Az LRRK2 kináz inhibitor megfiatalítja az oxidatív stressz által kiváltott sejtöregedést az idegsejtekben 1. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Háttér.A leucinban gazdag ismétlődő kináz 2 (LRRK2) kritikus szerepet játszik a Parkinson-kór (PD) patogenezisében. Az öregedés a PD progressziójának legkritikusabb kockázati tényezője. Megállapították az öregedés és a sejtek öregedése közötti összefüggést. A sejtek öregedése korrelál a proteolitikus útvonal szabályozási zavarával és a mitokondriális diszfunkcióval, amelyek szintén a -synuclein ( -syn) aggregációjával járnak. Humán dopaminerg neuronszerű sejteket (differenciált SH-SY5Y sejteket) rotenonnal kezeltünk LRRK2 kináz inhibitor GSK2578215A (GSK-KI) jelenlétében vagy hiányában 48 órán át. A celluláris öregedés markerei, beleértve a p53, p21Wafi/Cip1(p21), -galaktozidáz (-gal), Rb foszforiláció, öregedéssel összefüggő (SA) -gal aktivitást éslizoszomálistevékenységét, megvizsgálták. A szaggatott sejteket és a patkány primer agykérgi neuronjait -syn fibrillákkal kezeltük 30 perccel a rotenon kezelés előtt GSK-KI jelenlétében vagy hiányában 48 órán keresztül. Az egerek intraperitoneálisan rotenont és MLi-2-t (LRRK2 kináz inhibitor) kaptak kétnaponta, két héten keresztül. Eredmények. A rotenon a p53-p21 jelátviteli tengely aktiválása és az Rb foszforiláció leszabályozása révén fokozta az LRRK2 foszforilációt és a -gal szintet. Ezenkívül a rotenon növelte az SA-gal aktivitást, a reaktív oxigénfajták szintjét és az LRRK2-tfoszforilációés gátolta a lizoszómaaktivitást. A rotenon által kiváltott LRRK2 upreguláció csökkentette az a-syn fibrillumok kiürülését. Az LRRK2 inhibitorral végzett kezelés mérsékelte a rotenon által kiváltott sejtöregedést és -syn felhalmozódást. Következtetések. Az LRRK2 kináz aktivitásának rotenon által kiváltott felszabályozása elősegítette a sejtek öregedését, ami fokozta a -syn felhalmozódását. Az LRRK2 kináz inhibitor beadása azonban megfiatalította a rotenon által kiváltott sejtöregedést.

További információért kattintson ide

1. Bemutatkozás

A Parkinson-kórt (PD), amely a leggyakoribb neurodegeneratív betegség, a motoros kontroll károsodása jellemzi[1]. Számos genetikai és környezeti tényező járul hozzá a PD [2-5] patogeneziséhez. Az LRRK2, a PD fő genetikai kockázati tényezője, mind GTPáz, mind kináz aktivitást mutat [6]. Az LRRK2 G2019S mutáns, amely fokozott kinázaktivitást mutat, elősegíti a PD progresszióját [7]. A PD kialakulásának kockázata a G2019S mutánst hordozó betegeknél az életkor előrehaladtával növekszik [8], mivel az öregedés összefüggésbe hozható a neurodegeneratív betegségek progressziójával [9]. Korábban már beszámoltunk arról, hogy az LRRK2 kináz aktivitása elősegítette a sejtek öregedését és gátolta az alfa-synuclein (-syn) aggregátumok lebomlását [10]. - A Syn a Lewy-testek (LB) vagy a Lewy-neuritok fő alkotóeleme, amelyek a PD posztmortem markerei. A -syn károsodott lebomlása aggregációját eredményezi [11].

A sejtek öregedése károsítja a fehérjelebontó gépezetet[12-14]. Az alacsony dózisú rotenon expozíciója, amely a jelentések szerint PD-t indukál, elősegíti a sejtek öregedését a humán trabecularis meshwork sejtvonalban [15]. Ezenkívül a rotenon fokozza az LRRK2 kináz aktivitását a neuronokban [16]. Ezért azt feltételeztük, hogy a rotenon az LRRK2 kináz aktiválása révén elősegíti a sejt öregedését, és ennek következtében fokozza a -syn aggregációt.

A Cistanche javíthatja az immunitást

2. Módszerek és anyagok

2.1. Sejttenyésztés és kezelés.

A humán neuroblasztóma sejtvonalat (SH-SY5Y sejtek) tenyésztési tápközegben (Dulbecco módosított Eagle táptalajban (DMEM;10-013-CV; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) tenyésztettük, kiegészítve 1{{ 48}}% magzati szarvasmarha szérum (FBS, 35-010-CV, Corning cellgro), 1% penicillin/sztreptomicin (P/S, 10378-016, Gibco, Thermo Fisher Scientific) és 1% mikoplazma eltávolító reagens (KOMA)) 37 fokon 5 százalékos CO-tartalmú inkubátorban (Thermo Fisher Scientific). A differenciált SH-SY5Y sejteket (dSH-sejtek) 10 μM all-transz-retinsavval (R2625-100MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) végzett kezelés után kaptuk, amelyet kétévente egyszer tenyésztő tápközegben készítettünk. nap hét napig. A retinoidsavas kezelést követő 7. napon a sejteket rotenonnal (1 uM) és GSK2572815A-val (GSK-KI) kezeltük; LRRK2 kináz inhibitor; 1 μM) táptalajban 48 órán át előkészítve. A rotenon és a GSK-KI vivőanyagaként dimetil-szulfoxidot (DMSO) használtunk. A -syn fibrillumot a korábban leírtak szerint tisztítottuk [10]. A rotenonnal és GSK-KI-vel kezelt sejteket a-syn fibrillákkal (70 nM) kezeltük. A patkány elsődleges kérgi neuronjait rotenonnal (1 μM), GSK-KI-vel (1 μM) és a-syn fibrillel (70 nM) kezeltük 48 órán keresztül. A patkány primer agykérgi neuronjainak kezelési körülményei megegyeztek a dSH esetében alkalmazottakkal. A sejteket kétszer mostuk jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), és 1x mintapufferben lizáltuk (50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% nátrium-dodecil-szulfát, 10% glicerin, 1% -merkapto-etanol és 0,02 ml. százalékos brómfenolkék).

2.2. Primer corticalis neuronok izolálása és tenyésztése E16 patkányembriókból.

A terhes patkányokat CO-gázzal elaltattuk. A méhet kimetszettük, és az embrionális zsákokból származó magzatokat jéghideg HBSS-/-(14175-079, Gibco, Thermo Fisher Scientific) tartályba helyeztük. A koponyát csipesszel lehámozták, és a kéregeket az egész agyból kimetszették. Az agyhártyák eltávolítása után a kéregeket 0,25 százalékos tripszin-EDTA-val (25200-056, Gibco, Thermo Fisher Scientific) inkubáltuk 37 °C-on 20percig. vízfürdő. Ezután a kéregeket 40 ug/ml DNáz I-gyel (DN25, Sigma-Aldrich) inkubáltuk, óvatosan vortexeltük, és 5 percig 37 fokos vízfürdőben inkubáltuk. A felülúszó nagy részét leszívással eltávolítottuk, és a mintákat széruminhibitort tartalmazó MEM-mel (11090-08, Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1,5% DMEM-mel, 5% FBS-sel, 2,5 mg/ml szarvasmarha-szérumalbuminnal inkubáltuk. (BSA; A7906, Sigma-Aldrich) és 2,5 mg/ml tripszin inhibitor (T9253, Sigma-Aldrich). A szérum inhibitort eltávolítottuk, és a sejtpelletet térfogatának 10-szeresében újraszuszpendáltuk a tápközeggel. A táptalaj összetétele a következő volt: neurobazális táptalaj (21103-049, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific), 2% B-27(17504044, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific) és 1x GlutaMAX{ {34}}(35050-061, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific). Az izolált patkány primer agykérgi neuronsejteket (3 × 10 fok/lyuk) egy 12-lyukú lemezre oltottuk (SPL30012, SPL Life Sciences, Pochoen, Dél-Korea), és a tápközegben tenyésztettük 37 fokon 5 °C-on. százalékos CO, inkubátorban 24 órán keresztül. A táptalajt 0,2 mg/ml 5-fluor-2'-dezoxiuridinnel (F0503, Sigma-Aldrich) és 96 ug/ml uridinnel (U3750, Sigma-Aldrich) kiegészített táptalajra cseréltük. gátolja a mitózist. A 6. napon a sejteket 1 uM rotenonnal, 1 uM GSK-KI-vel és 70 nM -syn fibrillákkal kezeltük 48 órán át, majd lx mintapufferrel gyűjtöttük össze.

2.3. Western Blot.

A Western blottingot a korábban leírtak szerint végeztük [17]. A következő antitesteket használtuk a Western-blothoz: nyúl anti-LRRK2 foszfo-S935 monoklonális (ab133450, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), nyúl anti-LRRK2 foszfo-S1292 monoklonális (ab203181, Abcam), egér monoklonális anti-LR (Abcam) N241A/34, Neu-roMab, UC Davis, CA, USA), egér anti-p53 monoklonális (humán p53:sc-126; egér p53:sc-393031; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), egér anti-p21wafi/-Ccip1(p21) monoklonális (CM5131, ECM Biosciences, Ver-sailles, KY, USA), egér anti-Rb monoklonális (#9309S, Cell Signaling Technology (CST), Danvers, MA , USA), anti-foszfoRb (Ser807/811) (#9308S, CST), egér anti-- -galaktozidáz monoklonális (sc-377257, Santa Cruz Biotech-nology), egér anti-p62 monoklonális (ab56416) ,Abcam), egér anti- -aktin monoklonális (sc-47778; Santa Cruz Biotechnológia), nyúl anti-LC3B poliklonális (#2775S; CST), egér anti- -syn (klón) 42) monoklonális (610786; BD Bio-sciences, San Jose, CA, USA),anti-foszfotreonin-argi-nine(#2351S, CST), anti-p53(SC-99, Santa Cruz Biotechnology), anti-LaminB(SC-6216,Santa Cruz Biotech-nology), kecske-peroxidázzal konjugált AffiniPure anti-egér IgG(H plusz L)(#115-035-003;Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA) és kecskeperoxidázzal konjugáltAffiniPure anti-nyúl IgG(H plusz L)(#1l1-035-144; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.)antitestek. A nitrocellulóz membrán immunreaktív jeleit Luminata Crescendo Western HRP-vel (#WBLUR0500, Merck & Co. Inc., Kenilworth, NJ, USA), a képeket MicroChemi4.2 kamerával (Shimadzu, Kyoto, Japán) rögzítettük.

2.4. Proximity Ligation Assay (PLA) és immunfluoreszcencia (IF).

A PLA-t Duolink⑨ In Situ Detection Reagents Green (DUO{0}}RXN, Sigma-Aldrich), DuolinkeIn in Situ PLA4Probe Anti-Mouse MINUS antitesttel (DUO92002-100RXN, Sigma-Aldrich) végezték. és Anti-Rabbit Plus antitest (DUO92004-100RXN, Sigma-Aldrich), a gyártó utasításait követve. A 96-lyuk fekete lemezekre (655077, Greiner Bio-One, Krems-münster, Ausztria) beoltott SH-SY5Y sejteket differenciáltuk, és a differenciált sejteket rotenonnal és GSK-KI-vel kezeltük a 7. napon. kétszer öblítettük jéghideg Dulbecco PBS-sel (DPBS), 4 százalékos paraformaldehiddel fixáltuk 30 percig szobahőmérsékleten (RT), és háromszor öblítettük jéghideg DPBS-sel. Ezt követően a sejteket DPBS-ben készített 0,1%-os Triton X{23}} oldattal permeabilizáltuk. Háromszori mosás után hideg DPBS-sel a sejteket egy csepp blokkolóoldattal inkubáltuk 37 °C-on 1 órán át. A blokkolóoldatot eltávolítottuk, és a sejteket antitestekkel (50 µl) inkubáltuk 37 °C-on 3 órán át. Az antitest keverék egy antitest-hígítót tartalmazott a készletből (PLA-hoz használt antitestek: egér anti-LRRK2 monoklonális (1:20) antitest és nyúl anti-LRRK2 foszfo-S1292 monoklonális (1:20) antitest; antitest az IF vizsgálathoz használt: csirke anti- -gal poliklonális antitest (1:400, ab9361, Abcam)). Az IF-tesztben az antitestet a teljes folyamat során a PLA alkalmazási lépéséig hozzáadták. A mintákat ezután kétszer mostuk 1x A mosópufferrel 5 percig. A próbaoldat elkészítéséhez a Duolink⑧In Situ PLA Probe Anti-Mouse Minus és Anti-Rabbit Plus-t összekevertük az antitest hígítóval (1:5). Az IF vizsgálathoz az anti- -gal antitestet is hozzáadtuk (1:400) a keverékhez. A sejteket 50 μl próbaoldattal 37 °C-on 1 órán át inkubáltuk. Ezután a sejteket kétszer mostuk lx A mosópufferrel 5 percig. Az IF vizsgálathoz ligázt (40:1) és anti- -gal antitestet (400:1) kevertünk össze a ligációs pufferben. A sejteket a ligációs oldattal (50 µl) 37 fokon 30 percig inkubáltuk, és kétszer mostuk lx A mosópufferrel 5 percig. Az IF vizsgálathozpolimeráz(1:4{11}}) Kecske Anti-Chicken IgY H plusz L(Alexa Fluor② 594; ab150172) másodlagos antitesttel (1:500) inkubáltuk 100 percig 37 °C-on. A sejteket kétszer mostuk 1 x B mosópufferrel 10 percig, majd 0,01 x B mosópufferrel 1 percig mostuk. A sejtmag megfestéséhez a sejteket DPBS-ben előállított Hoechst 33342-vel (1:1000;62249, Thermo Fisher Scientific) szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. A 96-lyukfekete lemezek sejtjeinek képét konfokális lézeres pásztázó mikroszkóppal (LSM 700, Carl Zeiss Jena, Németország) rögzítettük.

2.5.Immunprecipitáció.

A rotenonnal (1 μM) és GSK-KI-vel (1 uM) kezelt dSH-sejtek teljes sejt lizátumait lízisoldattal (PBS, 1% Triton X-100, 1x proteáz inhibitor koktél és lx foszfatáz) készítettük elő. inhibitor koktél). A lizátumokat 4, 000g-vel és 4 fokos fokozaton 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszót anti-p53 antitesttel (554293, BD Biosciences) és PierceProtein G agarózsával (20398, Thermo Fisher Scientific) inkubáltuk. 12 órán át újraszuszpendáljuk a lízisoldatban. A gyöngyöket kétszer mostuk a lízisoldattal, és a gyöngy-fehérje komplexet lx mintapufferrel denaturáltuk.

2.6. Nukleáris frakcionálás.

A nukleáris frakciót NE-PERr Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (78833, Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával izoláltuk a gyártó utasításait követve.

2.7. mRNS előállítása és kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (qRT-PCR).

Az mRNS-t rotenon/GSK-KI-vel kezelt dSH sejtekből RNeasy Plus Mini kit (74134, QIAGEN, Hilden, Németország) segítségével izoláltuk. Ezután az mRNS-t komplementer DNS-vé (cDNS) fordítottuk át a TOPscript cDNS Synthesis Kit (EZ005S, Enzynomics, Daejeon, Koreai Köztársaság) segítségével. A cDNS-t qRT-PCR-nek vetettük alá TOPreal"qPCR 2x Pre-MIX (SYBR Green, alacsony) alkalmazásával. ROX, UDG plus) (RT500M, Enzynomics). A következő primereket használtuk a qRT-PCR-hez: humán p21,5'-ATG AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(előre)) és 5'-CCC TAG GCT GTG CTC ACT TC-3'(fordított); humán p16INK4(p16),5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3'(előre) és 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT -3'(fordított). A qRT-PCR-t a Mic qPCR cikluson (MIC-4, BioMolecular Systems, Upper Coomera, Ausztrália) végeztük.

2.8. Az öregedéssel összefüggő (SA) galaktozidáz (-Gal) aktivitás, a reaktív oxigénfajták (ROS) és a lizoszómaaktivitás mérése.

30 perccel a kezelés után az élő dSH sejteket 2 μM GlycoGREEN-Gal (GC611, Goryo Chemical Inc., Hokkaido, Japán), 5 uM 2',7'-diklórfluoreszcein-diacetát (DCFDA; 287810, Calbio-chem, CA, San Diego USA）, 2 μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) és 1 μM Hoechst 33342 az SA -gal aktivitás, a ROS, az aktív lizoszómák és a sejtmag vizsgálatára. ProLongDiamond Antifade Mountant (P36965, Invitrogen) és konfokális lézer pásztázó mikroszkóp segítségével készült. A differenciális interferencia kontraszt képeket konfokális lézeres pásztázó mikroszkóp segítségével készítettük 2.9.SA -Gal Activity Assay. Az SA -gal aktivitást egy { {21}}well cellular senescence assay kit (CBA-213, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA), követve a gyártó utasításait.

2.10. Egérkezelés és gyógyszeradminisztráció.

Az egereket a korábban leírtak szerint [18] a Dankook Animal Ethics Committee (Dankook IACUC,18-026) irányelvei szerint kezelték. C57BL/6] 16 hetes hím egereket intraperitoneálisan rotenonnal injektáltunk (0). 0,75 mg/ttkg) és MLi-2 (LRRK2 kináz inhibitor; 1 mg/ttkg) kétnaponta egyszer két héten keresztül.

2.11. Rotarod teszt és agyszövet előkészítés.

A kezelés utáni 14. napon az egereket egy forgatható henger alakú rúdra helyeztük. Feljegyezték a padlóra eséshez szükséges időt. A rotarod teszt részleteit máshol ismertetjük [18]. Ezután az egereket elaltattuk és transzkardiálisan perfundáltuk jéghideg, Ca2-t és Mg-t tartalmazó HBSS-sel. A középső agyat mikroollóval és csipesszel feldarabolták. A szöveteket 1% Triton X-100, 1xXpert Proteáz Inhibitor Cocktail Solution-t (P3100, GenDEPOT, Katy, TX, USA) és lx Xpert foszfatáz gátló koktéloldatot (P3200, GenDEPOT) tartalmazó PBS-ben lizáltuk. A mintákat Pellet Pestle Cordless Motor (Sigma-Aldrich) segítségével homogenizáltuk. A felülúszót Western-blot-vizsgálatnak, SA-gal-aktivitási vizsgálatnak és enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatnak (ELISA) vetettük alá.

2.12.ELISA az Oligomer -Syn.

Korábban létrehoztunk egy szendvics ELISA-t fibrilláris -syn oligomerek elemzésére, olyan antitest felhasználásával, amely felismeri a -syn aggregátumok fonalas konformációját [17]. A nyers középagy lizátumokat ELISA-nak vetettük alá, és a -syn aggregátumokat -syn fibrill standardok segítségével mennyiségileg meghatároztuk.

2.13. Kép- és adatelemzések.

A PLA és az élősejtes festődés intenzitását Zen 2012 (Carl Zeiss) segítségével mérték. A célfehérjék denzitometriáját a következővel végeztük

1. ÁBRA: A rotenon által kiváltott LRRK2 kináz aktiválása elősegíti a sejtek öregedését a differenciált humán neuroblasztóma sejtvonalban. 1 uM rotenonnal vagy 1 uM GSK2578215A(GSK-K) LRRK2 kináz inhibitorral 48 órán keresztül kezelt dSH sejtek Western blot analízise a célfehérjék (a) elleni antitestek felhasználásával. A fehérjék sűrűségét a -aktin (bg).n =3.(h) sűrűségére normalizáltuk. Az 1 uM rotenonnal vagy 1 uM GSK-KI-vel 48 órán keresztül kezelt dSH sejteket proximity ligation assay-nek (PLA) vetették alá. foszfo-S1292 LRRK2 és teljes IRRK2(PIA-pS1292) és -galaktozidáz immunfluoreszcens (TF) analízise. A sejtmagokat Hoechst 33342-vel festettük meg. A PLA és IF festéshez használt kontrollok feltárták az eredmények érvényességét (jobb oldali két panel). A PLA-pS1292(i) és -galaktozidáz (j) intenzitását a 4',6-diamidino-2-phenylindole.n= 4 intenzitására normalizáltuk; cellák száma= 12-17.

Multi Gauge (Fujilm, Tokió, Japán). Az összes adatkészletet Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) segítségével elemeztük és ábrázoltuk. A dSH-sejtekkel és patkány primer agykérgi neuronokkal végzett kísérletekből származó adatokat kétutas elemzéssel elemeztük. variancia (ANOVA), majd Bonferroni post hoc tesztje(n=3). Közben,the data obtained from mouse experiments, live-cell stain-ing,and PLA in the dSH cells were analyzed using two-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (n>3). Az összes adatot átlag ± standard átlaghibaként adjuk meg. *p<><><><0.0001,and n.s.="not">

2. ábra: Az LRRK kináz inhibitor gátolja a p53 aktiválását a differenciált humán neuroblasztóma sejtvonalban. (a) Az immunprecipitáció (IP) bemeneteként használt teljes sejt lizátumokat (20%) és a nukleáris frakciót összegyűjtöttük. Az elemzés kimutatta, hogy a bemenet 20 százaléka az 1. ábrán látottakhoz hasonló eredményeket mutatott. (b, c) Az IP-mintákat denaturáltuk és Western-blot-vizsgálatnak vetették alá. A p53 TXR hely foszforilációs szintjeit a teljes p53 szintre normalizálták. n=3.(de) A nuceus teljes p53 szintjét Western blot segítségével vizsgáltuk. A LaminB-t a nukleáris p53 szintek normalizálására használtuk. n=3.(f) A kezelt csoportban a p21 és pl6 mRNS szintjeit a vivőanyaggal (dimetil-szulfoxiddal) kezelt csoportéhoz normalizáltuk, n =3.

Ez a cikk a Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021-ből származik, cikkazonosító: 9969842, 16 oldal: https://doi.org/10.1155/2021/9969842