranszfer vagy hidrogénatom transzfer mechanizmus révén [12]. A HOBt az egyik leggyakrabban használt szintetikus mediátor az LMS-ben, magas redoxpotenciáljának köszönhetően (1,1 V) [6]. A HOBt azonban nem jó kozmetikai összetevő, mivel potenciális sejttoxicitása és lakkázinaktiváló képessége van. Így hét természetes mediátort, az acetosyringont, a syringaldehidet, a p-kumársavat, a vanillint, a vanillinsavat, a vanillil-alkoholt és az acetovanillont választottuk ki a melanin LMS-elszíntelenítési reakciójához. Érdekes módon a természetes mediátorok mindegyike hatékonyabb közvetítőként működik, mint a HOBt a melanin hiánya miatti elszíneződésében. Acetosiringon, sziringaldehid és p-kumársav használatakor a színtelenítési hozam 28%, 22% és 18% volt 5 órás reakció után. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a természetes mediátorok hasznosak az LMS által végzett melanin színtelenítési reakcióban. Az LMS-ben lévő mediátorokat a lakkáz mediátor gyökökké oxidálja, a mediátor gyökök pedig a melanin oxidációját és elszíneződését idézik elő. Ha a hiányt mediátor nélkül alkalmaztuk a melanin színtelenítéséhez elegendő reakcióidő alatt, amely el tudta érni az egyensúlyi állapotot, a színtelenítés hozama 24 óra reakció után 7 százalék volt. A természetes mediátorok, a vanillinsav kivételével, hatékonyabb mediátorként működnek, mint a HOBt a melanin lacT általi elszíneződésében 24 órás reakció után. Az elszíneződés hozama 24 órás reakció után vanillinsavat közvetítőként alacsonyabb volt, mint 5 órás reakció után. Ennek oka lehet a vanillinsav oxidált gyökös formájának alacsony stabilitása. Acetosiringon, sziringaldehid és acetovanillon alkalmazásakor a színtelenítés hozama 34%, 30% és 31% volt 24 órás reakció után. A p-kumársav hatékonyabban növelte a kezdeti reakciósebességet, mint az acetovanillon, míg az acetovanillon egyensúlyi állapotban nagyobb színtelenítési hozamot indukált, mint a p-kumársav.
A mediátor hatása a lacM-t alkalmazó LMS-sel végzett színtelenítési reakcióra szintén nagyon hasonló volt a lacT-t alkalmazó LMS-sel kapotthoz. Ha csipkét közvetítő nélkül használtak a melanin elszíntelenítésére, az elszíneződés hozama 5 óra reakció után csak 2 százalék volt. A HOBt, mint a lacM közvetítője, nem növelte a színtelenítési hozamot az 5 órás reakció során. A p-kumársav és a vanillin kivételével a természetes mediátorok mindegyike hatékony mediátorként működött a melanin lacM általi színtelenítésében. Acetosiringon és sziringaldehid alkalmazásakor a színtelenítés hozama 25%, illetve 22% volt 5 órás reakció után. A p-kumarsavat és a vanillint hatékony mediátorként alkalmazták mindegyikhez, de nem tudták hatékonyan fokozni az elszíneződési sebességet LMS-ben csipke használatával. Ezt a lacM alacsonyabb szubsztrátspecifitása okozhatja a p-kumársavra és a vanillinre. A lacM p-kumársavval és vanillinnel való 24 órás reakciója után a színtelenítés hozama hasonló volt a lacT-vel kapotthoz. Ez azt jelzi, hogy a p-kumársav és a vanillin oxidált formái hatékonyan tudják színteleníteni a melanint, bár a lacM általi oxidációs sebességük sokkal alacsonyabb volt, mint a lacT-é. Ha közvetítő nélküli lacM-et használtunk a melanin színtelenítésére elegendő reakcióidő alatt, a színtelenítés hozama 5% volt 24 órás reakció után. A természetes mediátorok, a vanillinsav kivételével, a HOBt-nál is hatékonyabb mediátorként működnek a melanin lacM általi elszíneződésében 24 órás reakció után. Ha acetosyringont, syringaldehidet és acetovanillont használtunk a lacM mediátoraként, a színtelenítési hozam 34%, 28% és 31% volt 24 órás reakció után. Ha vanillinsavat használtunk mediátorként mind a lacT, mind a lacM esetében, ez mutatta a legalacsonyabb színtelenítési hozamot. Ennek oka lehet a vanillinsav oxidált gyökös formájának alacsony stabilitása. Khammuang és Sarnthima arról számolt be, hogy a vanillin és a vanillinsav közvetítőként használható a melanin elszíntelenítéséhez Lentinus polycarpous lakkáz segítségével [28]. Azonban sokkal alacsonyabb színtelenítő aktivitást mutattak a melanin esetében, mint az acetosyringon, amikor lacT és csipke mediátoraként használták őket.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a természetes mediátorok hatékonyabbak a melanin LMS általi elszíntelenítésében, mint a HOBt. A HOBt-t a lakkáz hatékony szintetikus közvetítőjének tekintették magas redoxpotenciálja és a HOBt N OH csoportjának katalitikus szerepe miatt [5]. A mediátorok hatékonysága a célszubsztrátok oxidációjában nagymértékben függ a stabil gyökképző képességtől, valamint a terjedelmes alkil-szubsztituensek által okozott sztérikus gátlástól, nem pedig a mediátorok redox potenciáljától [19,35]. A HOBt oxidált intermedierjének alacsony stabilitását ciklikus voltammetriával határoztam meg [6]. Ezért a HOBt-t használó LMS alacsony színtelenítési hozamát a HOBt alacsony stabilitása okozhatja a lakkáz reakciókörülményei között. Bár a sziringaldehid redoxpotenciálja alacsonyabb volt, mint a HOBt-é, a sziringaldehid viszonylag nagyobb stabilitást mutatott, mint a HOBt [6].
Amint a 2. ábrán látható, az ebben a munkában használt természetes mediátorok különféle szubsztituensekkel (pl. hidroxil, metoxi, karboxil, keton vagy aldehid) rendelkeznek a benzolgyűrű különböző pozícióiban [12,19]. A két metoxicsoporttal (acetosziringonnal és sziringaldehiddel) rendelkező mediátorok nagyobb elszíneződési arányt mutattak, mint az egy metoxicsoporttal rendelkezők. A metoxicsoport nélküli p-kumársavval kapott színtelenítési sebesség a lakkáz típusától függött. A lacT-vel rendelkező p-kumársav nagyobb elszíneződési sebességet mutatott, mint az egy metoxicsoportot tartalmazó p-kumársav, míg a lacM-es p-kumársav mutatta a legalacsonyabb elszíneződési sebességet az 5 órás reakció során. Fillat et al. hasonló eredményeket mutatott a flexográfiai tinták gombás lakkázok természetes közvetítőkkel történő színtelenítésére is [36]. A fenolos természetes mediátorok (acetosziringon, metilfecskendő és sziringaldehid), amelyekben a gyűrűben két metoxiszubsztituens található, a lakkáz gyorsabban oxidálódott, mint a metoxicsoport nélküli p-kumársav. Ez azt jelzi, hogy a metoxicsoportok fontosabb szerepet játszanak elektrondonorként, mint a p-kumársav oldalláncának kettős kötése. Az egy metoxicsoportot tartalmazó mediátorok összehasonlításakor a színtelenítési hozam a következő sorrendben nőtt: acetovanillon > vanillin > vanillil-alkohol > vanillinsav. A ketoncsoportot tartalmazó acetovanillon nagyobb elszíneződési sebességet és hozamot mutatott, mint az aldehid-, hidroxil- és karboxilcsoportokat tartalmazó mediátorok. A ketoncsoportot tartalmazó acetosziringon is nagyobb elszíneződési sebességet és hozamot mutatott, mint az aldehidcsoportot tartalmazó sziringaldehid.
A következő kísérletekben az acetosyringont, a syringaldehidet és az acetovanillont, amelyek magas melanin elszíneződési képességet mutattak, választottuk mediátorként az LMS melanin színtelenítésére. A mediátor hatását a színtelenítési reakcióra LMS segítségével idővel vizsgáltuk (S1 ábra). A lacT acetosyringonnal, sziringaldehiddel és acetovanillonnal végzett színtelenítési reakciója 21%, 18% és 1% színtelenítési hozamot eredményezett 1 óra reakció után. A lacM acetosziringonnal és sziringaldehiddel végzett színtelenítési reakciója 19 százalékos, illetve 18 százalékos színtelenítési hozamot eredményezett 1 óra reakció után. Mindkét lakkáz hasonló reakcióprofilt mutatott, ha ugyanazt a mediátort alkalmaztuk. Az acetoziringon és a sziringaldehid jelentősen növelte a színtelenítés sebességét a kezdeti reakció során. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az acetosziringont és a sziringaldehidet tartalmazó dimetoxicsoportokat hatékonyabban növelték az LMS-sel történő színtelenítés kezdeti sebességében, mint az egy metoxicsoportot tartalmazó acetovanillon. Fillat et al. arról is beszámoltak, hogy a mediátorok gyűrűs szerkezetében lévő metoxicsoportok a szubsztrátok oxidációjának gyorsítójaként működnek [36]. Másrészt az acetovanillon 24 órás reakció utáni színtelenítési hozama hasonló volt a sziringaldehidhez, bár az acetovanillon mérsékelten növelte a reakció sebességét.
További információ: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
