A longitudinális immunprofilozás domináns epitópokat tár fel, amelyek hosszú távú humorális immunitást közvetítenek COVID{1}}– lábadozó egyénekben

Háttér: A Súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) egy rendkívül patogenitású és fertőző koronavírus, amely eddig 5,2 millió halálos áldozattal járó globális járványt okozott. A hosszú távú immunitás szerológiai jellemzőivel kapcsolatos kérdések, különösen a SARS-CoV{7}} fertőzés utáni tartós antitestválaszokat közvetítő domináns epitópok tisztázásra várnak.

Célkitűzés: Célunk volt a 2019-es koronavírus-betegségben (COVID{1}}) szenvedő betegek immunválaszának kinetikája és élettartama, valamint a SARS-CoV elleni tartós, hosszú távú humorális immunitásért felelős epitópok feltárása-2.

Mód: Felmértük a SARS-CoV-2 immundinamikáját 180-220 nappal a betegség kezdete után 31 olyan személynél, akik túlnyomórészt mérsékelt COVID-tüneteket tapasztaltak-19, majd elvégeztük a domináns epitópok proteomszintű profilozását, amelyek felelősek tartós humorális immunválaszok.

Eredmények: A longitudinális elemzés tartós SARS-CoV-2 spike-fehérje-specifikus antitesteket és neutralizáló antitesteket tárt fel COVID-19 betegekben, valamint a citokintermelés aktiválódását a SARS-CoV-2 fertőzés korai szakaszában. Kimutatták, hogy az erősen reaktív epitópok, amelyek képesek voltak hosszú távú antitestválaszokat közvetíteni, a tüskén és az ORF1ab fehérjéken helyezkedtek el. A SARS-CoV-2 tüskeprotein kulcsepitópjait az S1 alegység és az S2 alegység N-terminális doménjéhez térképezték fel, különböző fokú szekvenciahomológiával az endemikus humán koronavírusok között, és magas szekvenciaazonossággal a korai SARS-alegység között. CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) és a jelenleg forgalomban lévő változatok.

A cistanche-kiegészítő előnyei – hogyan erősíthetjük az immunrendszert

Következtetés: A SARS-CoV-2 fertőzés tartós humorális immunitást indukál a COVID-19-vel lábadozó egyénekben azáltal, hogy megcélozza a tüskén található domináns epitópokat és a hosszú távú immunválaszt közvetítő ORF1ab fehérjéket. Eredményeink utat biztosítanak a racionális vakcinatervezés és diagnosztikai fejlesztés elősegítéséhez. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

Kulcsszavak:

SARS-CoV-2, COVID-19, hosszú távú immunválasz, humorális immunitás, fehérjeszintű peptid microarray, domináns epitóp

A súlyos akut légúti szindróma coronavirus 2 (SARS-CoV- 2), a folyamatban lévő 2019-es koronavírus-betegség (COVID-19) világjárvány kórokozója, a Betacoronavirus nemzetségbe tartozik, amely 2 másik ismert magas patogenitású embert is magában foglal. koronavírusok: a súlyos akut légúti szindróma (SARS) és a közel-keleti légúti szindróma (MERS) koronavírusai.1 Az első regisztrált eset, 2019. december végén történt megjelenése óta a SARS-CoV-2 fertőzés több mint 263 millió embert okozott. igazolt esetek és 5,2 millió haláleset világszerte 2021 novemberéig, ami 5 kontinens 220 országát és régióját érintette.2 A fertőzést követően a klinikai megnyilvánulások széles skálán mozognak, beleértve a tünetmentes fertőzéseket, enyhe vagy közepesen súlyos tüneteket vagy akár életveszélyes súlyos tüdőgyulladást.3 A többféle vakcina-megközelítés elérhetősége miatt sok ország még mindig küzd a fertőzések új hullámainak megfékezésével, és olyan vírusváltozatok jelennek meg, amelyek úgy tűnik, hogy fokozott átviteli képességet és rezisztenciát mutatnak az antivirális immunválaszokkal szemben. A semlegesítő antitestek által közvetített hatékony humorális immunválasznak erős és nélkülözhetetlen adaptív immunitással kell rendelkeznie a fertőzés blokkolásához és a vírusos kórokozók eliminálásához. A SARS-CoV-2 fertőzést követően a fertőzött egyének körében magas arányú (90%-ot meghaladó) robusztus szerokonverziót figyeltek meg a betegség kezdete után 7-14 nappal.{24}} Antigén-specifikus IgA, IgG, és a SARS-CoV tüskefehérjét (S) és nukleokapszid fehérjét (N) felismerő IgM-2 kimutatható volt a betegség akut fázisában és a lábadozás korai szakaszában.4,5,7 A neutralizáló antitestek mennyisége összefüggésbe hozható az életkorral, a tünetekkel járó fertőzéssel és a betegség súlyosságával. Idős betegek és súlyos COVID{30}} tüneteket mutató egyének általában magasabb szintű semlegesítő antitesteket fejlesztenek ki.4,8-10 Az antitestválaszok hosszú élettartamával foglalkozó számos tanulmány kimutatta, hogy annak ellenére, hogy a szérum/plazma vírussal szembeni reaktivitása csökken. antigének és a neutralizáló antitest-titerek idővel csökkenése egyes tünetekkel járó COVID-19 esetekben, a COVID-19 – lábadozó egyéneknél a teljes, hosszú távú humorális immunitás tartós szintjét figyelték meg a fertőzés után akár 8-12 hónapig. .10-13 Ezenkívül a SARS-CoV-2 antigén-specifikus memória B-sejtek száma legalább 6-12 hónapig stabil maradt,12,13, a folyamatban lévő expresszáló B-sejt klónok szelekciója és felhalmozódása mellett. semlegesítő antitestek,12,14, amelyek a tartós humorális immunitás fennmaradását jelzik a SARSCoV-2 fertőzés után.

A cistanche-kiegészítés előnyei – az immunitás növelése

A semlegesítő antitestek alapvető szerepet játszanak a gazdaszervezet vírusfertőzés elleni védekezésében. A SARS-CoV-2 rendkívül erős monoklonális antitesteinek paneljét azonosították, amelyek 15-17 elsősorban az S-fehérje receptorkötő doménjében található epitópokat célozzák meg, amelyek a virion felszínén trimerekké állnak össze, és megkönnyítik a vírus bejutását. és fúzió az angiotenzin-konvertáló enzim 2 receptorhoz való kapcsolódáskor.18 Az S fehérje más régiói, beleértve az S1 alegység N-terminális doménjét (NTD) és az S2 alegységet is tartalmaznak olyan immunogén epitópokat, amelyek képesek semlegesítő antitestek indukálására.16 ,19,20 A semlegesítés mellett a SARS-CoV-2 antitestei védelmet nyújthatnak in vivo az Fc-közvetített effektor funkciókon keresztül, mint például a természetes ölősejtek által kiváltott antitest-függő fagocitózis és a monociták vagy makrofágok által kiváltott antitest-függő citotoxicitás. 21,22 A vírusfertőzések leküzdése mellett a természetes fertőzések vagy vakcinázások által termelt antitestek elősegíthetik a vírus patogenezisét, akár fokozott gyulladásaktivációval, akár fokozott vírusfertőző képességgel az antigén/antitest immunkomplex képződése révén, vagy Fc-függő funkciók révén,23-25 bár a fokozott vírusfertőzést nem figyelték meg a SARS-CoV-2 összefüggésében in vivo. Az antitestválaszok ezen eltérő szerepei szükségessé teszik a SARSCoV-2 epitópok szisztematikus jellemzését, valamint a semlegesítő vagy nem neutralizáló epitópokat célzó, hosszan tartó antitestek tulajdonságait. A SARS-CoV-2 fertőzés utáni antitestválaszok kinetikáját és időtartamát illetően a közelmúltban elért előrehaladás ellenére a hosszú távú humorális immunválaszt fenntartó prominens epitópokra vonatkozó longitudinális elemzés még mindig korlátozott. Korábbi tanulmányok COVID-19-fertőzött egyének antitestválaszának epitópjait főként ELISA-alapú tesztek,26,27 fág- vagy bakteriális-megjelenítés alapú megközelítések,28-31 és microarray-alapú technológiák segítségével határozták meg.30,{{ 38}} A SARS-CoV-2 S fehérje számos immundomináns epitópját azonosították; a leggyakrabban kimutatott régiókat az S2 alegység fúziós peptidje (FP) közelében vagy azon átívelően térképezték fel, a második heptád ismétlődések az S2 alegységen belül és az S1 alegység C-terminális doménjén.26, 28-30, 32,33 Ezenkívül a szerológiai szűrés olyan epitópokat is feltárt, amelyek a SARS-CoV{50}} proteomon keresztül más fehérjéknél helyezkednek el, beleértve az N-fehérjét, a membrán (M) fehérjét és az ORF1ab-t, az ORF3a-t és az ORF7a-t.{54}} 34,35 Bár a korábbi tanulmányok fontos betekintést nyújtottak az antigén epitópokba, ezek a vizsgálatok nagyrészt a COVID{57}} betegek epitópprofiljára összpontosítottak a korai lábadozási fázisban. A tartós SARS-CoV{59}}-specifikus antitestválaszokat közvetítő pontos epitópok, valamint az epitópfelismerés dinamikája még tisztázásra vár. Átfogó longitudinális elemzést végeztünk, hogy mélyebben megértsük a humorális immunválasz kinetikáját és élettartamát COVID{60}}-betegeknél, különös tekintettel a SARS-CoV{63}} elleni tartós, hosszú távú immunitásért felelős epitópokra. 31 COVID-19-beteg immunprofiljának vizsgálata 180-220 nappal a tünetek megjelenése után. Az antigénkötő és neutralizáló antitestek, valamint a szérum citokinszintek értékelése alapján azonosítottuk továbbá a SARSCoV-2 ORF1ab, S és N fehérjéinél elhelyezkedő epitópok paneljét, amely egy peptid segítségével tartós humorális immunválaszt közvetít. microarray, amely magában foglalja a SARS-CoV-2 teljes proteomját. Eredményeink rávilágítanak a vírusfertőzések leküzdésére szolgáló hosszú távú immunitás jellemzőire, és segítik a racionális vakcinatervezést és a jobb szerológiai diagnosztikai eszközök fejlesztését.

MÓD

A vizsgálat résztvevői és mintagyűjtés

A SARS-CoV-2-irányított immunválaszok kinetikájának longitudinális értékeléséhez 101 szérummintát gyűjtöttünk 31 SARS-CoV-2-fertőzött személytől, akiket a Nantong Egyetemhez (Nantong) kapcsolódó Nantong Harmadik Kórházba vettek fel. , Kína) 2020. január és március között. Minden betegnél megerősített SARS-CoV-2 fertőzést diagnosztizáltak reverz transzkripciós kvantitatív PCR-teszttel; A Kínai Népköztársaság Nemzeti Egészségügyi Bizottsága által kiadott új koronavírus-tüdőgyulladás diagnosztizálási és kezelési protokolljának 7. verziója szerint a betegség súlyossága enyhe vagy közepes (nem súlyos) vagy súlyos COVID{9}} volt. hosszirányban felfelé 4-8 hónapig az akut fertőzésből való felépülés után. A vérmintákat longitudinális módon, a tünetek megjelenése után 4-219 nappal vették 20 betegnél, 31 vizsgálati résztvevő közül (egyénenként átlagosan 4,5 minta, 2 és 8 között), míg minden egyes betegnél egyszeri mintavételt végeztek. másik 11 személy, akik a betegség késői lábadozási fázisában voltak (a betegség kezdete utáni 122-214. napon). Ennek megfelelően a korban és nemben egyező egészséges donoroktól származó szérumokat (n 5 20) is bevontuk a kontrollcsoportba. A vizsgálat egyik résztvevőjének sem volt dokumentált korábbi SARS- vagy MERS-fertőzése.

A vizsgálatot a Nantong Egyetemmel társult Nantong Third Hospital etikai bizottsága hagyta jóvá (EL2020006 jóváhagyás). A vizsgálatban részt vevők mindegyikétől írásos beleegyezést kaptak. A szérumot a perifériás vértől szérumgél csövekben centrifugálással választottuk el, alikvot részeket formáztunk, és felhasználás előtt 2808 °C-on tároltuk.

Sejtvonalak

A HEK293T és Huh7 sejteket Dulbecco-módosított Eagle tápközegben (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass.) tenyésztettük, amelyet 10% hővel inaktivált borjúmagzati szérummal (Gibco), 100 U/ml penicillinnel (Gibco) és 100 mg/-mal egészítettünk ki. ml sztreptomicin (Gibco) 378 °C-on 5% CO2-val.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

IgG antitest kimutatása ELISA-val

Az antigénkötő IgG antitestek szintjét a humán szérummintákban ELISA-val határoztuk meg. Kilencvenhat üregű ELISA lemezeket (Corning, Corning, NY) előzetesen bevontunk SARS-CoV-2 nukleokapszid fehérjével (Sino Biological, Peking, Kína, katalógusszám: 40588-V08B , 50 ng lyukanként) vagy tüskefehérje (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng lyukanként), SARS-CoV tüskeprotein (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng per lyuk) kút), vagy MERS-CoV tüskeprotein (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng lyukanként) egy éjszakán át 48 °C-on. 0,05% Tween 20-at (PBS-T) tartalmazó foszfátpufferes sóoldatban (PBS) 2 órán át 378 °C-on végzett 5%-os zsírmentes tejjel blokkolást követően 3-szeresére kell hígítani a sorozathígított hővel inaktivált szérummintákat 1-es kiindulási hígítással. :200-at adtunk előre bevont lemezekre 2 órán át 378 °C-on. A lyukakat az egyes lépések között háromszor mostuk PBS-T-vel. A reakciókat torma-peroxidázzal konjugált anti-humán IgG antitesttel (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság, 1:100,{40}} hígítás) 1 órán át 378 °C-on, majd tetrametilbenzidin szubsztrát hozzáadásával (Life Technologies, Carlsba) tettük láthatóvá. , Kalifornia). A kifejlődési reakciókat 2 mol H2SO4-gyel állítottuk le, és az abszorbanciát 450 nm-en mértük, a korrekciós hullámhosszt 630 nm-re állítottuk be (OD450 2 OD630). A kötődő antitestek végponttiterének kiszámításához az adatokat linearizáltuk a szérumhígítások log10 értékének a korrigált optikai sűrűség (OD) értékeinek (OD450 2 OD630) szembeni ábrázolásával a görbe lineáris részén (y 5 kx 1 b). , r2 > 0,99), és az a szérumhígítás, amelynél a beállított OD-érték (OD450 2 OD630) 5 0 végponttitert eredményezett. Az antigén-specifikus IgG antitesteket peptiddel immunizált egerekben peptid alapú ELISA-val értékeltük. Röviden, 96-lyukú ELISA lemezeket (Thermo Fisher Scientific) vontunk be lyukanként 1 mg 4 vegyes peptiddel (318., 356., 510. és 530. peptid) karbonát pufferben (pH 9,6) egy éjszakán át 48 °C-on. Az 5% zsírmentes tejet tartalmazó PBS-T-vel való blokkolást követően a lyukakat 1:40 arányban hígított szérummintákkal 1 órán át 378 °C-on inkubáltuk. Ezt követően a lemezeket mostuk, és torma-peroxidázzal konjugált anti-egér IgG antitesttel (Abcam) inkubáltuk. A reakciókat tetrametil-benzidin szubsztráttal (Life Technologies) tettük láthatóvá, és a 450 nm-en mért abszorbanciát a reakciók 2 mol H2SO4-gyel történő leállítása után mértük.

Pszeudovírus termelés és titrálás

A kodonoptimalizált gén, amely SARS-CoV-2 (NC_045512) vagy SARS-CoV (AY291315.1) tüskeproteint kódol C-terminális 19 aminosav delécióval, vagy MERS-CoV (JX{10) }}) a C-terminális 16 aminosavval csonkolt tüskefehérjét pcDNA3.1(1) vektorba klónoztuk. 100 mm-es szövettenyésztő edényben tenyésztett HEK 293T sejteket 1 mg tüskeproteint kódoló plazmiddal és 15 mg env-hiányos, luciferázt expresszáló gerincvel (pNL4-3.luc.RE) kotranszfektáltunk polietilén-imin (Polysciencesimin) alkalmazásával. , Warrington, Pa). A pszeudovírust tartalmazó sejttenyészet felülúszóit a transzfekció után 48 órával összegyűjtöttük, szűrtük és 2808 °C-on alikvot részekben tároltuk. A vírustiterek meghatározásához (50%-os szövettenyészet fertőző dózisa) pszeudovírusok sorozathígításait adtuk a 1 3 104 Huh7 sejtekhez, amelyeket előre beoltottunk 96-lyuklemezekre. 12 órás fertőzés után a vírust tartalmazó tápközeget friss táptalajra cseréltük, és a sejteket további 48 órán át tenyésztettük. A sejtlízis luciferázaktivitását Steady-Glo Luciferase Assay System-el (Promega, Madison, Wisc) mértük mikrolemez-leolvasóval (BioTek Instruments, Winooski, Vt), és az átlagos háttérérték 10-szeresénél nagyobb relatív lumineszcenciaegységet produkáló lyukakat vettük figyelembe. pozitív.

Pszeudovirus neutralizációs vizsgálat

A COVID{1}} betegektől vagy egészséges donoroktól származó, hővel inaktivált szérummintákat sorozathígítással 2-szeresére hígítottuk, és 200 pszeudovírussal inkubáltuk 50%-os szövettenyészet fertőző dózisban 1 órán át 378 °C-on. A keverékeket ezután felvittük a 96-lyuklemezekre előre beoltott Huh7 sejtek megfertőzésére, két példányban. A lyukakat friss tápközeggel töltöttük fel a fertőzés után 12 órával, és a sejtek luciferáz aktivitását 48 órával később határoztuk meg. A SARS-CoV-2 és SARS-CoV pszeudovírusok elleni 50%-os neutralizációs titereket (NT50) nemlineáris regresszióval számítottuk ki GraphPad Prism 8.0 szoftverrel (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornia); és a MERS-CoV pszeudovírus NT50-ét a szérum legmagasabb hígításaként határozták meg, amely szérumminták alkalmazása nélkül a relatív lumineszcencia egységek 50%-os csökkenését eredményezte a víruskontrollhoz képest.

Protein microarray alapú citokin kimutatás

Több citokin (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 kvantitatív mérése , IL-13, MCP-1, IFN-g és TNF-a) a szérummintákban multiplex ELISA tömb (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) segítségével történt a gyártó protokollja szerint. Röviden, a citokin-specifikus antitestekkel előzetesen bevont üveglemezeket mintahígítóval blokkoltuk szobahőmérsékleten 30 percig, majd 60 ml 2--szeres hígítású szérummintát vagy citokin standard hígítást adtunk hozzá. Egy éjszakán át 48 °C-on történő inkubálás után a tárgylemezeket ötször mostuk, és 80 ml biotinilált detektáló antitest koktéllal, majd Cy3 ekvivalens festékkel konjugált sztreptavidinnel festettük szobahőmérsékleten 1 órán át. A fluoreszcencia intenzitását InnoScan 300 microarray szkenner (Innopsys, Chicago, Ill.) detektáltuk 532 nm-en, és az adatokat Q-Analyzer szoftverrel (RayBiotech) elemeztük.

Peptidszintézis és konjugáció szarvasmarha szérumalbuminnal

Összesen 515 (15 aminosav hosszúságú, 11 aminosavval átfedő) peptidet, amelyek a SARS-CoV-2 proteomot fedik, a GL Biochem (Sanghaj, Kína) szintetizálta a SARS-CoV aminosavszekvenciája alapján. -2 Wuhan-Hu-1 törzs. A peptideket szarvasmarha szérumalbuminnal (BSA) konjugáltuk Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) keresztkötő segítségével a gyártó utasításai szerint. Röviden, a Sulfo-SMCC-t 30-szeres moláris feleslegben adtuk a BSA-hoz, majd dialízist végeztünk PBS-vé. Ezt követően a ciszteint tartalmazó peptidet 1:1 (tömeg/tömeg) arányban adtuk hozzá, 2 órán át inkubáltuk, majd tovább dializáltuk PBS-sel a szabad peptidek eltávolítása érdekében.

Peptid microarray gyártás

A peptid microarray, a SARS-CoV-2 peptidek, valamint a negatív kontroll (BSA) és a pozitív kontrollok (anti-humán IgG és anti-humán IgM antitestek; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) elkészítéséhez , PATH szubsztrát tárgylemezeken (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) rögzítettük három példányban, Super Marathon nyomtatóval (Arrayjet, Edinburgh, Skócia, Egyesült Királyság). Ezután a peptid microarray-eket 2808 °C-on konzerváltuk további felhasználásra.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Microarray alapú epitóp leképezés

A Microarray alapú szérumanalízist Li és munkatársai szerint végeztük,37 kisebb módosításokkal. Annak érdekében, hogy az azonos alrendszerekhez külön kamrákat hozzunk létre, minden egyes peptid microarray tárgylemezre 14-kamra gumitömítést szereltünk fel. A tárgylemezsorokat felhasználás előtt szobahőmérsékletre melegítettük, majd 3 órán át blokkoltuk PBS-T-ben lévő 3% BSA-val. A COVID{6}} betegek szérummintáit vagy 20 egészséges donortól (kontrollcsoport) származó egyesített szérumokat a legtöbb mintánál 1:200 arányban hígítottuk PBS-T-vel, majd mindegyik alrendszerrel inkubáltuk 2 órán át 48C. A tömböket PBS-T-vel mostuk, és Cy3-konjugált kecske anti-humán IgG-vel és Alexa Fluor 647– konjugált szamár anti-humán IgM-mel (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa) 1:1000 hígításban inkubáltuk. mindegyiket 1 órán át szobahőmérsékleten. Inkubálás után a tömböket PBS-T-vel mostuk, majd szobahőmérsékleten centrifugálással teljesen megszárítottuk. Ezt követően a tömböket LuxScan 10K-A microarray szkennerrel (CapitalBio, Peking, Kína) szkennelték, és az FL fluoreszcencia intenzitási adatokat GenePix Pro 6.0 szoftverrel (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornia) gyűjtötték és elemezték.

1. ÁBRA Az antitest válaszok longitudinális dinamikája COVID-19 betegekben. A tanulmányterv vázlata. Összesen 31 SARS-CoV-2-fertőzött személyt és 20 egészséges donort vontak be a vizsgálatba. A 31 SARS-CoV-2-fertőzött személy közül 20 betegnél longitudinálisan, több időpontban vették a szérummintát, míg a többi 11 betegnél egyetlen időpontban vettek mintát. Felsoroljuk a résztvevők számát és a különböző vizsgálatokban felhasznált szérummintákat. B és C, 31 COVID-19 betegtől összesen 101 szérummintát teszteltek ELISA-val SARS-CoV-2 N-fehérje (B) és S-fehérje (C)-kötő IgG antitestek szempontjából különböző időpontokban. a tünetek megjelenése után (nap 1-30, n 5 37; nap 31-61, n 5 18; nap 100-150, n 5 21; nap {{21) }}, n 5 25). Kontrollcsoportként 20 egészséges donor szérummintáját vettük figyelembe. D, A SARS-CoV-2 pszeudovírusok elleni NT50 időbeli alakulását nemlineáris regresszióval számítottuk ki. E, A szérum neutralizáló aktivitásának megoszlása ​​COVID{27}} betegeknél a betegség kezdete után jelzett időpontokban. A 20 alatti NT50-titerrel rendelkező mintákat nem neutralizálónak tekintettük

Peptid microarray adatok elemzése

Az IgG és IgM adatokat rendre elemeztük. Az egyes foltok jelintenzitását úgy határoztuk meg, mint az előtér mínusz a háttér, és átlagoltuk a hármas foltokat minden peptidre. A COVID{0}} minták pozitív peptidválaszának határértékét az egészséges donor kontroll jelintenzitásának kétszereseként állítottuk be. A mindhárom mintavételi időpontban (a betegség kezdetét követő 10-60., 100-150. és 180-220. napon) vizsgált mintákban 80% feletti pozitív aránnyal rendelkező peptideket domináns és perzisztens peptideknek és peptideknek határoztuk meg. a 60% feletti pozitív válaszok gyakorisága minden 3-időpontban szubdominánsnak és tartósnak minősült. Kiszámoltuk az egyes peptidek átlagos jelintenzitását 3 mintavételi időpont-csoportban; A magas jelintenzitást mutató peptideket is kiválasztottuk (az összes vizsgált minta jelintenzitásának átlagos 1 SD feletti értéke). Az adatok feldolgozását és elemzését R v3.6.3 szoftverrel (https://www.r-project.org/) végeztük, és a Limma alapján értékeltük a jelintenzitás jelentős változásait a különböző mintavételi időpont-csoportok között. A P < 0,05 különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Egér immunizálás

A 6-8 hetes nőstény BALB/c egereket a Beijing Vitalstar Biotechnology-tól (Peking, Kína) vásároltuk. Minden egeret meghatározott kórokozó-mentes létesítményekben helyeztek el, és az állatkísérleteket a Tianjin Orvosi Egyetem (Tianjin, Kína) Institutional Animal Care and Use Committee jóváhagyta. Az immunizáláshoz egércsoportokat (n 5 5) intramuszkulárisan injektáltunk mindegyik peptidből (318., 356., 510. és 530. peptid) 50 mg timsóval keverve (InvivoGen, San Diego, Kalifornia) és 10 mg CpG adjuvánsokat, és kétszer 50 mg/dózisú peptidet kapott adjuvánsok jelenlétében, 2-hetes időközönként. Az egyedül adjuvánsokkal végzett vakcináció negatív kontrollként szolgált. A szérumokat immunizált egerekből a második és harmadik immunizálást követő 10. vagy 14. napon gyűjtöttük össze.

Statisztikai és szerkezeti elemzések

Az összes grafikont GraphPad Prism segítségével ábrázoltuk. Az 1., 2. és 4. ábrán látható csoportok statisztikai összehasonlítását 1-módon ANOVA Tukey többszörös összehasonlítással végeztük. Az 1. ábrán látható korrelációkat Pearson korrelációs analízissel határoztuk meg. A P < 0,05 különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. A SARS-CoV-2 tüskeprotein szerkezete (Protein Data Bank [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX és PDB ID: 6ZGI) és a SARS-CoV{{ dimerizációs tartománya 13}} nukleokapszid fehérjét (PDB ID: 6YUN) használtunk a tüskefehérjén található azonosított epitópok szerkezeti részleteinek és a nukleokapszid fehérje dimerizációs doménjének szétválasztására. A különböző humán koronavírusok közötti szekvencia-illesztést és homológiaelemzést a Clustal W algoritmussal végeztük a MEGA v10.1.6 szoftverben.

EREDMÉNYEK

A SARS-CoV-2 fertőzés tartós antigén-specifikus kötődést és semlegesítő antitesteket indukál

A SARS-CoV-2 fertőzés utáni antitestválaszok longitudinális értékeléséhez 101 szérummintát gyűjtöttünk 31, PCR-rel megerősített SARS-CoV-2 fertőzésben szenvedő személytől (1. ábra, A). A vizsgálatban 26 beteg vett részt közepesen súlyos COVID-ban-19, 1 betegnél tünetmentes, 2 enyhe betegségben és 2 súlyos tünetekben szenvedett (lásd az E1 táblázatot a www.jacionline.org internetes adattárban). A vizsgálatba bevont betegek életkora 17 és 66 év között volt (átlagéletkor 45 év), a férfiak (51,6%) és a nők (48,4%) körülbelül egyenlő megoszlásával. A vizsgálatban résztvevők körében a leggyakoribb tünetek a láz (83,9%), a köhögés (67,7%), a myalgia (22,6%) és a hidegrázás (22,6%) voltak, a betegség átlagos időtartama 15 nap. Összesen 90 szérummintát gyűjtöttek 20 COVID-19 betegtől a kórházi kezelés és a felépülés utáni hazabocsátás során több időpontban, a tünetek megjelenése után 219 napig (1. ábra, A, és lásd az E2 táblázatot az online adattárban). A többi 11 résztvevőtől a mintavételt egyetlen időpontban végezték a késői lábadozás során (a tünetek megjelenése utáni 122-214. napon). Ezenkívül kontrollcsoportként 20 egészséges donor mintáit vettük be, akiknek életkora és neme megoszlott (E1. táblázat). A szérummintákban lévő antigén-specifikus IgG antitesteket ELISA-val határoztuk meg, SARS-CoV-2 N-fehérjével vagy S-fehérjével előzetesen bevonva. Az egészséges donorokhoz képest a COVID-19 betegekben a tünetek megjelenését követő 30 napon belül mind az anti-N, mind az anti-S IgG antitestek képződtek, a végpont titer geometriai átlaga 4,10 (log10 anti-N IgG), ill. 4.20 (log10 anti-S IgG) (1., B és C. ábra; és lásd az E3 táblázatot a www.jacionline.org online adattárában; E1, A és B ábra; és E2. ábra), összhangban a korábbi megfigyelésekkel, amelyek szerint a szerokonverzió a SARS-CoV-2 fertőzés után 1-2 héttel fordul elő.5,38 Ezt követően az antigénkötő antitest-titerek idővel különböző mértékben csökkentek. Gyorsan és drámaian csökkenő anti-N IgG antitestszinteket figyeltek meg a COVID-19 betegekben, míg az anti-S IgG titerek magasabb szintjei a betegség kezdete után 180-220 napig fennmaradtak, mint az egészséges donoroknál (1. ábra, B és C). A korrelációs elemzés szignifikáns korrelációt tárt fel a log10 anti-N IgG titerek és az anti-S IgG titerek között (r 5 0,50 és P < 0,001; 1. ábra, F). A kötődő antitestek számszerűsítésén túlmenően a funkcionális neutralizáló antitestek dinamikáját COVID-fertőzött egyénekben{80}} tovább határozták pszeudotipizált SARS-CoV{82}} segítségével. A tünetek megjelenése után 4 és 30 nappal gyűjtött betegek szérummintáinak több mint 95%-a (35/37) erőteljes neutralizáló aktivitást mutatott a SARS-CoV ellen-2, és a minták nagy része mérsékelt (NT{90}}) ) erős (NT50 > 320) semlegesítő aktivitásig (1. ábra, D és E). Megjegyzendő, hogy a vírusfertőzést követő korai időszakban (a tünetek megjelenése utáni 4. és 11. napon) 2 mintát vettünk, amelyeknek nincs vagy alacsony semlegesítő titerük (NT50 minimális szérumhígításnál 1:20), mielőtt erőteljes neutralizáló antitesteket váltottak volna ki (1. 1. ábra, D és E1, C. ábra). Annak ellenére, hogy a COVID-19 betegekben az idő múlásával csökken a SARS-CoV{103}} neutralizáló antitestek szintje, a legtöbb beteg szérummintája (24/25), amelyet a tünetek megjelenése után 180-220 nappal vettek, továbbra is pozitivitást mutatott a SARS-ellenes semlegesítéshez. CoV-2, az NT50 titerek geometriai átlagának 28-szeres csökkenésével (1. ábra, D és E; E3. táblázat; E3. ábra). Ahogy az várható volt, az anti-N IgG antitestekhez képest erősebb korrelációt állapítottak meg a SARS-CoV{119}} S kötő IgG titerek és a neutralizáló antitest titerek között (r 5 0,61 és P < 0,001; 1. ábra). , G és H), összhangban azzal a megállapítással, hogy a SARS-CoV{125}} S fehérje a neutralizáló antitestek fő célpontja. A SARS-CoV{127}} S-fehérje nagy szekvenciahasonlóságot mutat a nagyon virulens SARS-CoV-vel (76%-os szekvenciaazonosság), és alacsony szekvenciahomológiát mutat a MERS-CoV-val (34%-os szekvenciaazonosság). A koronavírusok közötti szerológiai keresztreaktivitásról számoltak be; 8, 10, 28, 29 azonban a SARS-CoV{140}} elleni antitestek más koronavírusokkal szembeni keresztreaktivitásának longitudinális követési értékelésére vonatkozó adatok továbbra is korlátozottak. Keresztkötő és keresztneutralizáló antitesteket határoztunk meg SARS-CoV{144}}-fertőzött egyének longitudinális szérumában. Az eredmények azt mutatták, hogy a betegek szérummintáinak több mint 80%-a kötődött a SARS-CoV és/vagy MERS-CoV S fehérjéhez a tünetek megjelenését követő 1 hónapon belül, és a minták 27%-a kettős keresztreaktivitást mutatott (1. ábra, I). A SARS-CoV S fehérjével szembeni reaktivitás nagyobb arányban (73%), mint a MERS-CoV (35%) volt a korai időszakban (1-30 nappal a betegség kezdete után) vizsgált minták között (1. ábra, I). A kettős keresztkötő és a SARS-CoV keresztkötő antitestek fokozatosan csökkentek az idő múlásával, a betegség kezdete után 180-220 nappal a SARS-CoV egyszeres keresztkötődésének csak 8%-a, míg a SARS-CoV egyszeres keresztkötődésének 8%-a (1. , I; a www.jacionline.org webhelyen elérhető online adattárban lásd az E4. ábrát A; az E5. ábrát, az A. és az E6. Érdekes módon a MERS-CoV S fehérje-reaktív antitestek pozitivitása viszonylag állandó maradt az idő múlásával (1. ábra, I). A nagy keresztkötő képességtől eltérően a betegek szérummintáinak csak kis száma keresztezi a SARS-CoV és/vagy MERS-CoV pszeudovírusokat (1. ábra, I; E4, B; E5, B; és lásd az E7. ábrát a Online Repository). A tünetek megjelenése után 1–30 nappal gyűjtött minták körülbelül 27%-a mutatott keresztsemlegesítő aktivitást, és ez a szám 20%-ra esett 180–220. napon, drámaibb változásokkal a SARS-CoV keresztsemlegesítő aktivitásában (1. ábra, I. ). A minták nagyobb hányada kereszt-semlegesítette a SARSCoV-t, mint a MERS-CoV-t a betegség kezdetét követő 30 napon belül. Érdemes megjegyezni, hogy a SARS-CoV és MERS-CoV keresztneutralizációt mutató minták hasonló aránya ellenére a MERS-CoV NT50-értékei sokkal alacsonyabbak voltak, mint a SARSCoV-értékei azon szérumminták között, amelyek keresztsemlegesítésre pozitívak voltak (E4 ábra, B; E5. ábra, B; E7. ábra).

cistanche növény-növelő immunrendszer

A SARS-CoV-2 fertőzés a citokintermelés aktiválódását eredményezi

A SARS-CoV-2 fertőzés utáni immunológiai változások átfogó jellemzése érdekében tovább értékeltük a citokinszintek dinamikájának változásait a COVID{2}} betegek szérumában. A tünetek megjelenésétől számított első 2 hónapban 55 longitudinális szérummintát használtunk fel a citokintermelés kimutatására fehérje alapú microarray segítségével. Több citokin szérumszintjének emelkedését figyelték meg a betegség első hónapjában, beleértve az IL-1a (gyulladásgátló), IL-6 (proin-inflammatorikus) és IL-10 (gyulladásgátló) szintet. ), amelyeket a súlyos COVID{11}} esetekben a citokin felszabadulási szindrómával,39,40, valamint az IFN-g-vel (TH1-típus) és az IL-4-vel (TH2-típusú) kapcsoltak össze (2. ábra, A, és az E8. ábra a www.jacionline.org címen elérhető Online Repository-ban). Pontosabban, az IL-6, IL-10 és IFN-g szérumszintje a tünetek megjelenését követő 15 napon belül nőtt a betegeknél, és a későbbi fázisokban csökkent, míg az IL-1 a és IL-4 a betegség kezdetétől számított 16-30 napon belül figyelemreméltóan megemelkedett, majd ezt követően gyorsan visszaesett a normális szintre (2. ábra, A). A korrelációs analízis gyenge vagy nem lineáris összefüggést mutatott az antigén-specifikus antitest válaszok és a citokintermelés között SARS-CoV-2 fertőzés után, bár statisztikai szignifikancia volt megfigyelhető az IL-10 és a SARS-CoV{{ 34}} N-fehérjét kötő antitest (r 5 0.321 és P < .05), az IL-1b termelés és az S fehérjekötő antitest között (r 5 20.335 és P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

A proteómát átfogó epitóptérképezés azonosítja azokat a domináns epitópokat, amelyek tartós humorális immunválaszt közvetítenek COVID{1}}-betegeknél

Annak érdekében, hogy jobban jellemezhessük a SARS-CoV-2 elleni humorális immunitás megkülönböztető jellemzőit az idő múlásával, peptid alapú mikromátrixokat alkalmaztunk a proteom egészére kiterjedő epitóptérképezést alkalmazva. A SARS-CoV{5}} proteomot lefedő peptidkönyvtárat létrehoztuk, és tárgylemezekre rögzítettük, amelyekben mindegyik peptid 15 aminosav hosszúságú volt, 11 aminosav átfedéssel. Összesen 51 longitudinális szérumminta 19, tünetmentes (n 5 1) vagy enyhe (n 5 2) vagy közepes (n 5 15) vagy súlyos (n 5 1) betegtől ) SARS-CoV-2 fertőzéseket teszteltek (I. táblázat). A viszonylag kiegyensúlyozott mintavételi számok, intervallumok és időpontok elérése érdekében a mintákat egymás után 2 vagy 3 időpontban gyűjtöttük minden COVID{18}} résztvevőtől a tünetek megjelenése után 16 és 219 nap között. A betegek többsége (18/19) a vírusfertőzést követően semlegesítő antitesteket termelt, kivéve a tünetmentes fertőzésben szenvedő egyént (I. táblázat). A különböző mintavételi időpontok szerint a mintákat 3 csoportra osztották: napok 10-60 (n 5 18), 100-150 napok (n 5 18) és napok {{28 }} (n 5 15). A COVID{31}} betegek vírusepitópprofiljainak longitudinális értékelését a szérum IgG és IgM antitestekre egyaránt elvégezték, negatív kontrollként 20 egészséges donor egyesített szérumát használva. A SARS-CoV-2 proteom microarray segítségével meghatároztuk a peptidkötő antitest válaszok kinetikáját, és elemeztük (1) a kötődési jel intenzitását és (2) a pozitívan reaktív minták százalékos arányát (pozitív arány) minden egyes peptid esetében. . A pozitív peptidkötő válasz határértéke alapján, amelyet a negatív kontroll jelintenzitásának kétszereseként állítottunk be, összesen 460 pozitív peptidet azonosítottunk IgG-re és 479 pozitív peptidet IgM-re, amelyek legalább 1 beteggel reagáltak. szérumminta. A pozitív peptidek száma és a válaszok eloszlása ​​a SARS-CoV -2 különböző nyitott leolvasási keretei között viszonylag stabil volt a különböző mintavételi csoportok között, a pozitív peptidek számának enyhe csökkenése az idő múlásával (3. A). A legnagyobb reaktivitást az ORF1ab replikáz poliproteinben azonosították, amely a legnagyobb ORF, amely a teljes genom több mint kétharmadát foglalja magában (3. ábra, A). Érdekes módon mérsékelt vagy erős fokú korrelációt figyeltünk meg a pozitív peptidkötő válaszok és a szérum citokinszintje között korán a SARS-CoV{51}} fertőzés után (a betegség kezdete után 10-60 nappal; lásd az E10. ábrát az Online Repositoryban: www.jacionline.org). Kimutatták, hogy az IgM-hez pozitívan kötő peptidek száma összefüggésben áll az IL-6 és IL-10 szérumszintjével; hasonlóképpen az összes reaktív peptid és az ORF1ab-kötő peptidek átlagos jelintenzitása az IgM-hez pozitív asszociációt mutatott az IL-6 és az IFN-g termeléssel a szérummintákban. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a SARS-CoV{60}} fertőzést követő citokinszintek változásai befolyásolhatják az antigén-specifikus humorális válaszok által felismert epitópok nagyságát és szélességét. A pozitív epitópok azonosítása alapján tovább választottuk azokat a leggyakoribb epitópokat, amelyek következetesen reaktívak maradtak a COVID-19 minták több mint 80%-ában mind a 3 mintavételi csoportból (ezeket domináns és perzisztens epitópoknak nevezzük). Az eredmények azt mutatták, hogy ezek a rendkívül domináns epitópok, amelyek képesek hosszú távú humorális immunválaszt közvetíteni, a SARS-CoV-2 ORF1ab poliprotein és S-protein mellett helyezkedtek el, és több epitópot ismer fel az IgM antitestek (n 5 33), mint IgG antitestek (n 5 10) (3., B. ábra és II. táblázat; lásd az E11. és E12. ábrát a www.jacionline.org Online Repository-ban). Az ORF1ab poliprotein rendelkezik a hosszú távú válaszokat közvetítő domináns epitópok maximális számával, és az epitópok széles körben elterjedtek a nem szerkezeti fehérjék (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14 régióin, és nbsp 16 (II. táblázat). Nevezetesen, azonosítottunk egy immundomináns epitópot, a 2073-at (ORF1ab, aa 5801-5815), amelyet a COVID-19 betegek 100%-ának IgG- és IgM-antitestjei fel tudtak ismerni, függetlenül a szérummintavételi időpontoktól (1. ábra). 3., B. és II. táblázat; lásd az E13. és E14. ábrát az online adattárban). Ez a rendkívül reaktív peptid az ORF1ab poliprotein helikáz (nsp 13) régiójában található, amely elengedhetetlen a kétszálú RNS templátok feltekercseléséhez a SARS-CoV{92}} replikáció során.41 Az ORF1ab kiválasztott peptidjei között 2 immundomináns peptid található. Az IgG antitestek által felismert legmagasabb átlagos jelintenzitású, az 1985-ös számú (ORF1ab, aa 5449-5463) és a 2073-as számú (ORF1ab, aa 5801-5815) egyaránt az nsp 13-on található. Az IgM-válaszokhoz a 685-ös peptid (ORF1ab, aa 249-263) az nsp 2-n és az 1985-ös peptid (ORF1ab, aa 5449-5463) az nsp 13-on mutatta a legerősebb kötődési intenzitást (3. ábra, B). Figyelembe véve a különböző peptidek kiindulási jeleinek (egészséges donoroktól származó egyesített szérumok) változását (3. ábra, B), tovább számoltuk a jelintenzitás többszörös változását az egyes kulcspeptidek esetében, az egészséges kontrollcsoporthoz képest. Az eredmények azt mutatták, hogy a 2073-as peptid (IgG-kötés) és az 1985-ös peptid (IgM-kötés), amely az nsp 13-ban található, 180-220 napig tartotta fenn a legmagasabb peptidkötési intenzitást (szeres változás) a 180-220 napig gyűjtött betegszérumok között (E13. ábra és E14. ábra).

2. ÁBRA A citokintermelés kinetikája COVID{1}}-betegekben. A, A citokintermelés szintjét 16 COVID{4}} betegtől az akut fázisban és a lábadozás korai szakaszában gyűjtött 55 szérummintában fehérje-microarray-alapú ELISA-val mutatták ki (1-15. nap, n. 5 11; nap 16-30, n 5 26; nap 31-61, n 5 18; egészséges donorok, n 5 20). Minden pont egy egyedi szérummintát jelöl; szaggatott vonalak jelzik az észlelési határt. A statisztikai szignifikanciát 1-módon ANOVA Tukey többszörös összehasonlításával határoztuk meg. *P < 0,05, **P < 0,01 és ****P < 0,0001. B: Az (A)-ban látható COVID{18}}-betegeknél az egyes citokintermelési szintek változása az egészséges donoroktól származó 20 minta átlagértékeihez képest. Minden oszlop egy különálló szérummintát jelez, amelyet a tünetek megjelenése után gyűjtöttek a jelzett időpontokban; minden sor 1 egyedi tesztelt citokint jelent.

I. TÁBLÁZAT A COVID{0}}-betegek és a mintacsoportok jellemzői az epitóptérképezésben

3. ábra. A domináns epitópok IgM és IgG felismerése, amelyek hozzájárulnak a hosszú távú antitestválaszokhoz SARS-CoV-2-fertőzött egyénekben. Az epitópok szérumfelismerésének longitudinális analízise 19 COVID{5}}-ben szenvedő egyénben a SARS-CoV-2 proteomját lefedő peptid microarray segítségével. A peptidkötés pozitív válaszának határértékét a betegmintákban (n 5 51) ​​a 20 egészséges donortól származó egyesített szérum jelintenzitásának kétszereseként állították be. A, A pozitív kötő peptidek peptidszáma és megoszlása, amelyek 1 vagy több mintában kimutathatók voltak 10-60 napon (n 5 18), 100-150 napon (n 5 18), és 180- 220 nappal (n 5 15) a betegség kezdete után. A számok az összes azonosított IgG és IgM epitópot jelzik az egyes ORF-ekből. B, A domináns és perzisztens IgG és IgM epitópok jelintenzitása (x-tengely), amelyek a minták több mint 80%-ában fenntarthatóan reaktívak voltak mind a 3 mintavételi időpontban. Minden pont az egészséges donoroktól származó egyesített szérumot (felül) vagy egy külön beteg szérummintát jelöl, amelyet a tünetek megjelenése után a jelzett időpontokban gyűjtöttek. E, Envelope protein.

TABLE II. Epitopes with >80%-os pozitív arány mind a 3 mintavételi időpontban

A SARS-CoV-2 S fehérje domináns és perzisztens epitópjai az NTD és S2 alegységeken találhatók

Összesen 4 domináns és perzisztens epitópot azonosítottak a SARSCoV-2 S fehérjéből: a 318-as peptidet (S, aa 45-59) és a 356-os peptidet (S, aa 197-211), amelyek lokalizálódnak. az NTD régión belül; az 510-es peptid (S, aa 813-827), amely lefedi az S2' hasítási helyet és az S2 alegység FP részeit, valamint az 530-as peptid (S, aa 893-907), amely a csatlakozó régióban található az FP és az S2 alegység első heptád ismétlődő régiója között (3. ábra, B és II. táblázat). Az általunk kiválasztott S-fehérje kulcsfontosságú peptidjei közül a 318-as peptid, amely az S-fehérje NTD-jénél található, rendelkezett a legerősebb kötődési intenzitással (a kontrollhoz viszonyított többszörös változás; E13. és E14. ábra). A szerkezeti elemzések kimutatták, hogy ezek az epitópok teljes mértékben ki vannak téve a monomer S fehérje felületén; azonban a 318-as, 356-os és 530-as peptidek epitópjainak néhány maradéka el van rejtve a trimer S-fehérje felszíne alatt (4. ábra, A és B), ami arra utal, hogy mind az S-monomer, mind a trimer szerkezeteket a gazdaszervezet immunrendszere hatékonyan felismeri bizonyos esetekben. körülmények. A 318-as peptid 2 hurokszegmense (aa 45-46 és aminosav 56-59) látható a trimer S-fehérjén, a központi b-szál pedig bele van temetve; és a 356-os peptid legtöbb maradéka hozzáférhető a felszínen, beleértve egy mag b-szálat (aa 203-209) és egy hurokszegmenst (aa 210-211). Az 510-es peptid tartalmaz egy S2' hasítási helyet és egy központi hélixet az FP-nek, amelyek mindegyike teljesen megtalálható az S fehérje felületén; az 530-as peptid maradékai többnyire rejtélyesek, a huroknak csak egy kis része (aa 893-895) van kitéve a trimer S fehérjén (4. ábra, C). A 7 gyakori humán koronavírus szekvencia-homológiai elemzése kimutatta, hogy az S2 alegységen található 2 epitóp (510. és 530. peptid) nagy szekvenciaazonosságot mutat más koronavírusokkal, ami arra utal, hogy a humán koronavírusok között ezek az epitópok szerológiai keresztreaktivitást mutatnak (4. ábra, D). A 318-as peptid szekvenciája nagy hasonlóságot mutatott a SARSCoV-val, míg a 356-os peptid szekvencia-homológiája alacsony szintű volt a koronavírusok között, ami arra utal, hogy SARS-CoV-2-specifikus antitestválaszok célozzák ezt a régiót (4. ábra, D). Figyelembe véve a globálisan feltörekvő és keringő SARS-CoV-2 variánsokat, további szekvencia-illesztést végeztünk az S-fehérje kulcsepitópjai tekintetében a korai SARS-CoV-2 törzs (Wuhan-Hu{52}) között. }) és 5 aggodalomra okot adó változat (Alfa, Béta, Gamma, Delta és Omicron), valamint 2 érdekes változat (Lambda és Mu) az Egészségügyi Világszervezet vírusváltozatok osztályozása szerint (frissítve: 2021. november 30. ). Az eredmények azt mutatták, hogy ezeknek a domináns és perzisztens epitópoknak a szekvenciái majdnem azonosak az elemzett variánsok között, kivéve az új Omicron variánsban azonosított egyetlen N211I mutációt (4. ábra, E). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a korai SARS-CoV{60}} törzsek által termelt antitestek következetesen felismerhetik a jelenleg keringő variánsokat, és ezek a domináns epitópok képesek lehetnek tartós, hosszú távú antitestválaszok közvetítésére a SARS-CoV fertőzésre{63}} változatai. Az S-protein azonosított epitópjainak immunológiai jellemzőinek további meghatározására, valamint ezen S-protein epitópok potenciális értékének további vizsgálatára, mint peptid vakcina jelöltek, egér immunizálási vizsgálatot végeztünk kiválasztott peptidek felhasználásával. A BALB/c egereket háromszor oltottuk be mindegyik peptiddel timsó és CpG adjuvánsok jelenlétében (4. ábra, F). A 4 kiválasztott peptid közül a 356-os peptiddel végzett vakcináció a második és harmadik adag után antigén-specifikus antitesteket váltott ki (4. ábra, G). A szérumneutralizációs vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a lineáris peptidekkel végzett immunizálás nem generált jelentős mennyiségű semlegesítő antitestet a SARS-CoV-2 ellen (4. ábra, H), ami arra utal, hogy ezek a lineáris peptidek gyengén teljesítenek az erőteljes neutralizáló antitestválaszok kiváltásában.

A SARS-CoV-2 N-fehérjéből hiányzik a legtöbb reaktív epitóp, amelyek vírusfertőzés után tartós antitestválaszokat közvetítenek

Számos tanulmány tisztázta a SARS-CoV-2 N fehérje erős antigenitását. 4, 11, 12 A jelenlegi szelekciós kritériumok alapján azonban nem sikerült azonosítanunk az N fehérjénél elhelyezkedő domináns és perzisztens epitópokat. (80% feletti pozitív arány mind a 3 mintavételi időpontban). Az N-fehérje epitópprofiljának longitudinális értékeléséhez COVID-ban szenvedő egyénekben-19 egy második epitóp-szűrési kört hajtottunk végre, amely a peptid microarray-ből nyert adatokon alapult azon szubdomináns epitópok kiválasztásához, amelyek folyamatosan pozitív reaktivitást mutattak. a COVID-19 minták több mint 60%-ában mind a 3 mintavételi időpontban (ezeket szubdomináns és perzisztens epitópoknak nevezzük). A SARS-CoV-2 N fehérjének összesen 4 szubdomináns és perzisztens epitópját azonosították, amelyek közül a 2455-ös peptid (N, aa 213-227) IgG és IgM antitestekkel egyaránt reaktivitást mutatott COVID-ban{16 }} beteg, viszonylag magasabb jelintenzitású (5. ábra, A és B, és lásd az E4 táblázatot a www.jacionline.org Online Repository-ban). A 2 átfedő peptid, a 2455-ös peptid (N, aa 213-227) és a 2456-os peptid (N, aa 217-231) az N-terminális RNS-kötő domén közötti Ser/Arg-ban gazdag linker régióban található. és az N fehérje C-terminális dimerizációs doménje. A 2482. peptid (N, aa 321-335) és a 2491. peptid (N, aa 357-371) teljesen vagy részben az N-fehérje dimerizációs doménjében található (E4. táblázat). Mivel az N-fehérje ép konformációját illetően hiányoznak a 3-D-struktúrák, csak 2 azonosított epitóp szerkezeti elemzését végeztük el a C-terminális dimerizációs domén dimer szerkezetén. A 2482 peptid maradékai 2 b szálat alkotnak, amelyek antiparallel módon helyezkednek el a dimerizációs határfelületeken, míg a 2491 peptid aa 357-364 hélix alapú struktúrákat alkot, amelyek a dimer ellentétes végein helyezkednek el (5. ábra, C) . A korai SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu-1 törzs) és 7 feltörekvő variáns közötti szekvencia-illesztés azt is feltárta, hogy ezen szubdomináns és perzisztens epitópok szekvenciái az N-fehérjében szinte azonosak a jelenlegi keringő variánsok között. a 2455-ös peptid egyetlen G215C szubsztitúciója, amely a Delta-változatban fordul elő, és a 2455-ös peptid egyetlen G214C-mutációja, amelyet a Lambda-variánsban azonosítottak, ami arra utal, hogy az ezeket a peptideket célzó antitestek potenciálisan felismerik a feltörekvő SARS-CoV-2 variánsok antigénjét (5. ábra, D ).

4. ábra: A SARS-CoV-2 tüskeprotein domináns epitópjai a tartós humorális immunválasz közvetítése szempontjából. A és B: A domináns és perzisztens epitópok elhelyezkedése a monomer (A) és trimer (B) S fehérje 3-D szerkezetén (PDB ID: 6VXX). Az epitópok zölddel (356. peptid, aa 197-211), pirossal (318. peptid, 45-59), kékkel (510. peptid, aa 813-827) és lilával (530. peptid, aa) vannak kiemelve 893-907), ill. A három zárt konformációjú S monomer szürke, rózsaszín és cián színnel van ábrázolva. C, A SARS-CoV-2 S fehérje domináns epitópjainak részletes szerkezeti elemzése az S trimer zárt állapotában (PDB ID: 6VXX). D, Az azonosított epitópok szekvencia-illesztése a gyakori humán koronavírusok között. A SARS-CoV{17}} és más humán koronavírusok között konzervált epitópmaradékok szürkével vannak árnyékolva. E, A korai SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu-1 törzs) és 7 feltörekvő variáns epitóp-megőrzésének elemzése. A fekete pontok azonos csoportokat jelölnek a Wuhan-Hu-1 és a jelzett törzs között.

5. ábra. A SARS-CoV-2 nukleokapszid fehérjéjén elhelyezkedő szubdomináns epitópok képesek perzisztens antitestválaszokat közvetíteni. A szubdomináns peptidek A, IgG és IgM felismerési gyakorisága (a minták több mint 60%-ában tartósan reaktívak) a betegség kezdete után több időpontban gyűjtött betegszérumminták között. B, Az azonosított szubdomináns epitópok jelintenzitás-kinetikája az idő függvényében. Minden pont egy különálló betegszérummintát jelöl, amelyet COVID-19-betegektől vettek a tünetek megjelenését követő jelzett időpontokban. A szaggatott vízszintes vonalak jelzik az egyes peptidek pozitív válaszának határértékeit. C, Az N-fehérje C-terminális dimerizációs doménjének epitópjainak részletes szerkezeti elemzése (PDB ID: 6YUN). Az epitópokat kékkel (peptid 2482, aminosav 321-335) ​​és barnával (peptid 2491, aminosav 357-364) jelöltük. A 2 monomer szerkezet szürkével és ciánnal van ábrázolva. D, Az azonosított N-protein epitópok szekvencia-illesztési elemzése a korai SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu-1 törzs) és 7 feltörekvő variáns között. A fekete pontok azonos szekvenciákat jelölnek a Wuhan-Hu-1 törzs és a jelzett változat között. Az aminosav-szekvenciában bekövetkezett változások pirossal vannak kiemelve.

6. ÁBRA: A SARS-CoV-2-fertőzött egyének által felismert, nagy kötődési intenzitással és idővel csökkenő reaktív frekvenciájú bélésepitópok. A és B: Azon azonosított peptidek longitudinális analízise és eloszlása, amelyek nagy kötési jelintenzitást mutatnak (az összes vizsgált minta jelintenzitása átlagosan 1 SD felett), de a pozitív arány idővel csökken. Az epitópok felismerési frekvenciáját (A) és jelintenzitását (B) három mintavételi időponttal ábrázoltuk a tünetek megjelenése után. A (B) pont minden egyes pontja egy egyéni beteg szérummintáját jelöli, amelyet a tünetek megjelenése után a jelzett időpontokban gyűjtöttek; szaggatott vízszintes vonalak jelzik az egyes peptidek pozitivitásának határértékeit. A statisztikai szignifikancia analízist a Limma of R v3.6.3 szoftver alapján végeztük. *P < ,05 és **P < ,01. C, 2 szomszédos epitóp, az 510. peptid (domináns és perzisztens) és az 511. peptid (nagy jelintenzitás és idővel csökkenő pozitivitás) elhelyezkedésének és szekvenciájának összehasonlítása a SARS-CoV-2 S fehérje szerkezetén (PDB ID: 6ZGI) . A 2 epitóp közötti átfedő régiók zölddel vannak kiemelve; az egyedi szekvenciák piros és kék színnel vannak jelölve.

A longitudinális szerológiai elemzés nagy jelintenzitású, de idővel csökkenő reaktivitású epitópokat azonosít

A fent említett, tartós humorális immunválaszért felelős, szelektált, erősen reaktív epitópokon kívül további 9 pozitív peptidből álló panelt azonosítottunk és jellemeztünk, amelyek erős kötődési intenzitást mutattak (az összes vizsgált minta jelintenzitásának átlagos 1 SD-je felett). a COVID-19-betegek szérummintáiban az idő múlásával csökkenő reaktivitás tendenciája (pozitív arányváltozások 20% felett), összhangban a humorális immunválaszok csökkenésének általános tendenciájával. Ezek az epitópok a 3 domináns antigénen belül helyezkednek el: ORF1ab, S és N fehérjék (6. ábra, A; és lásd az E5 táblázatot a www.jacionline.org Online Repository-ban). Ezenkívül az ORF1ab-ból származó 4 peptid (peptidek 784-IgG, 1617-IgM és 1986-IgM) és N (peptid 2457-IgG) fehérjék jelintenzitásának jelentős csökkenését figyelték meg. a mintavétel korai időszakából származó minták (a betegség kezdete után 10-60 nap) és a mintavétel későbbi szakasza (100-150 nap vagy 180-220 nap a tünetek megjelenése után) között (6. ábra) , B). Nevezetesen, annak ellenére, hogy nagymértékben átfedésben vannak egymással, az S-fehérje 510-es peptidje (domináns és perzisztens; 3. ábra, B) és az 511-es peptid (nagy jelintenzitás és idővel csökkenő pozitív arány; 6. ábra, A) különböző mintákat mutatott. a betegek szérummintái közötti reaktivitás idővel. A szekvencia- és helyanalízis azt mutatta, hogy az 510-es peptid S2' hasítási helyet és további 813-SKRS-816 aminosavakat tartalmaz, míg az 511-es peptid teljes mértékben az FP-n belül van kiterjesztett 828-LADA{{29-vel. }} maradékok, amelyek teljesen ki vannak téve a trimer S fehérje felületén (6. ábra, C). Ezek az eredmények az epitópok új jellemzőit tárták fel, amelyek végső soron hozzájárulhatnak a SARS-CoV elleni tartósabb és erősebb humorális immunitáshoz-2.

VITA

A SARS-CoV-2 fertőzésre adott hosszú távú immunválaszok szisztematikus jellemzése kritikus fontosságú a jobb diagnosztika, a hatékony terápiás beavatkozások és a vakcinák kidolgozása szempontjából. A jelenlegi vizsgálatban átfogó longitudinális elemzést végeztünk COVID-19-betegeken 180-220 napos követés alatt, amely tartós humorális immunválaszokat és aktivált citokintermelést mutatott ki vírusfertőzés után.

Lényeges, hogy a SARS-CoV-2 proteomján átívelő peptid alapú microarray előnyeit kihasználva tovább tártuk fel az epitópfelismerés kinetikáját, és azonosítottuk a domináns epitópok csoportját, amelyek képesek hosszú távú humorális immunitást közvetíteni. Az itt közölt eredmények a SARS-CoV-2 fertőzés utáni humorális immunválaszok hosszú élettartamával kapcsolatban megerősítenek néhány korábban publikált adatot5, 10, 12, 13, 42, de kiterjesztik azokat mély szerológiai profilalkotással és epitópszűréssel longitudinális szérumminták felhasználásával. COVID-betegektől,{11}} a proteomszintű microarray megközelítéssel. Ebben a vizsgálatban 4 domináns epitópot (318., 356., 510. és 530. peptid) azonosítottunk a SARS-CoV-2 S fehérjén belül, amelyek képesek voltak tartósan reagálni a COVID-19 betegek több mint 80%-ánál. tesztelt minták, a tünetek megjelenése után 180-220 nappal. Az S2 hasítási helyet és az S2 alegység FP-jét tartalmazó 510-es peptidet (S, aa 813-827) gyakran azonosították más csoportokon végzett korábbi vizsgálatokban.26,28,32-34 A funkcionális elemzések antitesteket jeleztek. ennek a régiónak a megcélzása korlátozott semlegesítő hatást fejthet ki a SARS-CoV-226,33 ellen annak ellenére, hogy erősen ki van téve az S fehérje felszínén (4. ábra, AC). Az 530-as peptid (S, aa 893-907) esetében, amely az FP és az S2 alegység első heptád ismétlődő régiója között helyezkedik el, a maradékok általában az S fehérje trimer szerkezetében vannak eltemetve, ami nehéz hozzáférni a SARS-CoV elleni robusztus neutralizáló antitestek révén-2 (4. ábra, AC). Ezenkívül 2 S1-NTD-irányított peptidet is kiválasztottak, amelyek közvetíthetik a SARS-CoV-2 hosszú távú antitestválaszait. A peptidszekvenciára és elhelyezkedésére vonatkozó elemzések azt mutatták, hogy e két peptid – a 318-as peptid (S, aa 45-59) és a 356-os peptid (S, aa 197-211) – maradékai a bejelentett epitópok közvetlen közelében találhatók. fertőzést fokozó antitestekkel23,25, de eltekintve az S1 alegység NTD-jét megcélzó, erősen hatásos neutralizáló antitestek kulcsfontosságú helyeitől,16,19,43, ami arra utal, hogy az e két azonosított peptid elleni nem neutralizáló antitestek epitópfelismerése lehetséges. A fent említett részleteken túlmenően a kiválasztott peptidekkel végzett egérimmunizálás azt is jelezte, hogy ezek a nem-receptorkötő domén lineáris peptidek alacsony hatékonysággal indukálják az erőteljes neutralizáló antitestválaszokat (4. ábra, G). Összességében ezek az adatok arra utalnak, hogy a domináns lineáris epitópok, amelyek hosszú távú humorális immunválaszt közvetítenek a SARS-CoV{65}} fertőzésre, valószínűleg olyan antitesteket indukálnak, amelyeknek nincs vagy csak korlátozott a semlegesítő hatása. A SARS-CoV{67}} antitestek, különösen az S-fehérje által irányított epitópok epitópképének teljesebb megértése új betekintést nyújt az antitestek funkcionális szétválasztásába, ami tovább megkönnyíti az innovatív és racionális vakcinatervezést. A semlegesítő antitestek védelmet nyújtanak a vírusfertőzések kiküszöbölésére, míg a nem neutralizáló antitestek előnyös, semleges vagy akár káros szerepet is játszhatnak a vírusirtás során. A nem neutralizáló antitestek további védelmet nyújtanak in vivo az Fc-közvetített effektorfunkciók széles skáláján keresztül az antitest-függő fagocitózis és az antitest-függő citotoxicitás összefüggésében. Ezzel szemben egyes tanulmányok a nem semlegesítő antitestek patogén szerepének lehetőségét javasolták a koronavírus-fertőzésben. A SARS-CoV és MERS-CoV elleni vakcinajelöltek többféle típusát használó korábbi tanulmányok fokozott immunpatológiát figyeltek meg beoltott kistestű állatoknál és főemlősöknél a vírusfertőzés után.24,44-50 A közelmúltban 2 csoportban végzett tanulmányok arról számoltak be, hogy nem semlegesítő hatású. a SARS-CoV-2 S fehérje NTD-jét megcélzó antitestek képesek voltak fokozni a vírusfertőzést in vitro Fcg-receptor-független mechanizmusokon keresztül,23,25, bár a passzívan beadott fertőzésfokozó antitestekről állatmodellekben kimutatták, hogy védelmet nyújtanak a SARS ellen. -CoV{85}} fertőzés in vivo. Figyelembe véve az antitestek ellentmondásos szerepét a koronavírus-fertőzés során, további vizsgálatokra van szükség annak igazolására, hogy az antitestek milyen szerepet játszanak ezen domináns és perzisztens epitópok felismerésében a vírusfertőzés in vivo leküzdésében. A SARS-CoV-2 elleni racionális vakcinatervezés következő szakasza úgy képzelhető el, hogy rendkívül erős neutralizáló antitesteket és védő, nem semlegesítő antitesteket állítanak elő, valamint csökkentik a fertőzést fokozó epitópok vagy immundomináns epitópok megjelenését. jótékony hatások. Bár számos korábbi tanulmány csak a SARS-CoV-2 S-proteinjére összpontosított, amelyek célja az antitestek neutralizációval kapcsolatos funkcióinak körülhatárolása, átfogó, a proteomra kiterjedő epitóptérképezést végeztünk, és azonosítottunk egy epitóp panelt az ORF1ab poliproteinben, a betegek szérummintáinak nagy része idővel következetesen felismerte. Bár ezek az ORF1ab által irányított peptidek, amelyek a több nem-strukturális fehérjén eloszlanak, nem feltétlenül váltanak ki funkcionális antitesteket a SARS-CoV{97}} virion ellen, diagnosztikai eszközként alkalmazhatók a természetes fertőzés és az oltás megkülönböztetésére. A világszerte növekvő számú oltóanyaggal az S-fehérjén és az N-fehérjén alapuló jelenlegi szerológiai tesztek kihívásokkal néznek szembe, mivel hatékony megközelítést jelentenek a SARS-CoV{99}} fertőzés kimutatására szolgáló molekuláris tesztekben, valamint a az immunállapot meghatározása vírusfertőzés után. A COVID{101}}fertőzött egyének körében az ORF1ab-n belüli leggyakoribb és perzisztens reakcióképes peptidek előnyeinek kihasználásával a természetes fertőzés szerológiai diagnózisa a receptorkötő domén alapú S-fehérje-alapú vakcinázási állapot figyelembevétele nélkül történik. alapú és inaktivált vírus alapú vakcina megközelítések. Jövőbeli vizsgálatokra van szükség az azonosított ORF1ab peptidek reaktivitásának, érzékenységének és specifitásának felmérésére a SARSCoV-2-vel fertőzött egyéneket és a vakcina befogadóit egyaránt magában foglaló nagyobb csoportokban. Ezenkívül a detektálási hatékonyság további értékelésére lesz szükség több peptid kombinációs stratégián keresztül, hogy leküzdjük a peptidek alacsonyabb érzékenységét a teljes hosszúságú fehérjéhez képest, valamint a közönséges humán koronavírusok közötti lehetséges keresztreaktivitást. Vizsgálatunk fő korlátja az, hogy viszonylag kevés mintát vettünk egy kis betegcsoportból, és a résztvevők többsége nem súlyos COVID{106}} betegségben szenvedett. Ezek korlátozhatják bizonyos következtetéseinket az immunválaszok pozitív válaszgyakoriságára és nagyságára vonatkozóan, amelyek a betegség súlyosságától függően változhatnak. Mindazonáltal az ebben a tanulmányban bemutatott adatok értékes betekintést nyújtanak a SARS-CoV{108}} fertőzést követő immunválaszok kinetikájába, valamint a tartós humorális immunitást közvetíteni képes domináns epitópok jellemzőibe a COVID{109}} egyénekben. Ezek az eredmények együttesen mélyebb megértést tesznek lehetővé a vírusfertőzés által kiváltott természetes immunitás hosszú élettartamáról, és széles körben kihatnak az innovatív vakcinázási stratégiákra és a jobb diagnosztikai megközelítésekre.

IRODALOM

1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H és munkatársai. A 2019-es új koronavírus genomikai jellemzése és epidemiológiája: a vírus eredetére és a receptorkötésre gyakorolt ​​​​hatások. Lancet 2020;395:565-74.

2. Egészségügyi Világszervezet (WHO). A WHO koronavírus (COVID{1}}) irányítópultja, 2021. Elérhető: https://COVID19.who.int/. Hozzáférés: 2021. november 30.

3. Wu Z, McGoogan JM. A 2019-es koronavírus-betegség (COVID-19) Kínában kitörésének jellemzői és fontos tanulságai: a Kínai Betegségellenőrzési és Megelőzési Központ 72314 esetről szóló jelentésének összefoglalása. JAMA 2020;323:1239-42.

4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D és mások. Antigén-specifikus adaptív immunitás a SARS-CoV-2 ellen akut COVID-19 esetén, valamint összefüggések az életkorral és a betegség súlyosságával. Cell 2020;183:996-1012.e19.

5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S és mások. A SARS-CoV-2 fertőzés tartós humorális immunválaszt indukál lábadozó betegeknél a COVID-19 tüneteit követően. Nat Commun 2021;12:1813.

6. Long QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK és mások. SARS-CoV-2 elleni antitestválaszok COVID-ban szenvedő betegeknél-19. Nat Med 2020;26:845-8.

7. Sterlin D, Mathian A, Miyara M, Mohr A, Anna F, Claer L és mások. Az IgA uralja a SARS-CoV-ra adott korai neutralizáló antitestválaszt-2. Sci Transl Med 2021;13: eabd2223.

8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y és mások. Tüske-specifikus keringő T-tüszős segítő sejt és keresztneutralizáló antitest válaszok COVID-19– lábadozó egyénekben. Nat Microbiol 2021;6:51-8.

9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q és társai. A SARS-CoV-2 semlegesítő antitest-válaszok erősebbek a súlyos betegségben szenvedő betegeknél. Emerg Microbes Infect 2020;9:2091-3.

10. Vanshylla K, Di Cristanziano V, Kleipass F, Dewald F, Schommers P, Gieselmann L és munkatársai. A SARSCoV-2 fertőzésre adott neutralizáló antitestválasz kinetikája és korrelációi emberekben. Cell Host Microbe 2021;29:917-29.e4.

11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H és mások. A SARS-CoV-2 elleni neutralizáló antitestek csökkenő szintje lábadozó COVID-19 betegeknél egy évvel a tünetek megjelenése után. Front Immunol 2021;12:708523.

12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C és mások. Természetes módon fokozott semlegesítő hatás a SARS-CoV-2 ellen egy évvel a fertőzés után. Nature 2021;595:426-31.

13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE és mások. A SARS-CoV-2 immunológiai memóriáját a fertőzés után legfeljebb 8 hónapig értékelték. Science 2021;371:eabf4063.

14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I és társai. Az anti-SARS-CoV-2 memória B-sejtes válasz érése és fennmaradása. Cell 2021; 184:1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X és társai. SARS-CoV{11}} fertőzés által kiváltott humán neutralizáló antitestek. Nature 2020;584:115-9.

16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q és munkatársai. Erőteljes neutralizáló antitestek több epitóp ellen a SARS-CoV-2 tüskéjén. Nature 2020;584:450-6.

17. Zost SJ, Gilchuk P, Case JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP és mások. Erőteljesen semlegesítő és védő emberi antitestek a SARS-CoV ellen-2. Természet 2020; 584:443-9.

18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X és társai. A SARS-CoV-2 trimer spike glikoprotein konformációs dinamikája az ACE2 receptorral komplexben, amelyet krio-EM tárt fel. Sci Adv 2021;7:eabe5575.

19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC, et al. Az N-terminális domén antigén-leképezése felfedi a SARSCoV-2 sebezhetőségét. Cell 2021;184:2332-47.e16.

20. Sauer MM, Tortorici MA, Park YJ, Walls AC, Homad L, Acton OJ et al. A koronavírus-semlegesítés strukturális alapja. Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86.

21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE és társai. Az ultrapotens humán antitestek többféle mechanizmuson keresztül védenek a SARS-CoV{2}} fertőzés ellen. Tudomány 2020;370:950-7.

22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S és mások. A SARS-CoV-2 keresztneutralizálása humán monoklonális SARS-CoV antitesttel. Nature 2020;583:290-5.

23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S és mások. Az antitestek által megcélzott SARS-CoV-2 tüskeprotein fertőzőképességét fokozó helye. Cell 2021; 184:3452-66.e18.

24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H és munkatársai. Az anti-spike IgG súlyos akut tüdőkárosodást okoz azáltal, hogy eltorzítja a makrofág válaszokat az akut SARS-CoV fertőzés során. JCI Insight 2019;4:e123158.

25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Sch€afer A, Alam SM és társai. A SARS-CoV-2 fertőzést fokozó és semlegesítő antitestek in vitro és in vivo funkciói. Cell 2021;184:4203-19.e32. 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS és mások. A SARS-CoV-2 tüskeprotein két lineáris epitópja semlegesítő antitesteket vált ki COVID-19 betegekben. Nat Commun 2020;11:2806.

27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC és társai. A SARS-CoV-2 tüskeprotein epitópjainak bányászata COVID-19-betegekből. Cell Res 2020;30:702-4.

28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL és mások. Az epitópprofilok feltárják a SARS-CoV-2 immunválasz kötődését természetes fertőzésben és keresztreakciót endemikus humán CoV-kkal. Cell Rep 2021;35: 109164.

29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y és mások. A COVID{1}}-betegek vírusepitópprofilja keresztreaktivitást és súlyossági összefüggéseket tár fel. Tudomány 2020;370:eabd4250.

30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM és társai. A ReScan, egy multiplex diagnosztikai folyamat, a humán szérumokat vizsgálja a SARS-CoV-2- 2 antigének kimutatására. Cell Rep Med 2020;1:100123.

31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A, et al. A SARS-CoV-2 antitestek nagy felbontású epitóptérképezése és jellemzése COVID-19-ben szenvedő alanyok nagy csoportjaiban. Commun Biol 2021;4:1317.

32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H és társai. A SARS-CoV-2 tüskeprotein-eredetű peptidekre adott IgG-válaszok szisztematikus értékelése a COVID-19-betegek nyomon követéséhez. Cell Mol Immunol 2021;18:621-31.

33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY és társai. A SARS-CoV-2 tüskeprotein lineáris epitóp tájképe, 1051 COVID-19 betegből. Cell Rep 2021;34:108915.

34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D és mások. SARS-CoV-2 Proteome Microarray a COVID-19 antitest-kölcsönhatások feltérképezéséhez aminosav-felbontásnál. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.

35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y és mások. A SARS-CoV-2 B-sejtes lineáris epitópjainak funkcionális feltérképezése COVID-19 lábadozó populációban. Emerg Microbes Infect 2020;9:1988-96.

36. Nemzeti Egészségügyi Bizottság és Hagyományos Kínai Orvoslás Nemzeti Adminisztrációja. Az új koronavírus-tüdőgyulladás diagnosztizálási és kezelési protokollja (7. próbaverzió). Chin Med J (angol) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819.

37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC stb. A longitudinális szérum autoantitest repertoár profilozás a műtéthez kapcsolódó biomarkereket azonosítja tüdő adenokarcinómában. EBioMedicine 2020;53:102674.

38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y és mások. A SARSCoV-ra adott antitestválaszok-2 új koronavírus-betegségben szenvedő betegeknél, 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.

39. Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M és munkatársai. A longitudinális elemzések immunológiai gyújtáshibát tártak fel súlyos COVID esetén-19. Nature 2020;584: 463-9.

40. Moore JB, június CH. Citokin felszabadulási szindróma súlyos COVID-ban-19. Tudomány 2020;368:473-4.

41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB és munkatársai. A helikáz-polimeráz csatolás szerkezeti alapjai a SARS-CoV-2 replikációs-transzkripciós komplexumban. Cell 2020;182:1560-73.e13.

42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M és mások. A SARS-CoV-2 fertőzés elleni erőteljes neutralizáló antitestek hónapokig fennmaradnak. Tudomány 2020; 370:1227-30.

43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M és társai. Egy neutralizáló humán antitest kötődik a SARS-CoV tüskeproteinjének N-terminális doménjéhez-2. Tudomány 2020;369:650-5.

44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL és társai. A SARS-koronavírus vakcinákkal történő immunizálás a SARS-vírussal való fertőzés során tüdőimmunpatológiához vezet. PLoS One 2012;7:e35421.

45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M és munkatársai. A kétszeresen inaktivált súlyos akut légzőszervi szindróma koronavírus-vakcina nem nyújt teljes védelmet egerekben, és fokozott eozinofil proinflammatorikus tüdőválaszt indukál a fertőzésre. J Virol 2011;85:12201-15.

46. ​​Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J et al. A módosított vaccinia vírussal végzett immunizálás A súlyos akut légúti szindróma elleni ankarai alapú rekombináns vakcina fokozott hepatitissel jár görényeknél. J Virol 2004;78:12672-6.

47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S és mások. A súlyos akut légzőszervi szindrómával (SARS) összefüggő koronavírus (SARS-CoV) nukleokapszid fehérjével történő előzetes immunizálás súlyos tüdőgyulladást okoz SARS-CoV-vel fertőzött egerekben. J Immunol 2008;181:6337-48.

48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A és társai. A vakcina hatékonysága a rekombináns SARS-CoV járványos és zoonózisos tüske variánsokkal fertőzött öregedő egerekben. PLoS Med 2006;3:e525.

49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T és mások. Az immundomináns SARS-koronavírus epitópok emberben fokozó és semlegesítő hatást váltottak ki a nem humán főemlősök fertőzésére. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.

50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH és mások. Az inaktivált közel-keleti légúti szindróma koronavírus vakcinával történő immunizálás élő vírussal való fertőzés esetén tüdő immunpatológiához vezet. Hum Vaccin Immunother 2016;12:2351-6.