Az előrehaladott prosztatarák megcélzása a STEAP1 kiméra antigénreceptor T-sejttel és a daganatra lokalizált IL-12 immunterápiával

A prosztata 1 hat transzmembrán epiteliális antigénje (STEAP1) a prosztatarák terápiás célzására szolgáló sejtfelszíni antigén. Itt beszámolunk a STEAP1 széles körű expressziójáról a prosztata-specifikus membrán-antigénhez (PSMA) képest letális metasztatikus prosztatarákban, valamint egy STEAP{4}}irányított kiméra antigénreceptor (CAR) T-sejt-terápia kifejlesztéséről. A STEAP1 CAR T-sejtek reaktivitást mutatnak alacsony antigénsűrűségben, daganatellenes aktivitást a metasztatikus prosztatarák modellekben, és biztonságosságot mutatnak a humán STEAP1 knock-in egérmodellben. A STEAP1 antigén szökés a kezelésrezisztencia visszatérő mechanizmusa, és a tumorantigén-feldolgozás és -prezentáció csökkenésével jár. A tumor-lokalizált interleukin-12 (IL-12) terápia kollagénkötő domén (CBD)-IL-12 fúziós fehérje formájában történő alkalmazása STEAP1 CAR T-sejt terápiával kombinálva javítja daganatellenes hatékonyságot a prosztatarák immunológiailag hideg tumoros mikrokörnyezetének átalakításával és a STEAP1 antigénszökés leküzdésével a gazdaszervezet immunitása és az epitóp terjedése révén.

Kínai gyógynövény-cisztanche növény-Antitumor

Metastatic prostate cancer represents an incurable disease responsible for over 33,000 deaths per year in the United States1. Prostate cancer is critically reliant on androgen receptor (AR) signaling and thus the suppression of gonadal androgen production through surgical or chemical castration (androgen deprivation therapy) has been a mainstay of treatment for advanced disease. However, metastatic prostate cancer inevitably develops resistance to androgen deprivation therapy and enters a stage called metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). mCRPC is currently incurable and is considered the end stage of the disease and is associated with a median overall survival of three years2. In the past decade, multiple therapies including an inhibitor of extragonadal androgen synthesis (abiraterone acetate)3, second-generation AR antagonists (enzalutamide)4, radioactive isotope (radium-223)5, and a prostate-specific membrane antigen (PSMA)-specific radioligand therapy (lutetium Lu 177 via votide tetraxetan)6 have been approved for mCRPC. Each of these agents extends survival on average by several months but long-term remissions are rare. Strategies to reprogram the immune system to combat prostate cancer first gained traction with the clinical approval of the dendritic cell vaccine sipuleucel-T for asymptomatic mCRPC7. More recently, several types of immunotherapies including immune checkpoint inhibitors, a DNA cancer vaccine, antibody-drug conjugates (ADC), T cell engaging bispecific antibodies (T-BsAb), and chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have been under active clinical investigation8,9. CARs are synthetic receptors that leverage the potency, expansion, and memory of T cells and can be engineered against virtually any tumor-associated cell surface antigen. The adoptive transfer of CAR T cells has rapidly become an established treatment for hematologic malignancies with exceptional response rates leading to six clinical approvals in the last five years10. In contrast, CAR T cell therapies targeting solid tumors have lagged due to additional challenges related to the lack of bona fide tumor-specific antigens, inhospitable tumor microenvironments, and poor trafficking, persistence, and expansion of CAR T cells11. Despite the challenges observed in driving effective immune responses toward solid tumors, recent early-phase clinical trials investigating CAR T cell therapies targeting PSMA in mCRPC have reported safety and evidence of significant biochemical and radiographic responses12,13. These preliminary results serve to embolden efforts to develop and optimize new CAR T cell therapies for prostate cancer. While PSMA is the preeminent target for therapeutic and diagnostic development in prostate cancer, recent work indicates that PSMA expression may be quite heterogeneous in mCRPC14. Tumor antigen heterogeneity, especially in the context of single antigen-targeted CAR T cell therapies for solid tumors like prostate cancer, is an important barrier to therapeutic efficacy15. Thus, identifying cell surface antigens with broad and relatively homogeneous expression in prostate cancer is imperative. In addition, very few if any tumor-associated antigens demonstrate tumor-restricted expression—most also exhibit low-level expression in normal tissues that could represent liabilities for CAR T cell therapies due to on-target off-tumor toxicities which can lead to devastating consequences including death16. We previously performed integrated transcriptomic and cell surface proteomic profiling of human prostate adenocarcinoma cell lines and identified six transmembrane epithelial antigens of the prostate 1 (STEAP1) as one of the most highly enriched cell surface antigens17. STEAP1 was first described over two decades ago18 and was recognized as being highly expressed in prostate cancer. STEAP1 is strongly expressed in >Az mCRPC 80%-a csont- vagy nyirokcsomó-érintettséggel19, Ewing-szarkóma 62%-a20 és számos egyéb ráktípus21. A STEAP1 a Metallo reduktázok STEAP családjába tartozik, amelyek homotrimereket vagy heterotrimereket képezhetnek más STEAP fehérjékkel22. A STEAP1-nek bevált funkcionális szerepe van a rákos sejtek proliferációjának, inváziójának és a hám-mezenchimális átmenet elősegítésében –26.

A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei

Ezenkívül a STEAP1 korlátozott expressziót mutat normál szövetben27, ami rendkívül meggyőző célponttá teszi a rákterápiában. Számos immunterápiás szert fejlesztettek ki a STEAP1 megcélzására, de egyik sem kapott klinikai jóváhagyást. A monometil-aurisztatin E-hez kapcsolt humanizált anti-STEAP1 IgG1 antitestből álló ADC vandor tuzumab ved otin (DSTP3086S) elfogadható biztonsági profillal rendelkezik az mCRPC I. fázisú klinikai vizsgálatában, de kevés objektív tumorválaszt figyeltek meg28. A két anti-STEAP1 fragmens-antigén kötő (Fab) domént, egy anti-CD3 egyláncú variábilis fragmentumot (scFv) és egy fragmens kristályosítható (Fc) domént, amelyet úgy módosítottak, hogy hiányzik az effektor funkció, az AMG 509 jelenleg értékelés alatt áll. fázisú klinikai vizsgálatban (NCT04221542) mCRPC29-ben. A közelmúltban arról is beszámoltak, hogy a BC261 nevű aszimmetrikus kettős bivalens T-BsAb erős daganatellenes aktivitást mutat a prosztatarák és az Ewing-szarkóma több preklinikai modelljében30. Ezenkívül kimutatták, hogy egy STEAP1 peptidre specifikus humán leukocita antigén (HLA) I. osztályú, korlátozott T-sejt-receptor (TCR) gátolja a lokális és metasztatikus Ewing-szarkóma növekedését egy preklinikai xenograft modellben a transzgenikus T-sejtek adoptív átvitele után31. Ebben a tanulmányban összehasonlító elemzést végzünk a STEAP1 és a PSMA relatív expressziójáról a letális mCRPC-ben, hogy megvizsgáljuk a STEAP1 célzásának hasznosságát a PSMA theranostics jelenlegi korszakában. Második generációs STEAP1 CAR-okat tervezünk és szűrünk az antigén-specifikus T-sejt aktiválás és a célsejt citolízis szempontjából, hogy vezető jelöltet kapjunk a további jellemzéshez. Meghatározzuk a STEAP1 CAR T sejtek funkcionális epitópspecifitását, és profilozzuk a több donortól származó STEAP1 CAR T sejttermékek expanzióját és immunfenotípusát. Ezután megállapítjuk a STEAP1 CAR T-sejt-terápia hatékonyságát és előzetes biztonságosságát a prosztatarák releváns preklinikai modelljeiben, de megfigyeljük a STEAP1 antigén expressziójának visszatérő elvesztését, mint a kezelésrezisztencia mechanizmusát. A probléma megoldása érdekében értékeljük a CBD-IL-12 egyidejű alkalmazását, amely átalakítja a prosztatarák immunszuppresszív tumoros mikrokörnyezetét, és endogén immunitást kölcsönöz a daganatellenes válaszok kiszélesítése érdekében. Összességében ezek a tanulmányok erős indoklást adnak a STEAP1 CAR T-sejtes terápia klinikai átültetésére az mCRPC-ben szenvedő férfiakra, és iránymutatást adnak a terápiás rezisztencia lehetséges mechanizmusainak leküzdésére.

A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei

Eredmények

A STEAP1 széles körben expresszálódik a kezelésre ellenálló mCRPC szövetekben

We first set out to determine the pattern and extent of STEAP1 expression relative to PSMA in advanced metastatic prostate cancer. We performed immunohistochemical (IHC) staining on a duplicate set of tissue microarrays consisting of 121 metastatic tumors (each with up to three cores represented) collected from 44 men with lethal mCRPC patients collected by rapid autopsy between the years 2010 and 2017 through the University of Washington Tumor Acquisition Necropsy Program32 (Fig. 1a). Plasma membrane staining for STEAP1 and PSMA in each tissue was scored by a research pathologist and semiquantitative H-scores were determined based on the staining intensity (Supple mentary Fig. 1a) multiplied by the percentage of cancer cells staining at each intensity (Supplementary Fig. 1b). By implementing a minimal staining threshold with an H-score cut-off of 30, we found that 87.7% of evaluable matched mCRPC tissues (100 of 114) demonstrated staining for STEAP1 compared to only 60.5% (69 of 114) for PSMA (Fig. 1b). In addition, 28.1% of mCRPC tissues (32 of 114) showed STEAP1 but not PSMA staining (Fig. 1b, c) whereas only 0.9% (one of 114) exhibited PSMA but not STEAP1 staining. Based on these results, we used a linear mixed statistical model to determine that the odds of non-zero (H-score >A {{0}}) festődés 22-szerese (95% CI 6-173) magasabb volt a STEAP1 esetében, mint a PSMA esetében, és a H-pontszám esélye nagyobb vagy egyenlő, mint 3{{ 27}} 84--szer (95% CI 30-317) magasabb a STEAP1 esetében, mint a PSMA esetében. Az átlagos STEAP1 H-pontszám csontban (193; 95% CI 171-215) szignifikánsan magasabb volt, mint a nyirokcsomó-metasztázisokban (különbség -48; 95% CI -21 - -76; p < 0,001) és szignifikánsan magasabb, mint a zsigeri metasztázisokban (különbség -59; 95% CI -42 és -77; p < 0,001). Nem volt szignifikáns különbség az átlagos STEAP1 H-pontszám között a nyirokcsomó-metasztázisok és a zsigeri áttétek között (különbség 11; 95% CI -16-39; p=0.4) (kiegészítő 1c. ábra). Számos olyan esetet is megfigyeltünk, amikor a PSMA heterogén expressziója a magokon belül (1d. ábra), ami összhangban van az intratumorális PSMA heterogenitásáról szóló közelmúltbeli jelentéssel az mCRPC biopsziákban14. A 30-nál nagyobb vagy egyenlő átlagos H-pontszámú küszöbértékkel végzett betegszintű elemzés és a McNemar-teszt feltárta, hogy az értékelhető betegek 95%-ánál (44-ből 42) STEAP1-expressziójú daganatok voltak, míg 68%-uk (44-ből 30) volt pozitív PSMA-ra. (Kiegészítő 1d. ábra). A STEAP1 és PSMA expressziójával összefüggő betegek közötti és betegeken belüli heterogenitás mintázatainak vizsgálatához STEAP1 és PSMA H-pontszámokat használtunk a hipergeometriai, Simpson és Shannon diverzitási pontszámok értékelésére. A STEAP1 expressziójának két mintázatát (1e. ábra) figyeltük meg: a betegek 68%-a (30/44) mutatott STEAP1 expressziót az összes metasztatikus helyen (magas STEAP1), és 32%-a (14/44) mutatott metasztatikus helyeket STEAP1 expresszióval és anélkül. (heterogén STEAP1). Nem azonosítottak olyan betegeket, akiknél az összes metasztatikus szövetben hiányzott volna a STEAP1 expresszió. A PSMA expressziójának hasonló elemzése ugyanabban a kohorszban azt mutatta ki, hogy a betegek 45%-a (20/44) magas PSMA-expresszióval, 32%-a (14/44) heterogén PSMA-expresszióval, és 23%-a (10/44) nem PSMA-expresszióval. Az mCRPC szövetek AR-t és a neuroendokrin marker szinaptofizin (SYP) expresszióját használó IHC-vel értékelt molekuláris alosztályozása alapján a legtöbb magas vagy heterogén STEAP1 és PSMA expresszióval rendelkező beteg AR-pozitív prosztatarákban (AR+/SYP- vagy AR+/SYP+) szenvedett. PSMA expresszió nélkül AR-null prosztatarákja volt (AR-/SYP+ vagy AR-/SYP-). Pozitív korrelációt azonosítottunk a STEAP1 és az AR expressziója között (p < 0,001) illesztett lineáris vegyes modellel, véletlenszerű hatással a szöveti microarray-n ábrázolt esetekben (kiegészítő 2a, b ábra), amely várható volt, mivel a STEAP1 egy androgén -szabályozott gén33,34. Ezzel szemben a STEAP1 és a SYP expressziója között negatív tendencia figyelhető meg (2c. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a PSMA35-höz hasonlóan a STEAP1 expressziója elveszhet a prosztatarák neuroendokrin transzdifferenciálódása miatt.

Fig. 1 | Comparative analysis of STEAP1 and PSMA in lethal, metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). a Characteristics of the mCRPC tissues represented on University of Washington Tissue Acquisition Necropsy Tissue Microarray 92 (UW TAN TMA92). b Contingency table showing the frequency of mCRPC tissues with STEAP1 or PSMA IHC staining above or below an H-score threshold of 30. Micrographs of select mCRPC tissues after STEAP1 and PSMA IHC staining to highlight the (c) absence of PSMA but the presence of STEAP1 expression and (d) intratumoral heterogeneity of PSMA expression but not STEAP1. Scale bars = 50 µm. For panels (c, d) n = 332 mCRPC cores were immunostained for STEAP1 and PSMA. e Dot and box plot showing the distribution of STEAP1 (top) and PSMA (bottom) H-scores in 44 patients from the UW TAN TMA92 cohort. Each dot represents a tumor specimen/core (n = 319 cores for PSMA and 333 cores for STEAP1) and the color indicates the molecular subtype: AR+/SYP+ (red), AR+/SYP− (green), AR−/SYP+ (yellow) and AR−/SYP− (purple). Gray rectangles show interquartile ranges spanning the 25th to the 75th percentiles of PSMA H-scores from each patient. Bar plots (on the right) summarize the frequencies of patients classified based on STEAP1 and PSMA expression as no expression (all cores with H-score ≤30, light grey), heterogeneous expression (at least one core with H-score ≤30 and H-score >30, mid grey) and high expression (all cores with H-scores >30, sötétszürke). A forrásadatokat a Forrásadatok fájl tartalmazza.

Develegy erős, antigén-specifikus STEAP1 CAR

Tekintettel a STEAP1 széles körben elterjedt expressziójára a késői stádiumú mCRPC-ben és a rák progressziójában betöltött funkcionális szerepére27, 36, 37, a következő lépésben megkezdtük egy lentivírus STEAP{5}}specifikus, második generációs CAR tervezését. A pCCL-c-MNDU3-X lentivírus gerincét38 használtuk, amelyet széles körben használtak vérképző őssejt génterápiában39, és a belső MNDU3 promoter által vezérelt CAR expressziója a T-sejtekben magasabbnak bizonyult, mint egy EFS promoter40. A 4-1BB kostimulátor domént előnyben részesítették a T-sejt-memóriaképződéssel és az elhúzódó perzisztenciával való kapcsolata miatt41, és bevezették a CD28 transzmembrán domént, mivel kimutatták, hogy ez csökkenti a második generációs 4-1BB antigén küszöbét. CAR T-sejt aktiválás42. Beépítettük a vandor tuzumab vedotinból származó teljesen humanizált scFv-t, amely egy STEAP1-et célzó ADC, amelynek fejlesztése az I. fázisú klinikai vizsgálat után leállt28. Ez az scFv a rágcsáló monoklonális antitest (mAb 120.545) humanizált változata, amelyet eredetileg az Agensys, Inc. fejlesztett ki, és amely sejtalapú kötési vizsgálatokban 1 nM affinitást mutat43. A CAR tevékenység potenciális hangolása érdekében három különböző csukló/távtartó hosszúságot alkalmaztunk, beleértve a rövid (IgG4 csuklópánt), a közepes (IgG4 csuklópánt-CH3) és a hosszú (IgG4 csuklópánt-CH2- CH3). A hosszú távtartót a CH2 doménben korábban leírt 4/2- NQ mutációkkal44 alakították ki, hogy megakadályozzák az Fc-gamma-receptor kötődését és az aktiválás által kiváltott sejthalált, amely a hosszú spacer CAR T-sejtek immunhiányos egerekbe történő adoptálásakor következik be. A három jelölt CAR-t a lentivírus vektorba klónoztuk (2a. ábra), amely transzdukciós markerként a csonka epidermális növekedési faktor receptort (EGFRt) is koexpresszálja. Lentivírusokat állítottunk elő, és ferézisből gyűjtött humán donor perifériás vér mononukleáris sejtekből (PBMC) dúsított humán CD4 és CD8 T-sejtek transzdukálására használtuk. A kiterjesztett CD4 és CD8 CAR T-sejteket immunfenotipizáltuk (kiegészítő 3a. ábra), és meghatározott összetételű sejttermékekké alakítottuk vissza normál CD4/CD8 aránnyal, hogy értékeljük funkcionális aktivitásukat. A STEAP1 expresszió izogén módon történő szabályozása érdekében a 22Rv1 humán prosztatarák sejtvonalra összpontosítottunk, amely natív STEAP1 expressziót mutat, és STEAP1 knockout-ot (ko) hajtottunk végre CRISPR/Cas9 genomszerkesztéssel. Ezután létrehoztunk egy STEAP1 mentővonalat a 22Rv1 STEAP1 ko-ból STEAP1-et expresszáló lentivírussal való transzdukcióval (2b. ábra). Ezeket a vonalakat használták azután a három rövid, közepes és hosszú spacer STEAP1 CAR T-sejt szűrésére ko-tenyésztési vizsgálatokban, az interferon-gamma (IFN-) felszabadulás leolvasásával a T-sejt-aktiváció indikátoraként. Csak a hosszú távtartó STEAP1 CAR T-sejtek (a továbbiakban: STEAP1-BBζ CAR T-sejtek) mutatták az IFN-felszabadulás várható antigén-specifikus mintázatát, míg a rövid és közepes távtartó STEAP1 CAR T-sejtek nem (2c. ábra). , Kiegészítő 3b, c) ábra). Ezenkívül a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek jelentős dózisfüggő citolízist mutattak a 22Rv1-sejtekben a nem transzdukált T-sejtekhez képest (2d. ábra), és a 22Rv1 STEAP1ko-sejtek viszonylagos megkímélését mutatták ki (2e. ábra). Ezután hasonló vizsgálatokat végeztek a DU145 humán prosztatarák sejtvonalon, amelyből hiányzik a natív STEAP1 expresszió, de úgy tervezték, hogy lentivírus transzdukcióval expresszálja a STEAP1-et (DU145 STEAP1) (4a. kiegészítő ábra). Ebben a beállításban a STEAP1-BBζ CAR T-sejt aktiválódást csak a DU145 STEAP1 sejtekkel végzett kotenyészetekben figyelték meg, a szülői DU145 sejtekkel nem (4b. kiegészítő ábra). A citolitikus aktivitást csak a STEAP1-BBζ CAR T-sejtekkel értékelték, a nem transzdukált T-sejteket a DU145 STEAP1 sejtekkel való együttes tenyészetekben (4c. kiegészítő ábra). Ezt követően elemeztük a humán prosztatarák sejtvonalak nagyobb paneljét, hogy jellemezzük natív STEAP1 expressziójukat immunoblot analízissel. Az ismert AR expressziót/aktivitást mutató sejtvonalak (LNCaP, 22Rv1, VCaP és LNCaP95) különböző szintű STEAP1 expressziót mutattak, míg az AR-null sejtvonalak (PC3, DU145, MSKCC EF1 és NCI-H660) úgy tűnt, nem expresszálnak. a STEAP1 kimutatható szintjei (2f. ábra). Elkezdtük a STEAP1-BBζ CAR T kotenyésztését ezekkel a vonalakkal, hogy tovább validáljuk az IFN-felszabaduláson alapuló antigén-specifikus aktiválódásukat (2g. ábra). Azonban egy ellentmondásos eredményt észleltünk, miszerint a PC3 vonal, amely nem mutatott nyilvánvaló STEAP1 fehérje expressziót (2f. ábra), a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek jelentős aktiválását indukálta. A korábbi irodalom azt sugallta, hogy a STEAP1 alacsony szinten expresszálódik a PC3 sejtvonalban45. Valójában a hosszan tartó immunblot expozíció egy sávot mutatott ki, amely a STEAP1 nagyon alacsony expressziójának jelenlétére utal (2h ábra). Annak igazolására, hogy a STEAP1-BBζ CAR T-sejt aktiválása ennek a csekély STEAP1-expressziónak köszönhető-e PC3 sejtekben, három PC3 STEAP1 ko alvonalat hoztunk létre (2h. ábra), és ismét együtt tenyésztettünk a STEAP-vel{133} }BBζ CAR T-sejtek. A STEAP1 ko a PC3 vonalban a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek aktiválásának megszüntetéséhez vezetett (2i. ábra), tovább erősítve a specificitást és bizonyítékot szolgáltatva a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek alacsony érzékenységére. antigén sűrűség feltételei.

A STEAP1-BBζ CAR keresztreaktivitásának hiánya az egér Steap1 és az emberi STEAP1B között

A cistanche-kiegészítés előnyei – az immunitás növelése

A vandor tuzumab-vedotin emberellenes specifitásával összhangban a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek nem mutattak keresztreaktivitást az egér Steap1-gyel (4a, d, e kiegészítő ábra). Ezt azonban arra használtuk fel, hogy a három humán STEAP1 extracelluláris domént (ECD) egyedileg helyreállítsuk az egér Steap1-re (4f. kiegészítő ábra), hogy meghatározzuk, mely ECD-k kritikusak a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek epitópfelismeréséhez. Az együtttenyésztési kísérleteket STEAP1-BBζ CAR T-sejtekkel és DU145-sejtekkel végezték, amelyeket úgy alakítottak ki, hogy az egér Steap1-et expresszálják, az egér ECD-k emberi ECD-kkel való egyéni helyettesítésével. Azt találtuk, hogy a humán STEAP1 ECD2, de az ECD1 vagy ECD3 nem társult a STEAP1-BBζ CAR T-sejt aktiválásához (4g. kiegészítő ábra). Érdekes módon az emberi STEAP1 és az egér Steap1 ECD2 93,9%-os (31/33 aminosav) homológiát mutatott (4h kiegészítő ábra), ami azt jelzi, hogy a humán STEAP1 Q198 és/vagy I209 kulcsfontosságú a STEAP1-BBζ produktív felismeréséhez. CAR T-sejtek. A Q198-ról kimutatták, hogy kölcsönhatásba lép a 120.545-ös Fab-val egy kölcsönhatási hotspot részeként, amely egy nemrégiben kriogén elektronmikroszkóppal feloldott szerkezeten alapul22. A humán STEAP fehérjecsalád közül a STEAP1B rendelkezik a legnagyobb homológiával a STEAP145-tel. Három STEAP1B transzkriptumot azonosítottak, amelyek mindegyike a humán STEAP1 ECD2 aminosavszekvenciájának teljes konzerválását mutatja (kiegészítő 5a. ábra). A TOPCONS46 konszenzusos membrántopológia előrejelző algoritmus azt jósolta, hogy az ECD2 doménszekvenciák extracellulárisak a három STEAP1B fehérje izoformában (kiegészítő 5b. ábra), jóllehet a STEAP1B esetében a hSTEAP1-hez képest alacsony megbízhatóságú pontszámmal rendelkezik, mivel az öt topológia modell között nincs konszenzus. (OCTOPUS, Philius, PolyPhobius, SCAMPI és SPOCTOPUS) a TOPCONS által használt (kiegészítő 5c. ábra). Egy másik, in silico rejtett Markov-modell-alapú topológia előrejelző eszközzel, a TMHMM47-tel végzett korábbi analízis arra is utalt, hogy ez a szekvencia inkább intracelluláris lehet, mint extracelluláris a STEAP1B fehérje 1-es és 245-ös izoformájában. A STEAP1B kristályszerkezetét azonban még nem határozták meg, hogy közvetlenül alátámasztja. ezeket a jóslatokat. Annak érdekében, hogy funkcionálisan értékeljük, hogy a STEAP1- BBζ CAR T-sejtek reaktívak lehetnek-e a STEAP1B-vel szemben, ko-kultúrákat végeztünk a STEAP1B mindhárom izoformájának expresszálására tervezett DU145 vonalak felhasználásával. Nem találtunk bizonyítékot a STEAP1-BBζ CAR T-sejt aktiválására (kiegészítő 5d. ábra), ami arra utal, hogy a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek által felismert STEAP1 epitóp nem biztos, hogy egy ektodomén részeként jelenik meg STEAP1B által a látszólagos szekvenciahomológia ellenére.

2. ábra|Második generációs 4-1BB kiméra antigénreceptorok (CAR) szűrése a STEAP1 CAR T-sejtes terápia vezetőjének azonosítása érdekében. a lentivírus STEAP1 CAR konstrukciója és variációja rövid, közepes és hosszú távtartókon alapuló vázlata. LTR hosszú terminális ismétlődés, MNDU3 Moloney egér leukémia vírus U3 régió, scFv egyláncú variábilis fragmens, VL variábilis könnyű lánc, VH variábilis nehéz lánc, tm transzmembrán, EGFRt csonka epidermális növekedési faktor receptor, 4/2 NQ {{1{{28 }}}} CH2 domén mutációk az Fc-gamma receptorokhoz való kötődés megakadályozására. b STEAP1 immunblotja 22Rv1 szülői sejtekben, STEAP1 knockout (ko) sejtekben és STEAP1 ko sejtekben a STEAP1 megmentésével. c Az IFN-enzim-kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA) nem transzdukált T-sejtek vagy STEAP1-BBζ CAR T-sejtek együttes tenyésztésének eredménye a 22Rv1 alvonalak mindegyikével 1:1 arányban 24 órában (p < 0.001). A (d) 22Rv1 és (e) 22Rv1 STEAP1 ko célsejtek relatív sejtéletképessége az idő függvényében, élő sejt fluoreszcens képalkotással mérve (balra) STEAP1-BBζ CAR T sejtekkel (p < 0,001) vagy ( jobbra) nem transzdukált T-sejtek változó effektor-cél (E:T) sejtarány mellett. f Immunblotok, amelyek demonstrálják a STEAP1 expresszióját androgénreceptor (AR)-pozitív humán prosztatarák sejtvonalakban, de nem AR-negatív prosztatarák sejtvonalakban. g IFN kvantifikálása ELISA-val akár nem transzdukált T-sejtek, akár STEAP1- BBζ CAR T-sejtek együttes tenyészeteiből az (f) pontban felsorolt ​​humán prosztatarák sejtvonalak mindegyikével, 1:1 arányban 24 órában. h Immunblotok a STEAP1-hez a 22Rv1, PC3 és PC3 STEAP1 ko alvonalakban. I IFN-kvantifikálás ELISA-val nem transzdukált T-sejtek vagy STEAP1- BBζ CAR T-sejtek társtenyészeteiből, minden egyes sejtvonallal a (h)-ban, 1:1 arányban 24 órában (p < 0,001). A panelekhez (c–e, g és i) n=4 biológiai ismétlést használtunk állapotonként, és a hibasávok a SEM átlagát jelentik. A (b, f, h) panel n=3 biológiai ismétlődésre jellemző eredményeket jelenít meg. A GAPDH-t fehérjeterhelési kontrollként alkalmaztuk. A (c) és (i) panelekhez kétutas ANOVA-t használtunk Sidak többszörös összehasonlító tesztjével. A (d) és (e) panelek esetében kétutas ANOVA-t alkalmaztunk Tukey többszörös összehasonlítási teszttel. A forrásadatokat a Forrásadatok fájl tartalmazza.

A STEAP{0}}BBζ CAR T-sejt-termékek jellemzése donorok sorozatában

Ezt követően egészséges donoroktól gyűjtött perifériás vér mononukleáris sejtjei (PBMC) három független készletével profiloztuk a STEAP1-BBζ CAR T-sejt-termékek kiterjedését, transzdukciós hatékonyságát és immunfenotípusát. Általában megfigyeltük a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek 20--40-szeres növekedését a tenyésztést követő 11 napon belül (kiegészítő 6a. ábra). Az EGFRt+ CD8 T-sejtek százalékos aránya 24,3-54,2%, míg az EGFRt+ CD4 T-sejtek százalékos aránya magasabb volt, és 60,1-74,9% volt a STEAP1-BBζ CAR T-sejt termékeinkben (kiegészítő 6b. ábra). Megvizsgáltuk a PD-1 és a LAG-3 T-sejt-kimerülési markerek expresszióját a nem transzdukált és a STEAP1- BBζ CAR T-sejt-alcsoportokban, és nem tapasztaltunk szignifikáns expressziós növekedést (kiegészítő 6c. ábra). ). Ez a megállapítás arra utalt, hogy a STEAP1-BBζ CAR gyenge vagy hiányzik a tónusos jelátvitel, ami biztató volt, mivel a konstitutív CAR jelátvitel negatívan befolyásolhatja a CAR T sejt effektor funkcióját48. Mind az őssejt-memória T-sejt (Tscm), mind a központi memória T-sejt (TCM) fenotípusát összefüggésbe hozták a CAR T-sejt-terápia terápiás hatékonyságával, mivel elősegítik a tartós proliferációt és perzisztenciát in vivo 49–51. A nem transzdukált és STEAP1-BBζ CAR T-sejt-alcsoportok immunfenotipizálása a Tscm-sejtek magasabb gyakoriságát mutatta, mint a T-sejt-alcsoportok azon donor PBMC-kben, amelyekből a sejttermékek származnak (kiegészítő 6d. ábra). Ez a hatás valószínűleg annak köszönhető, hogy IL-7 és/vagy IL-15 hozzáadódik a T-sejt-expanziós tápközeghez, mivel ezekről a citokinekről kimutatták, hogy megőrzik és fokozzák a Tscm differenciálódását51,52. Elemzésünk a Tcm-populációk feldúsulását is feltárta, különösen a CD8 STEAP1-BBζ CAR T-sejtekben (kiegészítő 6e. ábra).

A STEAP1-BBζ CAR T-sejtek jelentős daganatellenes hatást mutatnak disszeminált prosztatarák-modellekben, natív STEAP1 expresszióval immunhiányos egerekben

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Az in vivo daganatellenes aktivitás kezdeti szűréseként 22Rv1 szubkután xenograft tumorokat állapítottunk meg hím NOD scid gamma (NSG) egerekben. Amikor a daganatok megközelítőleg 100 mm3-re nőttek, az egereket egyetlen intratumorális injekcióval kezelték 5 × 106 nem transzdukált T-sejtből vagy STEAP1-BBζ CAR T-sejtekből. A STEAP1- BBζ CAR T-sejtekkel végzett intratumorális kezelés szignifikáns tumornövekedés-gátlással járt, ami statisztikailag szignifikáns volt a kezelés 18. napjára (3a. ábra). Az egereket a 25. napon leölték, és a STEAP1-BBζ CAR T-sejtekben kezelt egerek maradék daganatai nagy területen nekrotikus törmeléket mutattak, és életképes daganatok régióit CD3+ STEAP1-BBζ-vel infiltrálták. CAR T-sejtek (kiegészítő 7a. ábra). A STEAP1 expresszió konzervált volt a daganatokban a kezelési csoportokban (kiegészítő 7b. ábra). A szentjánosbogár-luciferáz (Luc) expressziójának erősítésére lentivírussal transzdukáltuk a 22Rv1 sejteket, és az 106 22Rv1-fLuc sejteket hím NSG egerek farokvénáiba fecskendeztük. A metasztatikus kolonizációt élő biolumineszcencia képalkotással (BLI) tettük láthatóvá két hét elteltével, amikor is az egereket egyetlen intravénás injekcióval kezelték 5 × 106 nem transzdukált T-sejtből vagy STEAP1-BBζ CAR T-sejtekből (3b. ábra). . A sorozatos BLI a betegség gyors progresszióját tárta fel a nem transzdukált T-sejtekkel kezelt egereknél, míg a STEAP1-BBζ CAR T-sejteket kapó egereknél jelentős késés mutatkozott a tumor progressziójában (3c, d ábra) és a túlélés meghosszabbításában (97 nap versus 31 nap). , p=0.0018 log-rank teszttel, 3e. ábra). Nem volt szignifikáns különbség az egerek súlyában a kezelési karok között (7c. kiegészítő ábra). A tumorok IHC-festése a vizsgálat végén a STEAP1 expressziójának szignifikáns csökkenését mutatta (kiegészítő 7d. ábra), ami azt jelzi, hogy az antigénszökés a rezisztencia mechanizmusa. Ez azonban nem valószínű, hogy a prosztatarák egy változatos állapotába való transzdifferenciálódás eredménye, mivel nem értékeltük a morfológiai változásokat, az AR és PSMA expresszió elvesztését53 vagy a SYP expresszió növekedését (7d. kiegészítő ábra). A STEAP1 elvesztésének prosztatarákra gyakorolt ​​globális hatásának vizsgálatára az általunk korábban elkészített izogén 22Rv1 vadtípus (wt), 22Rv1 STEAP1 ko és 22Rv1 STEAP1 ko + mentősejtvonalak transzkriptomprofiljait végeztük el (2b. ábra). A 22Rv1 STEAP1 ko sejteket a 22Rv1 wt sejtekkel összehasonlító differenciális génexpressziós analízis ~1700 szignifikánsan alulszabályozott gént azonosított (FDR 0,05 vagy annál kisebb, szoros változás<2) with STEAP1 knockout. Rescue of STEAP1 expression in the 22Rv1 STEAP1 ko cells revealed that ~600 genes were significantly upregulated (FDR ≤ 0.05, fold-change>2) STEAP1 add-back segítségével (kiegészítő 8a. ábra). A Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) számos olyan biológiai utat jelölt meg, amelyeket a STEAP1 expresszió modulációja szabályozhat. Ezek közül kiemelkedő volt a sejtciklus progressziója és a többszörös anyagcsere-folyamatok, beleértve a Kreb-ciklust és a glikolízist, amelyeket a STEAP1 kiütése negatívan gazdagított, és a STEAP1 hozzáadásával megmentett (kiegészítő 8b. ábra). Adatainkra a validált 31-génsejtciklus-progressziós (CCP) aláírást54 alkalmaztuk, amely a STEAP1 kiütéssel kapcsolatos CCP aláírás szignifikáns leszabályozását mutatta, −0,8-as pontszámmal, ami jelentősen megnőtt a következőre: {{ 14}}.5 a STEAP1 kifejezés megmentésével (kiegészítő 8c. ábra). Ezek az adatok összhangban vannak egy korábbi publikációval, amely azt jelzi, hogy a STEAP1 leütése az LNCaP prosztatarák sejtvonalban rontja a sejtek életképességét és proliferációját, miközben apoptózist indukál37. Azt is megjegyeztük, hogy az antigénfeldolgozás és -prezentáció az egyik legjelentősebben dúsított KEGG útvonal volt a STEAP1 kiütéssel (8b. kiegészítő ábra). Megfigyeltük a gének jelentős csökkenését, beleértve a PSME1-et (1. proteaszóma aktivátor alegység), amely az immunproteaszóma komplex tagja, a TAP1 (transzporter 1, ATP-kötő kazetta alcsalád tagja), amely kritikus a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) I. osztályú peptid- loading komplexet, valamint számos MHC I. és II. osztályú gént, mint például az MR1 (fő hisztokompatibilitási komplex, I. osztályhoz kapcsolódó), HLA-DQ-B1 és HLA-DQB2 (kiegészítő 8d. ábra). Tovább vizsgáltuk a STEAP1- BBζ CAR T-sejtes terápiával kezelt 22Rv1 disszeminált modellekből gyűjtött daganatokat, amelyek antigénvesztést mutattak (3c. ábra, 7d. kiegészítő ábra) transzkriptomanalízissel. A differenciális génexpressziós analízis és az azt követő GSEA, amely a STEAP1-BBζ CAR T-sejt-terápiával kezelt egerek 22Rv1-es áttétes daganatait hasonlította össze a nem transzdukált T-sejtekkel kezelt egerekből, az MHC-ben, a citotoxikus limfocitákban és a T-sejt-aktivációban szerepet játszó útvonalak negatív feldúsulását mutatta. Kiegészítő 9a, b) ábra). Kifejezetten értékeltük az MHC I. és II. osztályú gének expresszióját is, és megfigyeltük azok jelentős lelassulását a STEAP1-BBζ CAR T-sejt-terápiával kezelt 22Rv1 daganatokban (kiegészítő 9c. ábra). Ezt az eredményt tovább igazolta, hogy ezekben a daganatokban jelentősen csökkent a HLA-A, B, C festődés IHC hatására (kiegészítő 9d. ábra). Ezeknek az adatoknak a lehetséges következménye az, hogy a STEAP1-BBζ CAR T-sejt-terápiával végzett kezelés és az ebből eredő STEAP1 tumorantigén-expresszió elvesztése prosztatarákban további immunterápiás rezisztenciát eredményezhet az antigénfeldolgozás és -prezentáció károsodása miatt. Hím NSG egereket is beoltottunk C4-2B-fLuc sejtekkel farokvéna injekcióval. A C4-2B az LNCaP55 kasztráció-rezisztens alvonala, növekedési kinetikája jobban megfelel a tipikus prosztataráknak. Négy héttel az injekció beadása után a metasztatikus kolonizációt BLI-vel igazoltuk, és az egereket egyetlen intravénás injekcióval kezeltük 5 × 106 nem transzdukált T-sejtből vagy STEAP1-BBζ CAR T-sejtekből (3b. ábra). A sorozatos BLI teljes választ mutatott minden olyan egérben, amely STEAP1-BBζ CAR T-sejteket kapott a kezelést követő öt héten belül (3f., g. ábra). Megállapítottuk a megnövekedett súlycsökkenés tendenciáját a nem transzdukált T-sejtes kezelési csoportban (kiegészítő 10a. ábra), de ez nem volt statisztikailag szignifikáns. A STEAP1-BBζ CAR T-sejtekkel kezelt egerek boncolása nem mutatott makroszkópos betegséget, és a szervek ex vivo BLI-je sem mutatott ki jelet (10b. kiegészítő ábra), ami arra utal, hogy ezek az egerek valószínűleg meggyógyultak. A kísérlet végén azonosítottuk a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek perifériás perzisztenciáját a kimutatható CD3+ EGFRt+ lépsejtek jelenléte alapján (3h. ábra).

3. ábra|A STEAP1-BBζ CAR T-sejtes terápia in vivo daganatellenes hatása prosztatarák modellekben natív STEAP1 expresszióval. a 22Rv1 szubkután daganatok mennyisége NSG egerekben (n=4 a nem transzdukált T-sejtek csoportjában és n=5 a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek csoportjában) idővel egyetlen 5 intratumorális injekció beadása után × 106 nem transzdukált T-sejt vagy STEAP{{10}}BBζ CAR T-sejt normál CD4/CD8 arány mellett. p < 0.0001 a 20. és 25. napon. Az oszlopok a SEM átlagát jelentik. b A 22Rv1 (fent) és a C4-2B (alul) disszeminált modellek tumoros provokációs kísérleteinek vázlata. Luc szentjánosbogár luciferáz, BLI biolumineszcencia képalkotás. c Soros élő biolumineszcencia képalkotás (BLI) NSG egerekről, amelyekbe 22Rv1-fLuc áttéteket ültettek be, és egyetlen intravénás injekcióval kezeltek 5 × 106 nem transzdukált T-sejtet vagy STEAP1-BBζ CAR T-sejtet normál CD4/ CD8 arányok a 0. napon. A piros X az elhalt egereket jelöli. Megjelenik egy sugárzási skála. d Grafika, amely a teljes fluxus mennyiségi meghatározását mutatja az egyes egerek élő BLI-jéből a (c) pontban. e A (c) pontban szereplő egerek Kaplan–Meier túlélési görbéi, statisztikai szignifikancia log-rank (Mantel-Cox) teszttel. A (c–e) panelekhez állapotonként n=5 egeret használtunk. f C4-2B áttétekkel beültetett, 5 × 106 nem transzdukált T-sejt vagy STEAP1-BBζ CAR T-sejt egyszeri intravénás injekciójával kezelt NSG egerek BLI-sorozata, normál CD4/CD8 arány mellett a napon 0. A piros X elhullott egereket jelöl. Megjelenik egy sugárzási skála. g Az (f) pontban szereplő egyes egerek élő BLI-jéből származó teljes fluxus időbeli számszerűsítését bemutató diagram. Az (f, g) panelekhez n=4 egeret használtunk a nem transzdukált T-sejtek csoportjában és n=5 egeret a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek csoportjában. h CD3+ EGFRt+ STEAP1-BBζ CAR T-sejtek mennyiségi meghatározása STEAP1-BBζ CAR T-sejtekkel (n=4) a végén kezelt egerek lépsejtek áramlási citometriájával A 49. napon az oszlopok az átlagot jelentik. Az (a) panelhez kétutas ANOVA-t használtunk Sidak többszörös összehasonlító tesztjével. A forrásadatokat a Forrásadatok fájl tartalmazza.

Egér az egérben STEAP1 CAR T-sejtes vizsgálatok bizonyítják a daganatellenes terápiás hatékonyságot

A STEAP1-BBζ CAR T-sejtek aktivációja és citolitikus aktivitása a PC3 sejtvonal nagyon alacsony STEAP1 antigénsűrűségében (~1500 molekula/sejt) megfigyelhető (2g–i. ábra, 11a, b kiegészítő ábra). ) és az in vivo daganatellenes aktivitásra vonatkozó bizonyítékok egy disszeminált PC3-fLuc tumormodellben (kiegészítő 11c–e. ábra) aggodalmát fejezték ki a daganaton kívüli célpont toxicitás lehetőségével kapcsolatban. Annak érdekében, hogy kiértékeljük a lehetséges toxicitást egy kezelhető modellszervezetben, létrehoztunk egy humán STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) egeret, amelyben a humán STEAP1 gén az egér Steap1 gén lókuszába került a C57Bl/6 háttéren ( 4a. ábra). Egy egérkolóniát hoztak létre a farok DNS polimeráz láncreakciójával (PCR) végzett genotipizálással (4b. ábra). Mind a homozigóta, mind a heterozigóta hSTEAP1-KI egerek nem mutattak nyilvánvaló fenotípusos vagy szaporodási rendellenességeket a vad típusú alomtársakhoz képest. Hím és nőstény heterozigóta hSTEAP1-KI (hSTEAP1-KI/+) egereken kvantitatív reverz transzkripciós PCR-en (qRT-PCR) alapuló szöveti felmérést végeztek a humán STEAP1 expresszióra vonatkozóan, és a legnagyobb relatív expressziót mutatták ki. a prosztatában, majd a méhben és a mellékvesében (4c. ábra). A férfi hSTEAP1-KI/+ prosztata és mellékvesék STEAP1 IHC-vel végzett további in situ analízise kimutatta, hogy a humán STEAP1 expressziója a prosztata luminális hámsejtjeire korlátozódik (4d. ábra), valamint a mellékvesekéregben (4e. ábra). . A STEAP1 CAR murinizált változata, az úgynevezett STEAP1-mBBζ CAR, amelyben az scFv és az IgG4 csukló-CH2-CH3 távtartó megmaradt, de a CD28 transzmembrán domén, a 4-1BB kostimulációs tartomány , és a CD3ζ aktivációs domént egérortológjaikkal helyettesítettük, gammaretrovirális konstrukcióba klónoztuk (4f. ábra). Ezenkívül a humán EGFRt transzdukciós markert egy csonka egér CD19-re (mCD19t) cseréltük, hogy minimalizáljuk a lehetséges immunogenitást. Megerősítettük az egér lépsejtekből dúsított T-sejtek hatékony retrovírus-transzdukcióját (4g. ábra), és kimutattuk, hogy az egér STEAP1-mBBζ CAR T-sejtek képesek a humán STEAP1 expresszálására tervezett RM9 egér prosztatarák sejtvonal56 citolízisét indukálni. (RM9- hSTEAP1) lentivírus transzdukcióval (4h. ábra). Az egér STEAP1-mBBζ CAR T-sejtek in vivo hatékonyságát egy disszeminált RM9-STEAP1-fLuc tumormodellben validálták NSG egerekben (kiegészítő 12a. ábra). Egy héttel az RM9-STEAP1-fLuc sejtek farokvénás injekciója után az egereket 5 × 106 nem transzdukált egér T-sejttel vagy egér STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekkel kezelték farokvéna injekcióval. . Azok az egerek, amelyek nem transzdukált egér-T-sejteket kaptak, ellenőrizetlen betegség progresszióját mutatták, míg a STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekkel kezelt egerek egyenletesen gyors regressziót mutattak, amit tíz nappal később egy következő relapszus követett (12b. kiegészítő ábra, c). A STEAP1-mBBζ CAR T-sejt-terápia statisztikailag szignifikáns túlélési előnnyel járt (22 nap versus 12 nap, p=0,0039 log-rank teszttel, 12d. kiegészítő ábra). A testsúlycsökkenés mindkét kezelési csoportban nyilvánvaló volt, mivel a daganatos teher a halál előtt megnőtt (12e, f kiegészítő ábra). A boncolás során összegyűjtött egér lépsejtek analízise a STEAP1-mBBζ CAR T-sejtek perifériás perzisztenciáját mutatta ki az mCD3+ mCD19t+ sejtek kimutatásával az adoptív transzfert követő 24 napig (kiegészítő 12g. ábra). Mindkét kezelési csoportban egerek tüdejét gyűjtöttük ki, és a STEAP1 IHC a STEAP1 expressziójának elvesztését mutatta a STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekkel kezelt egerek tüdőmetasztázisaiban (kiegészítő 12h. ábra). Ezt követően kiterjesztettük a klonális RM9-STEAP1-fLuc vonalakat, hogy meghatározzuk, vajon a megfigyelt tumorantigén-szökés a STEAP1 expresszió már meglévő heterogenitásának eredménye-e. A kísérletet megismételtük egy klonális, disszeminált RM9-STEAP1- fLuc tumormodellel NSG egerekben (kiegészítő 13a. ábra). Ebben az összefüggésben a STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekkel kezelt egerek azonnali és tartós teljes választ mutattak (kiegészítő 13b–d ábra). Ezek az eredmények rávilágítanak a STEAP1-mBBζ CAR T-sejtek STEAP1+ prosztatarák felszámolásában betöltött potenciáljára, és arra is utalnak, hogy kiegészítő terápiás stratégiákra lehet szükség a rezisztencia leküzdéséhez az előrehaladott prosztatarákos betegek azon alcsoportjaiban, ahol a STEAP1 heterogenitása. expresszió jelen van (1e. ábra).

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

A STEAP1 CAR T-sejtterápia biztonságos a humanizált STEAP1 egérmodellben

A STEAP1-mBBζ CAR T-sejt-terápia preklinikai biztonságosságának és hatékonyságának vizsgálata érdekében hím heterozigóta hSTEAP1-KI egereket szingenikus, nem klonális RM9-STEAP{{4}-vel oltottunk be. }fLuc sejtek farokvéna injekcióval (5a. ábra). Miután körülbelül egy héttel később BLI-vel megerősítették a metasztatikus kolonizációt, az egerek 100 mg/kg-os előkondicionáló ciklofoszfamidot kaptak intraperitoneális injekcióval57. Egy nappal később az egereket véletlenszerűen 5 × 106 nem transzdukált egér T-sejttel vagy egér STEAP1-mBBζ CAR T-sejttel kezelték farokvéna injekcióval. Minden egér, amely egér STEAP1-mBBζ CAR T-sejteket kapott, a kezelés megkezdésének első hetében a tumorterhelés csökkenését mutatta a BLI alapján (5b., c. ábra). A megfigyelt válasz rövid életű volt, de a túlélés szerény meghosszabbodásához vezetett (21 nap versus 12 nap, p=0.0138 log-rank teszttel, 5d. ábra) – hasonlóan a nem-klonális RM eredményeihez 9-STEAP1-fLuc kísérletek NSG egereken (12d. kiegészítő ábra). Az egér STEAP1-mBBζ CAR T-sejtes terápiájával nem fordult elő súlyos toxicitás vagy korai halálozás ezen a dózisszinten, ahol egyértelmű bizonyítékot figyeltek meg a tumorellenes hatékonyságra. A súlycsökkenés a megnövekedett tumorterheléssel járt, de mindkét kezelési karban közös volt (5e., f. ábra). A STEAP1-mBBζ CAR T-sejtes terápia lehetséges toxicitásának további felmérésére egy hasonló kísérletet végeztek párhuzamosan heterozigóta hSTEAP1-KI egereken, amelyek RM9-hSTEAP1 daganatokat hordoztak, és nem voltak daganatok. A nem transzdukált T-sejtekkel vagy STEAP1- mBBζ CAR T-sejtekkel kezelt, nem daganatos egerek nem mutattak különbséget a túlélésben (14a. kiegészítő ábra) vagy a súlyos toxicitásban, beleértve a testtömeg-csökkenést (kiegészítő 14b. ábra). Mivel a STEAP1-BBζ CAR egy módosított IgG4 spacerből áll, amely potenciálisan immunogén lehet, ebben a kísérletben egerek retroorbitális vérzéseinek összegyűjtésével értékeltük az egér anti-humán antitest (MAHA) reakcióját. A STEAP1-BBζ CAR T-sejtekkel végzett kezelést követő 8. napon az egerek szérumában nem volt kimutatható anti-humán IgG és IgM antitest (kiegészítő 14c. ábra).

Fontos, hogy a STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekkel kezelt heterozigóta hSTEAP1-KI egerek nem mutattak nyilvánvaló szövetkárosodást vagy fokozott CD3+ T-sejtek infiltrációját a prosztatában (kiegészítő 15a, b ábra). ) vagy mellékvese (kiegészítő 15c., d. ábra) a nem transzdukált T-sejtekkel kezelt társaikhoz képest, ami arra utal, hogy nincs daganaton kívüli célpont toxicitás. A kísérlet végén összegyűjtött tüdők humán STEAP1 expressziót mutattak RM9-hSTEAP1 tüdőmetasztázisokban regionális heterogenitás mellett nem transzdukált egér T-sejtekkel kezelt egerekben (5g. ábra). Másrészt az egér STEAP{11}}mBBζ CAR T-sejtekkel kezelt egerekből származó daganatai ismét kimutatták a humán STEAP1 expresszió hiányát (5h. ábra). Annak értékelésére, hogy az egér STEAP1- mBBζ CAR T-sejt-terápia és a humán STEAP1 antigénvesztés is befolyásolhatja-e az antigénprezentációt az RM9-hSTEAP1 daganatokban, IHC-t végeztünk rágcsáló béta-2-mikroglobulinra (B2m). ), amely az MHC I. osztályú molekulák kulcsfontosságú összetevője. Progresszív tumorokban a B2m expresszió szignifikáns csökkenését figyeltük meg egér STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekkel végzett kezelés után a nem transzdukált T-sejtekkel összehasonlítva (kiegészítő 15e, f ábra), összhangban a 22Rv1 modellben elért eredményeinkkel.

4. ábra|Egér az egérben rendszer létrehozása emberi STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) egérmodell és murinizált STEAP1 CAR segítségével. egy séma, amely a homológ rekombinációs stratégiát mutatja be, amely egy célzó vektort használ a humán STEAP1 exonok 2–5. exonjainak beütésére az egér Steap1 lókuszába a C57Bl/6 háttéren. FRT Flippase felismerő cél. b A vad típusú (+/+), heterozigóta (KI/+) vagy homozigóta (KI/KI) egerek farokvégének genotipizálásából származó PCR-termékek megjelenítése vad típusú vagy hSTEAP1-KI allélok egy részének amplifikálására szolgáló primerpárok használatával . NTC null sablon vezérlés. Reprezentatív gélkép n=3 biológiailag független kísérletből. c A humán STEAP1 expressziójának qPCR-je 18S expresszióra normalizálva a hSTEAP1-KI/+ egerek szöveteinek felmérésében. n=3 a nem-specifikus szervek és n=6 a közös szervek esetében. Az oszlopok a SEM átlagát jelentik. Fényképmikroszkópos felvételek STEAP1 IHC festésről (d) prosztata szövetekről (balra) +/+ és (jobbra) KI/+ egerekből és (e) KI/+ egér mellékveséről. Skálasávok=50 µm. A (d, e) panel esetében n=3 biológiailag független mintán végeztünk STEAP1 immunfestést. f A retrovirális murinizált STEAP1 CAR konstrukció vázlata. MuLV egér leukémia vírus, mCD19t egér csonka CD19. g Aktivált egér T-sejtek retrovirális transzdukciójának hatékonyságának számszerűsítése három független kísérletből az egér CD3+ CD19t+ sejtek gyakorisága alapján áramlási citometriával (p {{40}},0003). h Az RM9 vagy RM9-hSTEAP1 célsejtek relatív sejtéletképessége az idő függvényében, élő sejt fluoreszcenciás képalkotással mérve egér STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekkel vagy nem transzdukált T-sejtekkel végzett 1:1 arányú együtttenyésztéssel (p < 0,0001). n=4 biológiai ismétlés állapotonként. A hibasávok a SEM átlagát jelentik. A (g) panelhez nem párosított, kétvégű Student-féle t-próbát használtunk Welch-korrekcióval. A (h) panelben kétutas ANOVA-t használtunk Sidak többszörös összehasonlító tesztjével. A forrásadatokat a Forrásadatok fájl tartalmazza.

5. ábra|Egér STEAP1-mBBζ CAR T-sejtek hatékonyságának és biztonságosságának meghatározása szingenikus, disszeminált prosztatarákot hordozó hSTEAP1-KI egerekben.

A kollagénkötő domén-IL-12 fúziós citokin tumorellenes válaszokat vált ki a fokozott T-sejt-receptor jelátvitel és antigénprezentáció révén

Az IL{{0}} egy heterodimer citokin, amely p40 és p35 alegységekből áll, és szabályozza a T-sejtek válaszait, és IFN-termeléshez vezet. Számos preklinikai modellben kimutatták a szisztémás IL-12 beadásával összefüggő feltűnő daganatellenes válaszokat58,59, de ennek a terápiás megközelítésnek a klinikára történő átültetése megakadt a dóziskorlátozó toxicitás és a hatástalanság miatt60–63. Alternatív stratégiák ezeknek a problémáknak a megkerülésére az IL{{10}} daganatokban való lokalizálását célozták, akár intratumorális bejuttatással, akár IL-12 fúziós fehérjék megtervezésével, hogy kihasználják a tumor mikrokörnyezetének egyedi tulajdonságait. Az egyik közelmúltban leírt megközelítés a von Willebrand faktor A3 doménjéhez való fúzió, amely kollagénkötő doménként (CBD, 6a. ábra) szolgál, és lehetővé teszi a fúziós fehérjék kötődését a kitett kollagénhez rendezetlen tumor érrendszerben64. Kimutatták, hogy a szisztémás CBD-IL-12 terápia átalakítja az immunológiailag "hideg" egér emlőrák és melanoma modellek daganatos mikrokörnyezetét a fokozott IFN-jelátvitel révén, és együttműködik az anti-PD-vel{{20}} immunellenőrzési pont gátlás a tumor eradikációjának kiváltására65. Megkérdeztük, hogy a CBD-IL{23}} hatékony lehet-e a prosztatarák „hideg” állapotból „meleg” állapotba állításában, és daganatellenes válaszok kiváltásában. Szubkután, szingén RM9 és Myc-CaP tumorokat állapítottak meg hím C57Bl/6 és FVB egerekben, és az egereket véletlenszerűen hordozóval, anti-PD-1 vagy CBD-IL-12 . A szisztémás CBD-IL-12 szignifikáns tumornövekedés-gátlást indukált mind a szingenikus RM9, mind a Myc-CaP tumormodellekben, amelyek egyébként gyengén reagáltak az anti-PD-1 terápiára (6b. ábra, 16a. kiegészítő ábra) . A CBD-IL-12 hatásmechanizmusaiba való további betekintés érdekében egysejtű RNS-seq (scRNA-seq) analízist végeztünk vivőanyaggal vagy CBDIL-lel{46}} kezelt egerek RM9 daganatairól. Az egységes sokaság-közelítés és a vetítési diagramok a tumor-epiteliális, fibroblaszt- és endoteliális sejtkompartmentek jelentős csökkenését mutatták ki (16b. kiegészítő ábra), ami összhangban van a daganatellenes aktivitással. A veleszületett és adaptív immunsejt-alcsoportok marker alapú profilozása (6c, d ábra) az scRNA-seq adatokban a CD8+ T-sejtek számának jelentős növekedését mutatta ki (7,55 vs. 0,76%) , antigén keresztbemutató sejtek, beleértve az XCR1+ IRF8+ hagyományos 1-es típusú dendrites sejtet (cDC1, 1,33 vs. 0%), CD86+ INOS2+ M1 polarizált makrofágokat ( 2,26 vs 0%) és CD64+ F4/ 80+ monociták/makrofágok (29,2 vs 4,43%) a CBDIL-12 kezelési csoportból származó daganatokban a hordozó kontrollcsoporthoz képest. Az immunszuppresszív CD163+ CD{206+ M2 polarizált makrofágok (0 vs. 0,25%) és Ly6G+ neutrofilek (0,52 vs. 1,08%) csökkenése szintén összefüggésbe hozható a CBD-IL-12 terápiával. Az IHC-elemzés megerősítette, hogy a hordozóval kezelt RM9-daganatokból általában hiányoztak a CD8+ T-sejtek, míg a CBD-IL-12-vel kezelteknél a CD8+ T-sejtek láthatóan jelentős beszűrődését mutatták ki (16c. kiegészítő ábra) . A daganatsejtek a Psmb8 és Psmb9 proteaszóma és immunproteaszóma alegységek, valamint a H2-}K1, H2-D1 és B2m fő hisztokompatibilitási komplexum I. osztályú (MHC I) gének expressziója gazdagodott, ami összhangban van az antigénfeldolgozás fokozódásával és prezentációs gépek (6e. ábra, 16d. kiegészítő ábra). Ezzel párhuzamosan a T-sejtek fokozott génexpressziót mutattak, amely a T-sejt-receptor jelátvitelhez és immunregulációs kölcsönhatásokhoz kapcsolódik egy limfoid és egy nem limfoid sejt között (6f. ábra, 16e. kiegészítő ábra). A mononukleáris fagocitarendszer (MPS) sejtjei gazdag génexpressziót mutattak az antigénfeldolgozáshoz és a keresztprezentációhoz, valamint a citokin jelátvitelhez kapcsolódóan (16f, g kiegészítő ábra). Ezek a vizsgálatok megállapították a CBD-IL{113}} daganatellenes hatását a prosztatarák modelljeiben a tumor mikrokörnyezetének újraprogramozása és a veleszületett és adaptív immunrendszer bevonása révén.

Fokozott tumorkontroll egyidejű STEAP1-mBBζ CAR T sejt és CBD-IL-12 terápiával

Ezt követően azt feltételeztük, hogy a daganatellenes immunválasz CBD-IL-12 terápiával történő kiterjesztése javíthatja a STEAP1-mBBζ CAR T-sejt-terápia terápiás hatékonyságát prosztatarákban azáltal, hogy felveszi a harcot a tumorantigén heterogenitás ellen, és megmenti az antigén-feldolgozást és bemutatás. Ezért szingenikus, nem klonális RM9-STEAP1-fLuc metasztázisokat állapítottunk meg hím heterozigóta hSTEAP1-KI egerekben, és véletlenszerűen 5 × 106 egerekkel végzett kezelésre válogattuk. nem transzdukált egér T-sejtek vagy egér STEAP1-mBBζ CAR T-sejtek farokvéna injekcióval hetente CBD-IL-12 terápiával vagy anélkül retroorbitális sinus injekcióval. Azok a csoportok, amelyek önmagában vagy STEAP1-mBBζ CAR T-terápiával kombinálva kaptak CBD-IL-12-terápiát, nem kaptak limfodepletáló ciklofoszfamidot (7a. ábra). A sorozatos BLI a betegség gyors progresszióját tárta fel a nem transzdukált T-sejtekkel és CBD-IL-12-mal kezelt egerekben, míg a STEAP1-BBζ CAR T-sejteket CBD-IL-12-kezeléssel kombinálva kapó egereknél szignifikáns hatást tapasztaltak. a tumor progressziójának késése (7b., c. ábra). Fontos, hogy az egér STEAP1- mBBζ CAR T-sejtekkel és a heti CBD-IL-12 kombinált kezelés a teljes túlélés statisztikailag szignifikáns meghosszabbodásával járt az összes többi kezelési csoporthoz képest (7d. ábra). A kezelés 0. és 8. napján gyűjtött retroorbitális vérzések plazma citokinanalízise szignifikáns növekedést mutatott a proinflammatorikus citokinek IFN-, TNF-, IL-6 és IL-4 szintjében (7e. ábra, kiegészítő ábra). 17) STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekkel és CBD-IL-vel-12 kezelt egerekben. A maradék tumorokat a boncolás során összegyűjtöttük, és a STEAP1 IHC antigénvesztést mutatott mind a STEAP1- mBBζ CAR T-sejtekkel önmagában, mind pedig CBD-IL-12-vel kombinálva kezelt egerek daganataiban (8a. ábra). Ezenkívül megfigyeltük a tumor B2m expressziójának növekedését (8a. ábra) a CBD-IL-12 terápiával összefüggésben. A CD3+ T-sejtek szintén megnövekedtek (8b. ábra) az IL-12-kezelésnek alávetett tumoros állapotokban, de bár a tendencia értékelhető volt, nem találtunk statisztikailag szignifikáns növekedést az intratumorális T-sejtek között STEAP1-mBBζ CAR T sejt és kombinált STEAP1-mBBζ CAR T sejt és CBD-IL{52}} kezelési csoport. A maradék tumorokat, beleértve a kombinált STEAP1-mBBζ CAR T-sejttel és CBD-IL-12-mal kezelt egerekből származó daganatokat, a 10. napon a maximális kezelési válasz (nadir) és a tumor progressziójának (relapszus) compassionate végpontjainál gyűjtöttük össze. Az egyes sejtekhez disszociált és az immunsejt-alcsoportokat multiparaméteres áramlási citometriával jellemeztük (18. kiegészítő ábra). Az scRNA-seq eredményeinknek megfelelően a CBD-IL{60}} kezelés akár önmagában, akár STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekkel kombinálva a CD11b+ Ly6C-/+F4/{{68} jelentős növekedéséhez vezetett. }} MHC-II+ makrofágok (8c., d. ábra, kiegészítő 19a. ábra). A CD11b+ Ly6CF4/80+ MHC-II+ sejtek érett antigénprezentáló makrofágokat képviselnek66, és ez a populáció előnyösen dúsult, és fokozott indukált nitrogén-monoxid-szintáz (iNOS) expressziót mutatott ki a CBD-IL gyulladásos M1 polarizációjának markereként{84} } terápia. Megfigyeltük a cDC1 populáció bővülését és a hagyományos 2-es típusú dendritesejt (cDC2) populáció csökkenését is (8e. ábra, 19b. kiegészítő ábra). A cDC1 szerepet játszik a tumorellenes citotoxikus CD8+ T-sejtek aktiválásában és a terápiás rezisztencia lehetséges mechanizmusaiban. Nem találtunk jelet a tumorba való sejtvándorlásra, míg a cDC2 fontos szerepet játszik a KLRG1+ és a KLRG1- természetes gyilkos CD4+ T-sejtek (beleértve a Tregs67-et is) arányában mutatkozó szignifikáns különbség aktiválásában. . A cDC2 megállapításokkal összhangban a sejtek a kezelési csoportokban (kiegészítő 19d. ábra). A CD4+ FOXP3+ Treg-ek gyakorisági profilja azt mutatta, hogy a Treg asso- of F40/80+ SiglecF+ eozinofilek növekedtek, míg a CBD-IL-12 terápiával neuciált Ly6G+ (kiegészítő) 19c. ábra). Érdekesség, hogy a trofilszám csökkent a CBD-IL{111}} STEAP1--hoz való hozzáadásával, és megfigyeltük, hogy a kiújult daganatokban kombinált STEAP1-mBBζ mBBζ CAR T-sejt-terápia után (8f. ábra, g). Figyelemre méltó, hogy ezeknek a CAR T-sejt- és CBD-IL{116}}-terápiáknak a gyakorisága csökkentette a cDC1-szintet, és a tumorhoz kapcsolódó neutrofilek száma megnőtt a kezelés hatására a Treg-ek növekedésével, ami a citotoxikus CD8 STEAP csökkent beindítását eredményezte{120 }}mBBζ CAR T-sejtek a nem transzdukált T-sejtekhez képest (54 vs. T-sejtek és az immunszuppresszív Treg-jelátvitel 34%-os feldúsulása), csökkent a CBD-IL{124}} terápia mellett, de nőtt a tumor kiújulása esetén a kombinált STEAP után 1-mBBζ CAR T sejt és CBD-IL{127}} terápia (19-42%). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a daganathoz kapcsolódó neutrofilek immunszuppresszív tulajdonságai kiemelkedő szerepet játszhatnak a kezelésrezisztencia és a daganat progressziójának közvetítésében. Összességében ezek az elemzések azt mutatják, hogy a CBD-IL-12 kezelés visszaállítja az ellenséges immunszuppresszív daganatos környezetet gyulladást előidéző ​​állapotba, és kiterjeszti a daganatellenes aktivitást az adoptív módon átvitt STEAP1-mBBζ CAR T-sejt-terápiával együtt. További TCR-repertoárelemzést végeztünk multiplex PCR-alapú TCR béta-lánc szekvenálással68 az egyes kezelési csoportokból a boncoláskor gyűjtött tüdőt hordozó daganatokon. Szignifikáns csökkenést figyeltünk meg a Simpson-klonalitásban a CBD-IL{139}}-mal önmagában és STEAP1-mBBζ CAR T-sejt-terápiával kombinálva kezelt egerekből származó mintákban, ami a megnövekedett intratumorális T-sejt-diverzitásra utalt (1. ábra). 8 óra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CBD-IL-12 hozzáadása a STEAP1 CAR T-sejtes terápia kiegészítéseként előnyös lehet a prosztatarák tumor mikrokörnyezetének átalakítása, az antigén-feldolgozás és -prezentáció fokozása, valamint a gazdaszervezet immunitásának elősegítése révén az epitóp terjedésének elősegítése érdekében.

6. ábra|A szisztémás kollagénkötő domén IL-12 (CBD-IL-12) citokinfúziós terápia gátolja a prosztatarák daganat növekedését és újraprogramozza a tumor immunrendszer mikrokörnyezetét. a CBD-IL-12 vázlata, amely a von Willebrand-faktor A3 doménjából származó p35 és p40 alegységekből áll a CBD-vel fuzionálva. b RM9 szubkután daganatok mennyisége szingén C57Bl/6 egerekben az idő függvényében vivőanyaggal kezelt anti-PD-1 (29 F.1A12 klón) 200 Μg intraperitoneális injekcióval 5 naponta, vagy CBD-IL-12 25 Μg intravénás injekcióval 5 naponta, a 0. naptól kezdődően. n=7 egér a vivőanyaggal és CBD-IL-12 csoportban és n=8 egér az anti-kezelésben -PD1 kezelt csoport. p < 0,0001 a 9. és 12. napon. Az oszlopok a SEM átlagát jelentik. A P-értékek kétutas ANOVA-ból származnak, a Dunnett-féle többszörös összehasonlítási teszttel, ns nem szignifikáns. c Különböző immunsejt-alcsoportok egységes sokasági közelítési és vetítési (UMAP) diagramjai (fent) öt RM9-tumor egysejtes RNS-seq (scRNA-seq) analíziséből, amelyek mindegyike hordozóval vagy CBD-IL-lel kezelt egerekből származott{41} }. Az immunsejt-alhalmaz-specifikus markerek génexpressziójával színezett UMAP diagramok pánmonociták/makrofágok, M1 és M2 polarizált makrofágok, hagyományos 1-es típusú dendritikus sejtek (cDC1), természetes gyilkos (NK) sejtek és 1-es típusú T helper (Th1) számára sejteket. d Az scRNS-seq analízissel azonosított specifikus immunsejt-populációk gyakoriságát bemutató diagramok (a CD45 + immunsejtekhez viszonyítva), beleértve a CD4+ és CD8+ T-sejteket, Th1 (Infg+ Tbx{ {56}} ) és Th2 (cMAF+ Gata3+ ) sejtek, Ly6C+/− monociták/makrofágok (Ly6C+/− Adgre1+ ), M1 makrofágok (CD80+ CD{{67} } INOS2+ ), M2 makrofágok (CD163+ Mrc1+ cMAF+ ), cDC1 (XCR1+ IRF8+ ), hagyományos 2-es típusú dendritikus sejtek (cDC2 , CD1+ IRF4+ ), migrációs CD103+ dendritikus sejtek (Itgae+ ), eozinofilek (SiglecF+ ), neutrofilek (Ly6G+) és NK-sejtek (Klrb1c+ Ncr1+ ) hordozóval vagy CBDIL-lel kezelt daganatokban-12. Vulkándiagramok, amelyek eltérő génexpressziót mutatnak (e) tumorsejtekben és (f) T-sejtekben CBD-IL-12-val kezelt egerek RM9 daganataiból a hordozóval kezeltekhez képest. FC hajtásváltozás, FDR hamis felfedezési arány. A forrásadatokat a Forrásadatok fájl tartalmazza.

Vita

A CAR T-sejt-terápia és más immun-alapú célzott terápiák hatékonysága nagymértékben függ attól, hogy az egyes pácienseken belül a tumorpopulációt alkotó összes vagy a legtöbb sejten konzisztens antigén-expresszió alakul ki. Az antigén heterogenitása azonban kifejezett szilárd daganatokban, beleértve a prosztatarákot is, ahol az mCRPC-vé való progresszió és a kezelésrezisztencia a különböző transzkripciós programokkal–71 és a sejtfelszíni antigénexpresszióval jellemezhető eltérő betegségaltípusok megjelenésével függ össze. Míg a PSMA-t a prosztatarák egyik legfontosabb biomarkerejének tekintik, ahol a betegség progressziójának teljes spektrumában jelentős túlzott expressziót találtak, munkánk megerősíti egy nemrégiben megjelent publikáció14 eredményeit, amelyek azt mutatják, hogy a PSMA expressziója heterogén a letális mCRPC-ben. Megmutatjuk, hogy a STEAP1 ebben a helyzetben szélesebb körben expresszálódik, mint a PSMA, de semmi esetre sem fejeződik ki egységesen magas szinten az összes mCRPC szövetben. Egyetlen antigén-célzott terápia, beleértve a CAR T-sejtes terápiát sem, nem képes legyőzni a már meglévő tumorantigén heterogenitást az mCRPC-ben. Ezért rendkívül fontos további terápiás célpontok, például a STEAP1 alapos hitelesítése az mCRPC-ben, amelyek lehetővé tehetik a leküzdhetetlen terápiás nyomást kifejtő kombinatorikus terápiákat. Ezek közé tartoznak a kettős antigén-célzott (pl. PSMA és STEAP1) CAR T-sejt-terápiák vagy a CAR T-sejt-terápiát ADC-kkel, T-BsAb-kkel kombináló multimodális stratégiák, vagy más olyan kezelések, amelyek hatékonyan elősegítik az antigén-független és -függő tumorpusztulást. Kifejlesztettünk egy STEAP{12}}célzott CAR T-sejt-terápiát, amely erősen antigén-specifikus, és funkcionálisan lokalizálta a CAR által felismert epitópot a STEAP1 második ECD-jére. STEAP1-BBζ CAR T-sejtjeink jelentős daganatellenes aktivitást mutatnak többszörösen elterjedt prosztatarák-modellekkel szemben mind az emberben, mind az egérben végzett vizsgálatokban. Fontos, hogy a STEAP1-BBζ CAR még alacsony antigénsűrűségű körülmények között is képes T-sejt-aktivációt és célsejt-citolízist indukálni, amit a PC3 prosztatarák-modell elleni reaktivitás is bizonyít. Azonban a STEAP1-BBζ CAR T-sejteknek ez a érzékenysége a STEAP1 expresszió alacsony szintjére előnyös lehet a daganatellenes hatékonyság fokozása szempontjából, de felerősítheti a daganaton kívüli célpont toxicitásból adódó felelősséget is. A STEAP1 szisztémás expressziójáról korábban arról számoltak be, hogy a normál emberi szövetekben gyakorlatilag hiányzik 18, 72, kivéve a prosztata mirigyet, ahol a prosztata epiteliális sejtekben membrános expressziót írtak le27. A STEAP{30}}BBζCAR T-sejtes terápia preklinikai környezetben történő biztonságosságának elmélyítése érdekében létrehoztunk egy humanizált STEAP1 egérmodellt. A hSTEAP1-KI egérmodell összefoglalta a humán STEAP1 expresszióját a prosztata mirigyben, és expressziót mutatott a mellékvesekéregben. Megnyugtató, hogy a STEAP1-BBζ CAR T-sejt-terápia olyan dózisban, amely elegendő a tumorellenes aktivitás kiváltására, nem vezetett nyilvánvaló szisztémás toxicitáshoz hSTEAP1-KI egerekben, beleértve a célponton kívüli daganatellenes toxicitást az emberi STEAP1 helyein. kifejezés. Vizsgálataink során a prosztatarák relapszusának és progressziójának visszatérő mechanizmusa a STEAP1-BBζ CAR T-sejt-terápia után a tumorantigén szökés volt. Ez a megállapítás egyrészt aláhúzza a STEAP{40}}BBζ CAR T-sejtterápia általános hatékonyságát. Nem világos azonban, hogy a tumor STEAP1 expressziójának elvesztése kizárólag a tumor antigén heterogenitása miatt van-e, vagy a STEAP1 expresszió adaptív downregulációja is van. Egy közelmúltban megjelent publikáció kimutatta, hogy a STEAP1 promoter-metilációja modulálja a STEAP1 expresszióját, és a DNS-metiltranszferáz és a hiszton-deacetiláz gátlása révén az epigenetikai dereguláció elegendő volt a STEAP1 expressziójának jelentős felszabályozásához73. Az epigenetikai inhibitorokkal és a STEAP1 CAR T-sejt terápiával kombinált kezelés egyidejűleg fokozhatja a tumor STEAP1 expresszióját és átprogramozhatja a CAR T sejteket kedvező kimerültség-rezisztens differenciálódási állapotokba74,75, ezáltal mérsékelve a tumor antigénveszteségét és fokozva a daganatellenes hatékonyságot prosztatarákban. Vizsgálatunk arra is utal, hogy a STEAP1 funkcionális szerepet játszik a sejtciklus progressziójának és a sejtmetabolizmus szabályozásában a prosztatarákban. A STEAP1 egyedülálló a STEAP család többi tagjától (STEAP2, 3 és 4), mivel hiányzik egy intracelluláris oxidoreduktáz domén22, amely szükséges a metallo reduktáz aktivitásához. Ennek eredményeként a STEAP1 homotrimerek, de nem a más STEAP fehérjékkel alkotott heterotrimerek, nem rendelkeznek a Fe3+-t Fe2+-vé és a Cu2+-t Cu1+-vé redukáló enzimatikus funkcióval. Azt, hogy a STEAP1 fémionokban és sejtanyagcserében való részvétele elősegíti-e, és hogyan, elősegíti-e a rák progresszióját, még nem határozták meg, és további vizsgálatra érdemes. A prosztatarák immunológiailag „hideg” daganatos mikrokörnyezete a rák immunterápiáinak hatékonyságának fő akadálya. Például a domináns-negatív transzformáló növekedési faktor receptor (TGF R-DN) mCRPC-ben történő expresszálására felvértezett PSMA CAR T-sejtterápia I. fázisú klinikai vizsgálatával kapcsolatos feltáró vizsgálatok azt mutatták, hogy az immunszuppresszív jelátviteli molekulák expressziója a tumor mikrokörnyezetében nő. CAR T infúzió után13. Vizsgálataink során kritikus eredmény volt a STEAP1 expresszió elvesztése és az antigén feldolgozás és prezentáció lelassulása közötti összefüggés mind a STEAP1 knockout sejtekben, mind a STEAP1 antigénvesztéses daganatokban a STEAP1-BBζ CAR T sejtterápia után. Így a STEAP1 antigénvesztés prosztatarákban nem csak a STEAP1-BBζ CAR T-sejt-terápiával szembeni közvetlen rezisztenciát segíti elő, hanem korlátozhatja a gazdaszervezet adaptív daganatellenes immunitását is. A tumor célantigén expressziójának elvesztését és immunszuppresszív állapotba való átalakulását a Treg-ek fokozott infiltrációjával és az immunszuppresszív molekulák magasabb expressziójával szintén megfigyelték egy EGFR-vIII CAR T-sejtek I. fázisú vizsgálata során visszatérő glioblasztómában szenvedő résztvevőknél76. További munkára lesz szükség a STEAP1 antigénvesztés hátterében álló funkcionális mechanizmusok megértéséhez, és általánosabban, hogy az adoptív CAR T-sejtes terápia dinamikus hatásai hogyan járulhatnak hozzá az antigénvesztéshez és az immunrendszer szerkesztéséhez a tumor-immun-stroma kölcsönhatások szolid tumorokban történő modulálásával.

7. ábra|A CBD-IL-12 és a STEAP1-mBBζ CAR T-sejt-terápia kombinálása javítja az általános túlélést és a gyulladásos citokinszinteket. az RM9-hSTEAP1 disszeminált modell tumoros provokációs kísérletének vázlata hSTEAP1-KI/+ egerekben, a CBD-IL-12 és a STEAP{{1{{18} }}}mBBζ CAR T-sejt terápia. Cy-ciklofoszfamid (előkondicionáláshoz). Létrehozva a BioRender.com segítségével. b RM9-hSTEAP1- fLuc áttétekkel beültetett hSTEAP1-KI/+ egerek sorozatos élő BLI-je, amelyeket egyetlen intravénás injekcióval kezeltek 5 × 106 egérből. T-sejtek vagy STEAP1-mBBζ CAR T-sejtek a 0. napon hetente CBD-IL- 12 kezeléssel vagy anélkül. A piros X az elhalt egereket jelöli. Megjelenik a sugárzási skála. (c) Grafika, amely a teljes fluxus időbeli meghatározását mutatja minden egyes egér élő BLI-jéből a (b) pontban. d A (b) pontban szereplő egerek Kaplan–Meier túlélési görbéi log-rank (Mantel-Cox) teszttel meghatározott statisztikai szignifikanciával (p=0,002). e Az IFN- (balra, p=0,002) és a TNF- (jobbra, p < 0,0001) szérum citokinszintjét bemutató diagramok a hSTEAP1-KI/+ egerek retroorbitális vérzéséből származó ProcartaPlex immunoassay alapján ( n=4 egér csoportonként), amelyek RM9-hSTEAP1-fLuc áttétet hordoztak a nem transzdukált egér T-sejtekkel vagy egér STEAP-pal végzett kezelés előtt (0. nap) és azt követően (8. nap){{38} }mBBζ CAR T-sejtek CBD-IL{40}} terápiával vagy anélkül. A hibasáv a SEM átlagát jelenti. Az (e) panelnél a p-értékeket kétutas ANOVA-ból származtattuk Sidak többszörös összehasonlítási tesztjével. A forrásadatokat a Forrásadatok fájl tartalmazza.

8. ábra|A CBD-IL-12 és a STEAP1-mBBζ CAR T-sejtes terápia kombinálása átprogramozza a daganatos immunrendszer mikrokörnyezetét, és elősegíti az antigénprezentációt és az epitóp terjedését. a STEAP1 (fent), B2m (középen) és CD3 (alul) IHC-festésről készült fotomikroszkópos felvételek RM9-hSTEAP1 tüdődaganatok egér nem transzdukált T-sejtekkel vagy STEAP{9}}mBBζ CAR T-sejtekkel végzett kezelés után, ill. CBD-IL{11}} kezelés nélkül. Skálasávok=50 µm. b Az áttétes tüdőtumorokba beszűrődő CD3-pozitív sejtek IHC mennyiségi meghatározását bemutató oszlopdiagram (csoportonként n=4 tumor). Egyirányú ANOVA p=0.{{80}}021. A hibasáv az átlagot jelenti SD-vel. A (c) Ly6C−F4/{{20}} MHC-II+ (bal oldali, egyirányú ANOVA p=0) gyakoriságát mutató diagramok.00{ {98}}5) és Ly6C − F4/80+ iNOS2+ (jobbra, egyirányú ANOVA p=0.0017) makrofágok, (d) Ly6C+ F4/ {{36} } MHC-II+ (bal oldali, egyirányú ANOVA p=0.0038) és Ly6C+ F4/80+ iNOS2+ (jobbra, egyirányú ANOVA p=ns) makrofágok, (e) CD11b+ XCR1+ cDC1 (egyutas ANOVA p=0.0003), (f) F4/80+ SiglecF+ eozinofilek (egyutas ANOVA p=0). 0008), és (g) Ly6G+ neutrofilek (egyutas ANOVA p=0.0035), amelyek az összes CD45+ sejtre normalizálódtak, multiparaméteres áramlási citometriával meghatározva nem transzdukált T-sejtekkel végzett kezelés után, STEAP{{67 }}mBBζ CAR T-sejtek, nem transzdukált T-sejtek és CBD-IL-12, valamint STEAP1- mBBζ CAR T-sejtek és CBD-IL-12 maximális kezelési válasz (nadir) és tumorrelapszus esetén (visszaesés). h oszlopdiagramok, amelyek a Simpson-klonalitást reprezentálják a TCR-repertoár „egyenletességének” mértékeként, TCRB szekvenálással elemzett egerekből gyűjtött, tumorba infiltráló sejteken az (a) pontban. n=4 daganat csoportonként. A nem transzdukált T-sejtek + CBD-IL-12 P-értékei a nem transzdukált T-sejtekhez és a STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekhez képest 0,008, illetve 0,02; és STEAP1-mBBζ CAR T-sejtek + CBD-IL-12 a nem transzdukált és STEAP1-mBBζ CAR T-sejtekhez képest 0,004, illetve 0,01. A hibasáv az átlagot jelenti SD-vel. Paneleknél (c–g) n=3 tumor csoportonként, *p < 0,05; **p < 0,01, ***p < 0,001, a panelek p-értékei (b–h) egyutas ANOVA-ból származnak, Dunn többszörös összehasonlító tesztjével. A forrásadatokat a Forrásadatok fájl tartalmazza.

A daganatellenes válasz szélesítése érdekében megvizsgáltuk a CBD-IL-12 szisztémás beadását STEAP1-BBζ CAR T-sejt-terápiával kombinálva egy disszeminált, szingén RM9-hSTEAP1 tumormodellben hSTEAP-ban. 1-KI egerek az mCRPC immunszuppresszív természetének közelítésére az RM9 gyengén immunogén modellként való előzetes jellemzése alapján57,77. A CBD-IL12-vel történő együttes kezelés az általános túlélés, a citokintermelés, a tumorantigén-prezentáció és az intratumorális T-sejt-diverzitás javulását eredményezte, összhangban az epitóp terjedésével. A tumorimmun mikrokörnyezet alapos vizsgálata feltárta, hogy a CBD-IL-12 hozzáadása a STEAP1-BBζ CAR T-sejt-terápiához a tumor stroma reverzióját indukálja, és fokozza az aktivált makrofágokat és cDC1-et, miközben csökkenti a tumorhoz kapcsolódó neutrofilek számát. A gyógyulást azonban vizsgálataink során nem sikerült elérni, és kiemeljük a rezisztencia és a tumor progressziójának lehetséges kompenzáló, adaptív mechanizmusait, beleértve az immunszuppresszív neutrofilek és a cDC2 megnövekedett gyakoriságát, amelyek elősegíthetik a Treg indukciót. Fontos megjegyezni, hogy a CBD-IL-12 adagjának és beadási ütemtervének további optimalizálására lehet szükség a daganatellenes válaszok maximalizálása érdekében. Ezek az eredmények azonban alátámasztják a kombinatorikus immunterápiás megközelítések vizsgálatát, mint például a CAR T-sejtek felvértezését a rekombináns citokinek78 (pl. IL-2, IL-12, IL-15 vagy IL{{24) kifejezésére. }}), egyidejű kezelés immunmodulátorokkal (pl. anti-PD-1/PD-L1 vagy anti-CTLA4), vagy tumor-irányított sugárterápia a prosztatarák tumor mikrokörnyezetének átalakítására és a CAR T-sejt effektor funkciójának fokozására. Amíg ez a kézirat előkészítés alatt állt, egy norvégiai csoport tanulmánya beszámolt egy daganatellenes hatású STEAP1 CAR T-sejt terápia preklinikai kifejlesztéséről, szubkután 22Rv1 modellben immunhiányos egerekben79. A bejelentett STEAP1 CAR eltér a STEAP1-BBζ CAR-tól, mivel tartalmaz egy Oslo1 nevű szintetikus scFv-t, valamint egy CD8 csukló- és transzmembrán domént. Egy másik megkülönböztető jellemző, hogy a STEAP1-BBζ CAR T-sejtek meghatározott termékként készülnek, normál CD4/CD8 T-sejtek arányával, míg az Oslo1 STEAP1 CAR T-sejtek nem. Nem számoltak be az Oslo1 STEAP1 CAR T-sejtes terápiával kapcsolatos rezisztencia mechanizmusairól és biztonsági vizsgálatokról. Mindazonáltal érdekes lesz látni, hogy ezek a különbségek a CAR tervezésében és a sejtkészítmények összetételében hogyan befolyásolhatják a daganatellenes hatékonyságot, perzisztenciát és biztonságot mind az Oslo1 STEAP1 CAR T-sejt-terápia, mind a STEAP1-BBζ CAR T-sejt-terápia esetében. programokat lefordítják a klinikára. Tanulmányaink eredményei alapján a National Cancer Institute (NCI) Experimental Therapeutics (NExT) Programjával partneri együttműködést alakítottunk ki annak érdekében, hogy a STEAP{50}}BBζ CAR T-sejtes terápiát egy első emberben végzett kísérletté alakítsák át mCRPC-vel rendelkező férfiakon. A korai fázisú klinikai vizsgálatból származó biztonsági és hatékonysági jelek segítenek meghatározni, hogy hasznos lehet-e ennek a terápiás megközelítésnek a vizsgálata más, a STEAP1-et erősen expresszáló ráktípusok esetében is.

Hivatkozások

1. Siegel, RL, Miller, KD, Fuchs, HE & Jemal, A. Cancer Statistics, 2022. CA: Cancer J. Clinicians 72, 7–33 (2022).

2. Armstrong, AJ et al. Az enzalutamid ötéves túlélési előrejelzése és biztonságossági eredményei kemoterápiával korábban nem kezelt, metasztatikus, kasztráció-rezisztens prosztatarákban szenvedő férfiaknál a PREVAIL-vizsgálatból. Eur. Urol. 78, 347–357 (2020).

3. Fizazi, K. et al. Abirateron plusz prednizon áttétes, kasztrációra érzékeny prosztatarákban. N. Engl. J. Med. 377, 352–360 (2017).

4. Scher, HI et al. Megnövekedett túlélés az enzalutamiddal prosztatarákban kemoterápia után. N. Engl. J. Med. 367, 1187–1197 (2012).

5. Parker, C. et al. Alfa-sugárzó rádium-223 és túlélés metasztatikus prosztatarákban. N. Engl. J. Med. 369, 213–223 (2013).

6. Sartor, O. et al. Lutécium-177–PSMA-617 áttétes, kasztráció-rezisztens prosztatarák kezelésére. N. Engl. J. Med. 385, 1091–1103 (2021).

7. Kantoff, PW et al. Sipuleucel-T immunterápia kasztráció-rezisztens prosztatarák kezelésére. N. Engl. J. Med. 363, 411–422 (2010).

8. Jackson, HJ, Rafiq, S. & Brentjens, RJ A CAR T-sejtek előrevezetése. Nat. Rev. Clin. Oncol. 13, 370–383 (2016).

9. Weiner, GJ Jobb monoklonális antitest alapú terápiák készítése. Nat. Rev. Cancer 15, 361–370 (2015).

10. Chavez, JC, Bachmeier, C. & Kharfan-Dabaja, MA CAR T-sejtes terápia B-sejtes limfómák esetén: a rendelkezésre álló termékek klinikai vizsgálati eredményei. Terápiás Adv. Hematol. 10, 2040620719841581 (2019).

11. Sterner, RC & Sterner, RM CAR-T sejtterápia: jelenlegi korlátok és lehetséges stratégiák. Vérrák, J. 11, 69 (2021).

12. Slovin, SF et al. 1. fázisú P-PSMA-101 CAR-T-sejtek vizsgálata metasztatikus kasztráció-rezisztens prosztatarákban (mCRPC) szenvedő betegeknél. J. Clin. Oncol. 40, 98–98 (2022).

13. Narayan, V. et al. PSMA-célzó TGF-érzéketlen páncélozott CAR T-sejtek metasztatikus kasztráció-rezisztens prosztatarákban: 1. fázisú vizsgálat. Nat. Med. 28, 724–734 (2022).

14. Paschalis, A. et al. Prosztata-specifikus membránantigén heterogenitás és DNS-javítási hibák prosztatarákban. Euro. Urol. 76, 469–478 (2019).

15. Chen, N., Li, X., Chintala, NK, Tano, ZE & Adusumilli, PS Driving CARs on the uneven road of antigen heterogeneity in solid tumors. Curr. Opin. Immunol. 51, 103–110 (2018).

16. Morgan, RA et al. Esettanulmány súlyos nemkívánatos eseményről ERBB2-t felismerő kiméra antigénreceptorral transzdukált T-sejtek beadását követően. Mol. Ott. J. Am. Soc. Gene Ther. 18, 843–851 (2010).

17. Lee, JK et al. A szisztémás felszíni profilalkotás azonosítja a célantigéneket az immunalapú terápia számára az előrehaladott prosztatarák altípusaiban. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115, E4473–e4482 (2018).

18. Hubert, RS et al. STEAP: egy prosztata-specifikus sejtfelszíni antigén, amely erősen expresszálódik humán prosztatatumorokban. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 14523–14528 (1999).

19. Nolan-Stevaux, O. Abstract DDT02-03: AMG 509: Új, humanizált, meghosszabbított felezési idejű, bispecifikus STEAP1 × CD3 T-sejteket toborzó XmAb® 2+1 antitest. Cancer Res. 80, DDT02-03-DDT02-03 (2020).

20. Grunewald, TG et al. A magas STEAP1 expresszió a jobb eredményekkel jár Ewing-szarkómában szenvedő betegeknél. Ann. Oncol. Ki. J. Eur. Soc. Med. Oncol. 23, 2185–2190 (2012).

21. Moreaux, J., Kassambara, A., Hose, D. & Klein, B. A STEAP1 overexpressed in cancers: a promising therapy target. Biochem. Biophys. Res. Commun. 429, 148–155 (2012).

22. Oosterheert, W. & Gros, P. A prosztata 1 humán hat transzmembrán epiteliális antigénjének (STEAP1) krio-elektronmikroszkópos szerkezete és potenciális enzimatikus funkciója. J. Biol. Chem. 295, 9502–9512 (2020).

23. Jiao, Z. et al. A prosztata 1 expressziójának hat transzmembrán epiteliális antigénje elősegíti a petefészekrák áttétet azáltal, hogy elősegíti az epiteliális-mezenchimális átmenet előrehaladását. Histochem. Cell Biol. 154, 215–230 (2020).

24. Gomes, IM, Arinto, P., Lopes, C., Santos, CR & Maia, CJ A STEAP1 túlzottan expresszálódik prosztatarákban és prosztata intraepiteliális neopláziás léziókban, és pozitívan kapcsolódik a Gleason-pontszámhoz. Urológiai onkológiában: szemináriumok és eredeti vizsgálatok. köt. 32, 53.e23–53.e29 (Elsevier, 2014).

25. Huo, S.-f. et al. A STEAP1 elősegíti a tüdő adenokarcinóma metasztázisát és epiteliális-mezenchimális átmenetét a JAK2/STAT3 jelátviteli útvonalon keresztül. Biosci. Rep. 40, BSR20193169 (2020).

26. Gomes, IM et al. A STEAP1 leütése gátolja a sejtnövekedést és apoptózist indukál az LNCaP prosztatarák sejtekben, ellensúlyozva az androgének hatását. Med. Oncol. 35, 1–10 (2018).

27. Gomes, IM, Maia, CJ és Santos, CR STEAP fehérjék: a szerkezettől a rákterápiás alkalmazásokig. Mol. Cancer Res. MCR 10, 573–587 (2012).

28. Danila, DC et al. A DSTP3086S, a prosztata 1 hat transzmembrán epiteliális antigénjét célzó antitest-gyógyszer konjugátum I. fázisú vizsgálata áttétes kasztráció-rezisztens prosztatarákban. J. Clin. Oncol. Ki. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 37, 3518–3527 (2019).

29. Kelly, WK et al. Az AMG 509, egy STEAP1 x CD3 T-sejt XmAb 2+1 immunterápiát toborzó I. fázisú vizsgálata metasztatikus kasztráció-rezisztens prosztatarákban (mCRPC) szenvedő betegeknél. J. Clin. Oncol. 38, TPS5589–TPS5589 (2020).

30. Lin, T.-Y., Park, JA, Long, A., Guo, H.-F. & Cheung, N.-KV Új, erős anti-STEAP1 bispecifikus antitest a T-sejtek átirányítására a rák immunterápiájában. J. Immunother. Cancer 9, e003114 (2021).

31. Schober, SJ et al. MHC I. osztályú korlátozott TCR-transzgénikus CD4(+) T-sejtek a STEAP1 ellen közvetítik az Ewing-szarkóma helyi tumorkontrollját in vivo. Cells 9, 1581 (2020).

32. Roudier, MP et al. A csontra áttétes végstádiumú prosztata karcinóma fenotípusos heterogenitása. Zümmögés. Pathol. 34, 646–653 (2003).

33. Gomes, IM, Santos, CR, Socorro, S. & Maia, CJ. A prosztata 1 hat transz membrán epiteliális antigénjét a prosztata sejtekben nemi hormonok csökkentik. Prostate 73, 605–613 (2013).

34. Sharp, A. et al. Az androgénreceptor splice variáns-7 expressziója kasztrációs rezisztenciával jelentkezik prosztatarákban. J. Clin. Invest. 129, 192–208 (2019).

35. Bakht, MK et al. A prosztatarák neuroendokrin differenciálódása a PSMA-szuppresszióhoz vezet. Endocr.-Relat. Cancer 26, 131–146 (2018).

36. Ihlaseh-Catalano, SM et al. A STEAP1 fehérje túlzott expressziója a prosztata karcinóma biokémiai kiújulásának független markere. Histopatology 63, 678–685 (2013).

37. Gomes, IM et al. A STEAP1 leütése gátolja a sejtnövekedést és apoptózist indukál az LNCaP prosztatarák sejtekben, ellensúlyozva az androgének hatását. Med. Oncol. 35, 40 (2018).

38. Logan, AC et al. A lentivírus vektorok titerét és fertőzőképességét befolyásoló tényezők. Zümmögés. Gene Ther. 15, 976–988 (2004).

39. Morgan, RA, Gray, D., Lomova, A. & Kohn, DB Hematopoietic stem cell génterápia: haladás és tanulságok. Cell Stem Cell 21, 574–590 (2017).

40. Larson, SM et al. Hematopoietikus őssejtek génmódosításának preklinikai fejlesztése kiméra antigénreceptorokkal rák immunterápiára. Zümmögés. Vaccin Immunother. 13, 1094–1104 (2017).

41. Salter, AI et al. A kiméra antigénreceptor jelátvitel foszfoproteomikai elemzése kinetikai és mennyiségi különbségeket tár fel, amelyek befolyásolják a sejt működését. Sci. Jel. 11, eaat6753 (2018).

42. Majzner, RG et al. A CAR T-sejt aktivitás antigénsűrűség-szükségletének hangolása. Cancer Discov. 10, 702–723 (2020).

43. Challita-Eid, PM et al. A prosztata hat transzmembrán epiteliális antigénje elleni monoklonális antitestek-1 gátolják az intercelluláris kommunikációt in vitro és a humán tumor xenograftok növekedését in vivo. Cancer Res. 67, 5798–5805 (2007).

44. Hudecek, M. et al. A kiméra antigénreceptorok nem jelátviteli extracelluláris spacer doménje meghatározó az in vivo tumorellenes aktivitás szempontjából. Cancer Immunol. Res. 3, 125–135 (2015).

45. Gomes, IM, Santos, CR & Maia, CJ A STEAP1 és STEAP1B expressziója prosztata sejtvonalakban, és a STEAP1 feltételezett szabályozása poszttranszkripciós és poszttranszlációs mechanizmusokkal. Genes Cancer 5, 142–151 (2014).

46. ​​Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A. & Elofsson, A. TOPCONS: konszenzusos előrejelzés a membránfehérje topológiájáról. Nucleic Acids Res. 37, W465–W468 (2009).

47. Krogh, A., Larsson, B., Von Heijne, G. & Sonnhammer, EL Transzmembrán fehérje topológia előrejelzése rejtett Markov-modellel: alkalmazás teljes genomokra. J. Mol. Biol. 305, 567–580 (2001).

48. Long, AH et al. 4-1A BB kostimuláció javítja a kiméra antigénreceptorok tónusos jelátvitele által kiváltott T-sejt-kimerülést. Nat. Med. 21, 581–590 (2015).

49. Berger, C. et al. A központi memóriasejtekből származó effektor CD8+ T-sejtek átadása tartós T-sejt-memóriát hoz létre főemlősökben. J. Clin. Investig. 118, 294–305 (2008).

50. Gattinoni, L. et al. Őssejt-szerű tulajdonságokkal rendelkező emberi memória T-sejt részhalmaza. Nat. Med. 17, 1290–1297 (2011).

51. Xu, Y. et al. A szorosan kapcsolódó T-memória őssejtek korrelálnak a CAR in vivo terjeszkedésével.CD19-A T-sejteket az IL-7 és az IL-15 megőrzi. Blood 123, 3750–3759 (2014).

52. Cieri, N. et al. Az IL-7 és az IL-15 naiv prekurzorokból emberi memória-őssejtek generálására ad utasítást. Blood 121, 573–584 (2013).

53. Hansel, DE et al. Megosztott TP53 génmutáció morfológiailag és fenotípusosan eltérő egyidejű elsődleges kissejtes neuroendokrin karcinómában és prosztata adenokarcinómában. Prostate 69, 603–609 (2009).

54. Cuzick, J. et al. A sejtciklus-proliferációs génekből származó RNS-expressziós aláírás prognosztikai értéke prosztatarákban szenvedő betegeknél: retrospektív vizsgálat. Lancet Oncol. 12, 245–255 (2011).

55. Chen, ME, Lin, SH, Chung, LW & Sikes, RA A PAGE-1 és a GAGE-7 izolálása és jellemzése. Az LNCaP prosztatarák progressziós modelljében kifejezett új gének, amelyek homológiát mutatnak a melanoma-asszociált antigénekkel. J. Biol. Chem. 273, 17618–17625 (1998).

56. Baley, PA, Yoshida, K., Qian, W., Sehgal, I. & Thompson, TC Progression to androgén insensitivity in a novel in vitro mouse model for prosztatarák. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 52, 403-413 (1995).

57. Murad, JP et al. Az előkondicionálás módosítja a TME-t, hogy fokozza a szolid tumor CAR T-sejtek hatékonyságát és az endogén védő immunitást. Mol. Ott. J. Am. Soc. Gene Ther. 29, 2335–2349 (2021).

58. Brunda, MJ et al. Az interleukin 12 daganatellenes és metasztatikus hatása rágcsáló daganatok ellen. J. Exp. Med. 178, 1223-1230 (1993).