A Lactobacillus Plantarum GKM3 elősegíti a hosszú élettartamot, a memória megtartását és csökkenti az agyi oxidációs stresszt a SAMP8 egerekben 1. rész

Absztrakt: (1) Háttér: Az életkorral összefüggő kognitív hanyatlás gyakran befolyásolja az idősek életét, és a tünetek a memória és a tanulás progresszív károsodásához kapcsolódnak. Feltételezték, hogy a probiotikumok a bél-agy tengelyen keresztül módosíthatják az életkorral összefüggő neurológiai rendellenességeket. (2) Módszerek: A probiotikus Lactobacillus plantarum GKM3 öregedésgátló hatásának vizsgálatára túlélési teszteket és kognitív kísérleteket is végeztünk SAMP8 egérmodellben. A hat hónapos SAMP8-at (n{{10}} minden nemben) probiotikus GKM3-mal etették 5,1 × 109 és 1,0 × 109 cfu/ttkg/nap dózisban természetes halálukig. Ezután megvizsgálták az élettartamot. A három hónapos SAMP8-at (n=10 mindkét nemben) 14 héten át GKM3-mal kezelték. Ezután a viselkedési teszteket és az oxidációs paramétereket rögzítettük. (3) Eredmények: A GKM3 csoportok szignifikánsan megnövekedett latenciát mutattak a passzív elkerülési tesztben és a sikeres elkerülés idejét az aktív elkerülési tesztben. Az egerek agyából származó TBARS és 8-OHdG szintén jelentős csökkenést mutatott a GKM3-mal kezelt csoportokban. Ezenkívül az amiloid fehérje alacsonyabb felhalmozódását találták a SAMP8 egerek agyában GKM3 kiegészítéssel. (4) Következtetések: Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az L. plantarum GKM3 késleltette az öregedés folyamatát, enyhítette az életkorral összefüggő kognitív károsodást és csökkentette az oxidatív stresszt.

Kattintson a Cistanche Tubulosa Supplement elemre

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kulcsszavak: öregedésgyorsított egér hajlamos 8 (SAMP8); probiotikumok; 8-hidroxi-20 -dezoxiguanozin (8-OHdG); tiobarbitursavval reaktív anyagok (TBARS); amiloid- (A); öregedés

1. Bemutatkozás

Problémát jelentett, hogy az elmúlt évtizedben az idősek számának növekedése nyomán a populáció által elszenvedett kognitív zavarok egyre nagyobb mértékben növekedtek [1]. Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) jelentése szerint a kognitív hanyatlásban szenvedők száma, amely 2015-ben több mint 46,8 millió volt, 2030-ban meghaladja a 74,7 milliót, ami tizenöt éven belül csaknem a felére emelkedik [2]. . Az öregedésről, amelyet a kognitív károsodással szoros összefüggésben ismernek el, általában az oxidatív stresszhez kötik, amely részt vesz a szabad gyökök felhalmozódásában, és számos fiziológiai diszfunkcióhoz vezetett, különösen az agyban, amely egy oxigénérzékeny szerv, ami degeneratív betegségekhez vezet. olyan tünetek, mint a memóriavesztés és a tanulási képesség csökkenése [3–5].

Mivel az öregedés elkerülhetetlen, és a relatív negatív tünetei bonyolultak, az emberek öregedésgátló kezeléseket folytatnak, a diétás terápiáktól a gyógyszeres kezeléseken túlmenően [6,7]. Például a ginzeng (Panax quinquefolius) gyökérkivonat jobb kognitív funkciót mutatott, és a koreaiak kedvencként jelölték meg [8]. A ginkgo biloba kivonatot, egy másik példa, a japánok szerették a kognitív képességek javításában és oxidáció-csökkentő funkcióiban [9]. Bár sok jelentés azt sugallja, hogy a növényi alapú étrendek antioxidáns hatást fejtenek ki és késleltetik az öregedési folyamatot, érdekesebbek a bél mikrobióta, vagy akár a bélben található specifikus baktériumok csoportja, amelyek metabolizálhatják ezeket a tápanyagokat és pozitív multimodulációt biztosítanak. hatások a gazdára, beleértve a hosszú élettartamot [10–14]. A bélbaktériumok rövid szénláncú zsírsavakat (SCFA-kat), például acetátot, propionátot vagy butirátot termelhetnek az étrendből [15]. A növényi eredetű enterális táplálékot fogyasztó gyermekek székletmintáiban magasabb SCFA-t mutattak, mint a normál gyerekek [16]. Ezek az SCFA-k fontos szerepet játszhatnak az emberi gasztrointesztinális epitéliumban [17]. Az acetát átjuthat a vér-agy gáton, hipotalamusz-neuronális aktivációt indukálva [18]. Ezen túlmenően a butirátot a vastagbélgyulladást visszaszorító hatásával kapcsolatban tanulmányozták az emberi bélben [19]. Ezért számít, hogy milyen mikrobióta vagy adott baktérium található az emberi bélben, különösen a test egészségének és élettartamának befolyásolása szempontjából [20,21].

A bélmikrobióta hatással lehet a bél-agy tengelyre is, és késlelteti az öregedés folyamatát, ezáltal megakadályozza az életkorral összefüggő betegségek, például az amnézia, a demencia vagy akár az Alzheimer-kór előrehaladását [22,23]. A neurotranszmitter gamma-amino-vajsavat (GABA) például bizonyos baktériumtörzsek termelhetik, amelyekről beszámoltak a bélben lévő hám őssejtek szaporodásával és egerek depressziós viselkedésének javulásával [24,25]. A jelenlegi alátámasztó adatok szerint a probiotikumok megelőzési módszerként történő hozzáadása az életkorral összefüggő neurológiai rendellenességek tendenciája [26,27].

A Lactobacillus a leggyakoribb probiotikum, amely nagy lehetőséget mutatott a funkcionális élelmiszerek kifejlesztésére, mivel az emberi táplálékban már régóta létezik [28]. Az egyes baktériumfajok azonban törzsről törzsre egyedi bioaktivitásokkal rendelkeznek, amelyek kísérleti megerősítést igényelnek. Korábbi vizsgálataink során a Lactobacillus plantarum GKM3 probiotikus törzset pácolt levélből (Brassica juncea) izoláltuk, amely a tajvani Hakka társadalomban a hosszú élettartamú zöldségként is ismert, és funkcionális vizsgálatokat végeztünk a gyomor-bél traktus és az immunitás in vivo erősítésére [29–31]. . Ezért arra számítottunk, hogy a L. plantarum GKM3 valószínűleg enyhíti az öregedés folyamatát és az életkorral összefüggő kognitív károsodást.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Tantárgyak

A L. plantarum GKM3-at kínai mustárból (Brassica juncea) izolálták, és a tajvani Bioresource Collection and Research Centerben (BCRC) őrizték 910787 gyűjteményszámmal. Először a GKM3-at MRS (BD Co., Franklin Lakes, NJ, USA) táplevessel tenyésztettük 37 °C-on 18 órán át a kémcsőben. {{10}}.01 százalékos beoltással a GKM3 magtenyészetet egy 50 literes fermentorban, pH 6.0 kontroll alatt növeltük. 37 ◦C-on 18 órán keresztül tervezett tápközeggel (5% glükóz, 2% élesztőkivonat, 0,05% MgSO4, 0,1% K2HPO4 és 0,1% Tween 80). Ezután a fermentált baktériumokat 3800 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugálással összegyűjtöttük, kétszer mostuk foszfátos sóoldattal, és a pelletet 10 százalékos tejjel kevertük össze liofilizáláshoz. A L. plantarum GKM3 fagyasztva szárított por adagját ebben a vizsgálatban 5,1 × 109 cfu/ttkg/nap értékre állítottuk be magas dózisként és 1,0 × 109 cfu/ttkg/nap alacsony dózisra szondán keresztül végzett egérmodell esetében. .

Az öregedésre felgyorsult hajlamos egereket P8 (SAMP8) mutattuk be ebben a vizsgálatban, mint öregedő állatmodellben. Minden SAMP8 egeret alkalmaztunk, és 12 órás sötét/világos ciklusban tartottuk 25 ± 2 °C hőmérsékleten, 65 ± 5 százalékos relatív páratartalom mellett étellel és vízzel ad libitum. A következő kísérleti eljárásokat a Providence Egyetem (Taichung City, Tajvan) Élelmiszer- és Táplálkozástudományi Tanszékének Állatkezelési Bizottsága hagyta jóvá 20170629-A02 IACUC-számmal.

2.2. Túlélési teszt

A túlélési tesztben a hat hónapos SAMP8 egereket 20 nőstényből és 20 hímből álló csoportba soroltuk a következőképpen: kontroll, GKM3 nagy dózisú csoport és GKM3 alacsony dózisú csoport. A probiotikus L. plantarum GKM3-at naponta adtuk a kezelt egereknek, amíg el nem érték a természetes elpusztulásukat. Minden csoportban feljegyeztük az élő/halott SAMP8 egereket, és kiszámítottuk az átlagos élettartamot.

2.3. Kísérlettervezés az életkorral összefüggő kognitív károsodásra

Három hónapos SAMP8 egereket helyeztünk el a kognitív károsodás kísérletéhez. Mind a hím, mind a nőstény SAMP8 egereket a következőképpen csoportosítottuk (n=10 minden nemben): kontrollcsoport, GKM3 nagy dózisú csoport és GKM3 alacsony dózisú csoport. A kezelt csoportokban lévő egereknek orálisan L. plantarum GKM3-at adtunk 14 hétig. A mozgási tevékenységet a kísérlet 11. hetében végeztük. A passzív elkerülési tesztet és az aktív elkerülési tesztet a 13. és a 14. héten végeztük el, majd az egereket leöltük biokémiai analízis és szövettani vizsgálat céljából.

2.4. Mozgásszervi tevékenység

Mindegyik egeret egy siklóketrec közepébe helyeztük (25 cm × 25 cm × 25 cm, Coulbourn Instruments Model E61-21, Lehigh, PA, USA), és mozgásukat aktivitásfigyelő video-útelemzővel rögzítették. 10 percig. Az egér mozgásának átlagos idejét 5 percenként elemeztük (s/5 perc). Ez a felvonulás gyenge fényben és néma körülmények között zajlott.

2.5. Passzív elkerülő teszt

Egy siklóketrec (35 cm × 17 cm × 20 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15, Lehigh, PA) egy sötét és világos helyiségbe került. A két szoba között volt egy guillotine ajtó (7,5 cm × 6,5 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15GD, Lehigh, PA, USA). A passzív elkerülési teszt edzési tesztjén egy egeret helyeztek a világos helyiségbe egy percre adaptációra, majd kinyitották a guillotine ajtaját. Az egér 0,5 µA áramütést kapott 0,5 másodpercig, amikor belépett a sötét szobába. A sokk öt másodpercenként háromszor következett be. Az egeret ugyanazzal a művelettel cserélték ki 24 órával, 48 órával és 72 órával a memóriateszt edzése után, azzal a különbséggel, hogy nem adtak sokkot. Megmértük az egerek világos helyiségben tartózkodásának átlagos idejét. 180 s felső vágási idő lett beállítva.

2.6. Aktív elkerülési teszt

Az aktív elkerülési teszt edzési tesztjében az egér 10 másodperces kondicionált ingert (CS) kap fény és hang alapján, majd 5 másodperc 0,3 mA áramütést (feltétel nélküli inger, UCS), ha Az egér ugyanabban a helyiségben maradt, viszont nem volt sokkhatás, ha az egér átkerült a másik szobába. Mindegyik egér 5 CS és UCS ciklusra edzett. Az egeret ugyanazzal a művelettel (CS/UCS rendszer) tesztelték 15-20 perces kísérletek közötti intervallumokkal naponta négyszer, és folyamatosan tesztelték négy napon keresztül. Az átlagos elkerülési időt a tanulási memória hatásaként mértük.

2.7. Oxidatív stressz elemzés

A 8-hidroxi-20 -dezoxiguanozin (8-OHdG) agyi mitokondriális DNS-ből történő kimutatásához 30 mg agyszövetet vontunk ki a Blood & Tissue Genomic DNA Extraction Miniprep System (Viogene Biotek) segítségével. Corp., Taipei, Tajvan) és a rendkívül érzékeny 8-OHdG Check ELISA Kit-et (Nikken SEIL Co. Ltd., Shizuoka, Japán) alkalmaztuk 450 nm-es abszorbanciával. A tiobarbitursav-reaktív anyagok (TBARS) elemzéséhez 25 mg agyszövetet őröltünk 250 µl RIPA pufferrel, és 16,000× g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on. Összesen 100 µl felülúszót gyűjtöttünk össze és adtunk hozzá 100 µl SDS oldatot és 4 ml színreagenst, majd a hűtési kezelés előtt egy órán át forraltuk. A kezelt mintákat 16,000 × g-vel centrifugáltuk 10 percig, és 30 percre szobahőmérsékleten helyeztük el. A TBARS-tartalmat (mM/g fehérje) minden 150 µl-es mintából 535 nm abszorbancián mértük a standard görbével.

2.8. Az agy amiloid-proteinjének mérése

Az agyszövet metszetéből származó amiloid- (A ) fehérjét immunhisztokémiai módszerrel festettük meg. Az A felhalmozódás százalékos arányát képrendszerrel (Leica, Q500, Wetzlar, Németország) elemeztük mikroszkóppal 40×-es mező alatt. A számítás az A-felhalmozódási terület százalékos arányán alapult az egész agyban: ( -amiloid lerakódási terület/egész agyterület) × 100 százalék.

2.9. Szövettan

Az agyakat kivágtuk és 10 százalékos formalinnal rögzítettük. A hippocampális szövetet dehidratálással, tisztítással, infiltrációval és beágyazással dolgozták fel a metszéshez. Ezután a hippocampus területének szövetét hematoxilin és eozin (H&E) festéssel vizsgáltuk.

2.10. Statisztikai

Ebben a vizsgálatban az SPSS 19.{1}} statisztikai székletet használtuk. Minden adatot átlag ± SEM-ben fejeztünk ki, és egyutas ANOVA-val értékeltük ki a különböző csoportok átlagainak összehasonlítására. Szignifikáns különbséget vettünk figyelembe, ha a p-érték kisebb volt, mint 0,05 Duncan többszörös tartományú tesztjei alapján. A túlélési tesztben a Kaplan–Meier tesztet alkalmaztuk az elemzéshez, a log-rank tesztet pedig a csoportok közötti különbségek ellenőrzésére.

3. Eredmények

3.1. Az L. plantarum GKM3 hatása a SAMP8 túlélési tesztre

A túlélési kísérletben a SAMP8 egerek élettartamát a természetes halálukig figyelték meg, és 21 hónapba telt az összes egyedi rekord kitöltése. A nem kezelt hím SAMP8 egerek átlagos élettartama 11,90 ± {{10}},18 hónap, a nőstényeké pedig 11,20 ± 0.21 hónapok. A probiotikus GKM3 etetési csoportokban a férfiak átlagos élettartama 12.{31}}5 ± 0,15 hónapra, illetve 13,50 ± 0,14 hónapra nőtt alacsony, illetve nagy dózisú GKM3 kezelések esetén. A probiotikus GKM3 dózisfüggő hatása a nők élettartamának meghosszabbítására szintén megfigyelhető volt 12,15 ± 0,21 hónapig az alacsony dózisú csoportban és 14,30 ± 0,17 hónapig a nagy dózisú kezelésben (az adatok nem láthatók).

Összefoglalva a várható élettartamot, megbecsültük a túlélési arányt. 50 százalékos túlélési arány mellett a GKM3 alacsony dózisa a férfi csoportban 12,67 hónap, a magas dózisú GKM3 férfi csoport 13,33 hónap volt, míg a férfi kontrollcsoport csak 12,50 hónapot mutatott (1A ábra). A nőstény SAMP8 egereknél tapasztalt megfigyeléshez hasonlóan 12.{12}} hónapos és 15,50 hónapos túlélési arányt mutattak ki 50 százalékos túlélési arány mellett a probiotikus GKM3-mal 1,0 × 109 CFU/ttkg/nap és 5,1 × 109 adaggal táplált csoportokban. CFU/kg BW/nap, ill. a női kontrollcsoportban azonban 10,50 hónapot figyeltek meg 50 százalékos túlélési aránnyal (1B. ábra). Ebben a kísérletben a nőstény SAMP8 egerek rövidebb várható élettartamot mutattak be, mint a hímek; érdekes módon a L. plantarum GKM3 hatása az élettartamot tekintve nagyobb hatással volt a nőstényekre. Feltételezhető, hogy az L. plantarum GKM3 növelheti a hosszú élettartamot mindkét nemű SAMP8 egerekben, különösen a nőstény fajokban.

3.2. Testtömeg, táplálékfelvétel és vízbevitel SAMP8 egerekben

Az életkorral összefüggő kognitív károsodásra vonatkozó kísérletben nem volt szignifikáns különbség az energiafogyasztásban és a súlyváltozásban a különböző kezelési csoportok összes SAMP8 egerében az elpusztítás előtt (1. táblázat). Ez azt jelenti, hogy a probiotikus GKM3 nem befolyásolta ezeket a metabolikus paramétereket az idős egér modellben.

3.3. Az L. plantarum GKM3 hatása a memória megtartására és a tanulás fejlesztésére

A mozgási aktivitásteszt azt mutatta, hogy az első 5-perces intervallumban nem volt szignifikáns különbség az összes SAMP8 egér között, nemtől függetlenül (2. táblázat). Bár a második 5-perces intervallum csökkenést mutatott, az első 5-perces intervallumhoz képest nem volt szignifikáns változás a kezelt és a nem kezelt csoportok között.

Passzív elkerülési teszteket végeztünk SAMP8 egerek hím és nőstény csoportjain (2. ábra). Nem volt szignifikáns különbség az összes csoport között a próbateszt során (p > 0.05). A probiotikus GKM3-mal táplált SAMP8 hím egerek látenciája szignifikánsan megnőtt a kontrollcsoporthoz képest az első napon (p < 0.05) (2A. ábra). A GKM3 kezelés első napján a nőstény SAMP8 egerek világos szobában tartózkodási ideje is megnőtt, a p-érték kisebb, mint 0,05 az alacsony dózisú csoportban, és a p-érték kisebb, mint a 0,01 a magas dózisú csoportban. -dózis csoport a kontrollhoz képest. A passzív elkerülő teszt második napja után azonban nem volt szignifikáns különbség. A GKM3 etetőcsoportban végzett hosszabb késleltetés, mind a hím, mind a nőstény SAMP8 egerekben azt jelezte, hogy a probiotikus GKM3 hozzájárulhat az életkorral összefüggő memóriamegtartáshoz és a tanulás fokozásához.

Az aktív elkerülő eljárás során az egereknek minden intézkedést meg kellett tenniük a káros inger elkerülése érdekében. Az aktív elkerülési teszt próbanapján a GKM3-mal etetett hím és nőstény SAMP8 egerek nagyobb sikeres elkerülési tendenciát mutattak (3. ábra), de nem érték el a statisztikai különbséget (p > 0). 9}}5) összehasonlítva a kontrollcsoporttal. Az aktív elkerülési teszt első és második napján elért eredménye azonban azt mutatta, hogy a sikeres idő szignifikánsan megnőtt a GKM3-mal táplált hím csoportokban, összehasonlítva a nem kezelt hím SAMP8 egerekkel (3A ábra) (p < 0,05). Hasonló eredményt figyeltek meg a női csoportokban is (3B. ábra). Érdekes módon nem volt statisztikai különbség (p=0.157) a negyedik napi eredményben a kontroll és a probiotikus csoport között. Ez azt jelenti, hogy a kontroll egereknek négy napos képzésre volt szükségük, hogy utolérjék a probiotikummal táplált egerek jelenlétét. Feltételezik, hogy a probiotikus GKM3 étrendhez való hozzáadása elősegítheti a gazdaszervezet kognitív képességét, ami mindkét nemben befolyásolja a megfelelő viselkedést.

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】