Az anyai autogén inaktivált vírus elleni védőoltás fokozza a malacok PRRSV elleni immunitását 1. rész

Absztrakt:

Az anyától származó immunitás kritikus összetevője a sertések utódai túlélésének és sikerének, hogy megvédje magát a keringő kórokozóktól, például a 2-es típusú sertés szaporodási és légzőszervi szindróma vírusától (PRRSV-2).

Ennek a tanulmánynak az a célja, hogy megvizsgálja a PRRSV-ellenes immunitás átvitelét olyan malacok malacaira, amelyek csak módosított élő vírust (MLV) kaptak (kezelés (TRT) 0), vagy két autogén inaktivált egyikével kombinálva. vakcinák (AIV-k, TRT 1 plusz 2). Az ezekből a kocasüldőkből származó malacokat kéthetes korukban fertőzték meg az autogén PRRSV{5}} törzzsel, és adaptív immunválaszukat (IR) az oltás utáni 4 hétig (dpi) értékelték.

A szisztémás humorális és celluláris IR-t a fialás előtti kocasüldőkben, malacokban, beoltás előtt, valamint 2 és 4 wpi-nél elemeztük. Mindkét AIV részben megvédte a malacokat csökkent tüdőpatológiával és fokozott súlygyarapodással; A TRT 1 csökkentette a malacok virémiáját is, amit legjobban az AIV által kiváltott semlegesítő antitestek termelődésével és a malacokba való átvitelével magyarázhatunk. Malacoknál az inokuláció előtt a fő szisztémás IFN termelők a CD21 plusz B sejtek voltak. 0-ról 4 wpi-re ezeknek a B-sejteknek a szerepe csökkent, és a CD4 T-sejtek váltak az elsődleges szisztémás IFN-termelőkké.

A jó élő vírusok olyan vírusok, amelyek nem okoznak betegséget, és bizonyos kapcsolatban állnak az emberi szervezet immunitásával. Az élő vírusok stimulálhatják az emberi immunrendszert immunválasz kiváltására, ezáltal erősítve az emberi immunitást. Tanulmányok kimutatták, hogy miután az emberi szervezetet élő vírussal megfertőzték, bizonyos közvetítők és citokinek szabadulnak fel, amelyek aktiválhatják az immunsejteket, elősegíthetik az immunrendszer működését, és fokozhatják a szervezet vírusokkal szembeni ellenálló képességét.

Emellett a jóindulatú és életképes vírusok is kompetitív módon elfoglalhatják a sejteket, megnehezítve a kórokozók behatolását és szaporodását, ezáltal megvédik az emberi szervezetet más fertőzésektől. Ezért a megfelelő jóindulatú és élő vírusfertőzés javíthatja az emberi immunitást, de a túlzott fertőzés betegségekhez vezethet. Ezért a mindennapi életben az embereknek figyelmet kell fordítaniuk az élő vírusok fertőzésének visszaszorítására és az immunitás javítására az egészséges életmód révén. Ebből a szempontból javítanunk kell az immunitást. A Cistanche jelentősen javíthatja az immunitást. A húshamu különféle biológiailag aktív összetevőket tartalmaz, például poliszacharidokat, két gombát és Huanglit, stb. Ezek az összetevők serkenthetik az immunrendszer különböző funkcióit. sejtszerű sejtek, növelve immunaktivitásukat.

Kattintson a Cistanche egészségügyi előnyei

A tüdőben a CD8 T-sejtek voltak az elsődleges és a CD4 T-sejtek a másodlagos IFN-termelők, beleértve a sertés CD8-CCR7-CD4 T-sejtek egy új alcsoportját, potenciálisan terminálisan differenciált CD4 TEMRA-sejteket. Összefoglalva, ez a tanulmány azt bizonyítja, hogy az anyai AIV-oltás javíthatja az elválasztás előtti malacok PRRSV elleni védelmét-2; bemutatja a semlegesítő antitestek malacokba való átvitelének fontosságát, és két új immunsejt-alcsoportot vezet be sertésekben: IFN-termelő CD21 plusz B-sejteket és CD8-CCR7-CD4 T-sejteket.

Kulcsszavak:

anyai oltás; autogén inaktivált vakcina; immunitás átadása; humorális immunválasz; sejt által közvetített immunválasz; T-sejtek; PRRSV; sertés; IFN-termelő B-sejtek; CD4 TEMRA sejtek.

1. Bemutatkozás

Az emlősök anyai eredetű immunitása (MDI) egy félelmetes szimfónia ("harmonikus komplexitás" [1]). Ebben a rendszerben vagy szimfóniában az anya immunvédelmet (ideiglenes és/vagy tartós) ad át utódainak a terhesség alatt a méhlepényen keresztül, a születés után az emlőváladékon keresztül, vagy mindkettőn keresztül [2]: az emberek a terhesség alatt és végül az emlőn keresztül immunglobulinokat kapnak. váladék [3]; a kutyák és rágcsálók a vemhesség alatt és az emlőváladékon keresztül kapnak immunglobulinokat, a sertések és egyéb haszonállatok pedig csak az emlőváladékon keresztül kapnak immunglobulinokat.

Más fajokhoz hasonlóan a malacok ezt az MDI-t immunglobulinok, immunsejtek és más immunrendszerrel rokon molekulák formájában kapják [4,5]. Míg az immunglobulinok különböző kocáktól kaphatók (= keresztfostering), addig csak a biológiai anyák képesek sikeresen immunsejteket átvinni utódaikba [5], és a kolosztrumbevitel mennyisége a malacoknál jelentősen csökkenti a mortalitást és javítja a teljesítményt [6] ]. Ezek az immunsejtek közé tartoznak a B-sejtek [7], valamint a különböző T-sejt-alcsoportok – CD4, CD8 és főleg T-sejt receptor (TCR) – δ T-sejtek [8].

Ezeket a T-sejt-alcsoportokat ezután tovább lehet megkülönböztetni a differenciálódási stádiumuk és az elhelyezési mintájuk alapján. Sertésekben a CD8 láncot használják a CD8 - naiv és a CD8 plusz antigénnel megtapasztalt vagy memória CD4 T-sejtek megkülönböztetésére [9–11]. A kemokin receptor (CCR) 7 expressziója tovább különbözteti meg a CCR7 plusz nyirokcsomó-homingot a CCR7- perifériás szövet-homing T-sejtektől [12]. A kombinált CD8 / CCR7 elemzéssel több különböző T-sejt alcsoportot különböztethetünk meg: CD8 -CCR7 plusz naiv CD4 T-sejtek, CD8 plusz CCR7 plusz központi memória (TCM) CD4 T-sejtek és CD8 plusz CCR7-effektor memória (TEM). ) CD4 T-sejtek; perifériás szövet-homing CCR7− és nyirokcsomó-homing CCR7 plusz CD8 T sejtek, és CD8 −CCR7−, CD8 plus CCR7− és CD8 plus CCR7 plus TCR- δ T sejtek.
Míg korábban már beszámoltunk arról, hogy a sertés TCR-δ T-sejtjei inverz homing-mintázatot mutatnak TCR-társaikhoz képest, ezeknek a különböző részhalmazoknak a sajátos szerepét még nem ismertettük [13]. Mind az immunsejt-alcsoportok, mind az antitestek átkerülnek az utódokba, hogy megvédjék őket a különféle kórokozókkal szemben [4,5].

Évtizedek óta a sertések legpusztítóbb kórokozója a sertés szaporodási és légzőszervi szindróma vírusa (PRRSV, [14,15]). A PRRSV-nek két fő típusa létezik – az 1-es és a 2-es típus (PRRSV-1 és 2); nagy sokféleségük és immunszuppresszív képességük miatt a PRRSV problémás betegséggé válik, ami óriási gazdasági veszteségekhez vezet a sertésipar számára [16], és mindeddig, bár a vakcinák részleges védelmet nyújtanak a PRRSV ellen, nem tudták teljes mértékben kontrollálni ezt a betegséget.

Két fő vakcinatípus áll rendelkezésre a PRRSV-módosított élő vírus (MLV) elleni védelemre, valamint az inaktivált vakcinák, elsősorban az autogén inaktivált vakcinák (AIV-k); azonban mindkét típus szembesül a maga kihívásaival.

A nagyon immunogén MLV-vakcinák kifejlesztéséhez szükséges hosszú idő azt jelenti, hogy általában heterológabbak a farmokon elterjedt PRRSV-törzsekkel szemben, és bár az AIV-k ezen farmokon elterjedt törzsek ellen irányulnak, inaktivált természetük miatt általában kevésbé immunogének.

Ezek a kihívások a védelem hiányához vezetnek, különösen a fiatal sertéseknél, ami három tényezőnek tulajdonítható: először is, a PRRSV magas mutációs rátája korlátozza a heterológ védelmet, így csökkenti az MLV vakcina hatékonyságát; másodszor, immunszuppresszív képessége korlátozza a gyengébb vakcinák (pl. AIV-k) beadását, és a védő immunválasz kiváltásának késleltetése a fiatal sertéseket különösen érzékenysé teszi [17]; és harmadszor, korlátozott ismereteink vannak a PRRSV-re adott immunválaszról, különösen a malacoknál. Loving és Lunney szép áttekintést készített a PRRSV elleni immunválasz általános megértéséről [18,19].

Főleg a PRRSV elleni vakcina által kiváltott immunitás kialakításának meghosszabbítási ideje alapján a sertéstenyésztők gyakran vakcinázzák a kocasüldőket és a kocákat, hogy lehetővé tegyék az immunitás malacokra való átadását. A PRRSV-1 típusú kereskedelmi MLV-vel végzett anyai oltással kapcsolatos kutatások nem akadályozták a 2 vagy 3-hetes malacok vakcinázását, és részben megvédték a malacokat a heterológ fertőzéssel szemben [20]. Ez a vakcinázási stratégia PRRSV-1-specifikus IgG, IgA és interferon (IFN) szekretáló sejteket is indukált a beoltott kocák kolosztrumában és tejében. Ezek az IFN-termelő sejtek rendkívül fontosak az antivirális válaszokban, beleértve a PRRSV-t is [19,21].
Ez a vakcinázás szérum anti-PRRSV IgG-t is indukált, amely hathetes kor után kimutatható volt a nem vakcinázott malacoknál, és stabil maradt a vakcinázott malacokban a fertőzés előtt; ennek ellenére az IFN-t szekretáló sejteket nem lehetett megkülönböztetni a háttérszinttől az elválasztott malacokban [22]. Míg az MLV-k használata iparági szabvány, az MLV-prime és AIV-roost vakcinázás kombinált oltási rendje ígéretesnek tűnik az MLV-k és AIV-k egymástól függetlenül történő alkalmazásának minden hátrányának leküzdésére.

Ezért ennek a tanulmánynak a fő célja az volt, hogy ne csak annak meghatározása volt-e, hanem azt is, hogy a két különböző AIV-vel (kezelés (TRT) 1+2) végzett anyai oltás fokozhatja-e önmagában az iparági szabványnak megfelelő MLV-oltást (TRT 0). ), hogy jobban megvédje az utódokat a korai PRRSV2 fertőzéstől. Ebből a célból tanulmányoztuk a vakcina által kiváltott humorális és sejtközvetített immunválaszt (CMI) ezekben a kocasüldőkben, és mindkét csoportban 2 hetes korukban kihívtuk a kocasüldők korai elválasztott egyedeit. Ezen malacok szisztémás és lokális immunválaszát 2-4 hétig követtük.

Kimutattuk, hogy az AIV emlékeztető oltás javíthatja a malacok PRRSV-fertőzés elleni védelmét 2 hetes korukban, valamint azonosítjuk a mögöttes immunmechanizmusokat és jellemezzük az anti-PRRSV humorális és CMI-választ ezekben a fiatal sertésekben. Ezenkívül két új sejttípust észleltünk sertésekben: (1) CD8 -CCR7 - CD4 T-sejteket, amelyek erősen hozzájárulnak az IFN-termeléshez bronchoalveolaris lavage (BAL) - potenciális CD4 TEMRA sejtekben, és (2) az anti-PRRSV válasz, különösen malacokban – IFN-termelő B-sejtek.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Tanulmánytervezés, állatok és mintafeldolgozás

Ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy értékelje a különböző anyai PRRSV2 vakcinázási sorozatok hatását az elválasztott malacok PRRSV elleni védő immunitására-2. A vizsgálat előtt egy észak-karolinai sertéshúsipari vállalattól származó, keringő PRRSV-2 törzset (restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP), 1-7-4) izolált és szaporított két független biológiai tudományos vállalat; két különálló autogén vakcinát állítottak elő. Mindkét vakcina különböző szabadalmaztatott komponenseket tartalmazott, de ugyanazt az inaktivált 1-7-4 PRRSV-2 törzset. A tanulmány felépítését az 1. ábra szemlélteti.

Mindkét oltást intramuszkulárisan, négy adagból álló sorozatban adták be az ellés előtt: az észak-karolinai sertéshúsipari vállalat vállalati vakcinázási ütemtervének megfelelően egy kereskedelmi kocafarmban 46 PRRSV-2 negatív kocasüldőt oltottak be Ingelvac PRRS MLV vakcinával (Boehringer Ingelheim Veemedict). GmbH, Németország) kilenc héttel a tenyésztés előtt. A konzisztens terminológia megőrzése érdekében ebben a vizsgálatban a besorolt ​​ivarérett nőstény sertéseket (itt kocasüldőkként definiálva) kocasüldőknek nevezzük még tenyésztésük és ellésük után is (kocákként emlegetve). Négy héttel a tenyésztés előtt az összes kocasüldőtől vérmintát vettek szérum céljából, majd a kocasüldőket három kezelésre osztották: TRT 0 (csak MLV-oltás); TRT 1 (MLV vakcináció plusz 4 adag autogén (1-7-4) inaktivált vakcina 1); vagy TRT 2 (MLV vakcináció plusz 4 adag autogén (1-7-4) inaktivált vakcina 2).

Gilts that did not breed were dropped from the study. 3 weeks before farrowing, blood was collected from pregnant gilts for the isolation of serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). At this point, five gilts remained in both TRT 0 and TRT 2; nine gilts remained in TRT 1. Within these gilts, we selected three gilts per group to provide the piglets for the challenge study. The selected gilts had an adequate litter size (>7) és a legmagasabb szérum fluoreszcens fókusz neutralizáció (FFN) titer (elsődleges immunkritérium) és a legmagasabb CD4 T-sejtes IFN-válasz (másodlagos immunkritérium) az AIV provokáló törzzsel szemben a csoportjukon belül. A TRT 1 plusz 2 esetében ezek az FFN-titerek 1:4 és 1:128 között változtak. Mivel a TRT {{10}} nem rendelkezett az AIV törzzsel szembeni titerekkel, a legmagasabb anti-MLV titerrel rendelkező kocasüldőket választottuk; ezek a titerek 1:16 és 1:32 között mozogtak. Az IFN-válasz az összes kiválasztott kocasüldőben az összes CD4 T-sejt 0,09–0,21 százaléka között mozgott.

Mindegyik kocasüldő négy malacot biztosított a provokációs vizsgálathoz. 2 hetes korukban (= 0 héttel a fertőzés után, wpi) a négy legnagyobb átlagos alomtömegű malacot kiválasztottuk a kihívást jelentő vizsgálathoz, és az Észak-Karolinai Állami Egyetem 2. szintű biológiai biztonsági telephelyére szállították ( NCSU) Laboratory Animal Resources (LAR) (Raleigh, Észak-Karolina). Itt véletlenszerűen beosztották őket a hat toll egyikébe ugyanabban a helyiségben; kezelésenként két sertést helyeztek el mindegyik karámban (egyet kocaként). Összefoglalva, összesen 36 malac vett részt a vizsgálatban, kezelési csoportonként 12 malac.

During the study, four piglets died before the end of the study: three piglets from one gilt (TRT 0) died within 30 h of arrival at LAR and were dropped from the study. Additionally, one pig (TRT 2) was euthanized between weeks three and four of the study due to high fever (>106◦ F) és a fizikai stimulációra adott válasz hiánya. Ezt a sertést a 3. hétig minden analízisbe bevonták, és tüdejét patológiás állapot szempontjából megvizsgálták. Ennél az állatnál nem végeztek áramlási citometriás (FCM) elemzést a boncoláskor.

Egy nappal az elválasztás és az NCSU-ba érkezés után minden malacot intranazálisan beoltottak 1 × 105,5 PRRSV-2 vírusrészecskékkel (autogén törzs 1-7-4) 1 ml 1x foszfáttal pufferelt sóoldatban (PBS, Corning, Corning, NY, USA) (500 µl/orrlyuk), hanyatt fekve tartották 30 másodpercig, és visszakerültek a karámba. Az állatok felét 2 dpi-vel, a többi állatokat 4 dpi-vel leöltük. A boncolás során a BAL-t, a tüdőt és a tracheobronchiális nyirokcsomókat (TrBr LN-eket) összegyűjtöttük és a korábban leírtak szerint feldolgoztuk [13].

A mintavétel az oltás előtt (0 wpi), majd hetente történt, amint az 1. ábrán látható. A szérumot Serum Separator Tubes (SST) csövekben gyűjtöttük (Becton Dickinson (BD) Biosciences, San Jose, CA, USA), és A PBMC izolálásához vért heparin csövekbe gyűjtöttünk (BD Biosciences). Az állatok elhelyezését a National Institutes of Health Guide kutatási állatok számára biztosította. A malacok korlátlanul fértek hozzá a vízhez, átmeneti elválasztási táplálékkal, majd napi kétszer rendszeres táplálékkal etették őket, és 83 ◦F-on tartották őket 12-órás világos/sötét ciklussal. A kísérleti eljárásokat az NC State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ID# 17-166A (2017. november 29.) hagyta jóvá.

2.2. Vírusszaporítás, titrálás és értékelés

A PRRSV-2 vírusizolátumot (törzs, 1-7-4) PRRSV-negatív sertés alveoláris makrofágokon (PAM) szaporították RPMI-ben-1640, 1× L-glutaminnal (Corning, Corning, NY). 10%-os magzati szarvasmarha szérummal (FBS) (VWR, Radnor, PA, USA) és 1X antibiotikum-antimikotikummal (Corning) (a továbbiakban: RPMI-komplett) kiegészítve körülbelül 30 órán keresztül T-75-lombikban (Sarstedt, Nümbrecht, Németország), amíg citopátiás hatást nem észleltek. A lombikokat egyszer lefagyasztottuk-olvasztottuk, és a felülúszót 2200 g-n 4 °C-on 10 percig centrifugáltuk. A vírus koncentrálásához a felülúszót 36 ml-es Nalgene centrifugacsövekbe (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) vittük át, és Sorvall 100S Ultracentrifugában (Sorvall, Thermo Fisher Scientific), Newtown, CT, USA) 73 °C-on centrifugáltuk. ,000 g 4 ◦C-on 2 órán keresztül.

A felülúszót elöntöttük, és a pelletet újraszuszpendáltuk tápközegben (RPMI teljes), és 100 µl-es alikvot részekben tároltuk -80 °C-on. A vírustörzs oldatok szövettenyészet fertőző dózisú 50 (TCID50) titereit PAM-ok segítségével határoztuk meg a korábban leírtak szerint (Spearman–Karber TCID50 módszer az OIE diagnosztikai tesztek kézikönyve szerint [World Organisation for Animal Health, korábban Nemzetközi Járványügyi Hivatal (OIE). ), „2.8.7. fejezet Sertés szaporodási és légzőszervi szindróma”, Terr. Man., 2015. május, 2015.

2.3. Virémia

Az izolált szérumot az észak-karolinai sertéshúsvállalat diagnosztikai laboratóriuma elemezte Reverse-Transcription kvantitatív polimeráz láncreakció (RT qPCR) segítségével, 5X MagMAX kórokozó RNS/DNS kittel (Thermo Fisher Scientific) és VetMAX PRRSV qPCR kittel (Thermo Fisher Scientific). Az Iowa Állami Egyetem Állatorvosi Diagnosztikai Laboratóriuma (ISU VDL, Ames, IA, USA) vizsgálata szerint a vakcinázott kocasüldő szérum PRRSV-negatív (qPCR) volt elléskor. A ∆Ct értékeket úgy számítottuk ki, hogy egy minta Ct értékét kivontuk a PRRSV-negatívnak tekintett Ct értékből (Ctneg=37) PRRSV esetén: ∆Ct=37 − Ctx.

2.4. Semlegesítő antitestek validálása és a pozitív minták meghatározása

A kocasüldőkből és malacokból származó szérummintákat a Dél-Dakota Állami Egyetem Állatkutató és Diagnosztikai Laboratóriumába (Brookings, SD) szállították, ahol elvégezték a PRRSV{0}} neutralizáló antitest (NA) meghatározását FFN és a 1-7-4 beoltott törzs felhasználásával. Pozitív eredmény a legmagasabb szérumhígítás a fluoreszcens fókuszképző egységek számának legalább 90%-os csökkenésével [23].

2.5. Boncolási eljárások, pontozás és szöveti sejtek izolálása

Boncoláskor (2 vagy 4 wpi) az állatokat halálos intravénás Euthasol injekcióval (Covetrus, MW, 390 mg/ml pentobarbitál, 50 mg fenitoin/ml) leöltük. Ezután a tüdőt, a csecsemőmirigyet és a TrBr LN-eket begyűjtötték.

A tüdőről dorsalis és ventrális fotók készültek; A tüdőt 1× PBS-sel átöblítettük a bronchiális alveoláris öblítés (BAL) összegyűjtésére, és összesen öt mintát vettünk szövettani vizsgálat céljából: egy-egy mintát a jobb és a bal faroklebenyből, a jobb és a bal középső lebenyből, majd egyet a járulékos lebenyből. A szövettani mintákat Formaldehid/Zn fixálóban (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) fixáltuk 24 órán át, 70 százalékos etanolba vittük át, és hematoxilinnel és eozinnal (H&E) festettük. A megfestett tárgylemezeket (szövettan) és a tüdőfotókat (bruttó patológia) az ISU VDL-hez szállították, és egy állatorvosi diagnosztikai patológus értékelte, aki nem volt képes a kezelésekre és a boncolás időpontjaira; A tüdőlézió és az intersticiális tüdőgyulladás pontozását a korábban leírtak szerint végeztük [24].

A tüdőfotók dorsalis és ventrális képét a tüdőgyulladásban érintett tüdő százalékos arányára értékelték. Pontosabban, a tüdőgyulladás százalékos arányát vizuálisan becsülték meg minden tüdőlebeny esetében, és a teljes tüdő teljes százalékát az egyes lebenyeknek a teljes tüdőtérfogathoz viszonyított súlyozott aránya alapján számítottuk ki. A négy cranioventralis lebeny mindegyike 10 százalékát, a járulékos lebeny 5 százalékát, és a két faroklebeny mindegyike a teljes tüdő 27,5 százalékát tette ki.

A tüdőszövettani metszeteket vakon megvizsgálták mikroszkopikus léziók szempontjából, és minden lebenynek becsült pontszámot adtunk az intersticiális tüdőgyulladás súlyossága alapján, az alábbiak szerint: 0=nincs mikroszkopikus lézió; 1=minimális intersticiális tüdőgyulladás; 2=enyhe intersticiális tüdőgyulladás; 3=közepesen súlyos intersticiális tüdőgyulladás; 4=bőséges intersticiális tüdőgyulladás; 5=súlyos, multifokális intersticiális tüdőgyulladás; 6=súlyos, diffúz intersticiális tüdőgyulladás. Az összes összegyűjtött szövet (tüdő, csecsemőmirigy és TrBr LN-k) esetében a szövetet apró darabokra vágtuk, és rozsdamentes acél kerek lefolyószűrőn (Grainger, Lake Forest, IL, USA) 50 ml-es csövekbe préseltük jéghideg PBS-sel eluálva. egysejtű szuszpenziók. A rostos csomókat 40 µm-es szűrőkkel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) szűrtük.

2.6. Perifériás vér izolálása, vírusstimuláció és IFN-FCM festés/analízis

A PBMC izolálást Ficoll-Paque sűrűségű centrifugálással (GE Healthcare, Uppsala, Svédország) és SepMate-50 ml-es csövekkel (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Kanada) végeztük a gyártó protokollja szerint. A PBMC és az egysejt-szuszpenziós sejtszámlálásokat CASY sejtszámláló rendszerrel (Schärfe System, jelenleg: Roche Innovatis AG, Bielefeld, Németország) végeztük. Az IFN-termelési vizsgálathoz 5 × 105 tüdőből származó PBMC-t és limfocitát, valamint TrBr LN-t szélesztettünk nyolc ismétlésben egy 96-lyuk, kerek fenekű lemezre (Corning) 100 µl RPMI-kompletten, és egy éjszakán át pihentetjük inkubátorban 37 ◦ C-on és 5 százalékos CO2-on. Másnap reggel 100 µl RPMI-komplett, PRRSV 1-7-4 törzset tartalmazó RPMI-t (Multiplicity of Infection, MOI=0.1) adtunk minden egyes mérőhelyhez; A lemezeket visszahelyeztük az inkubátorba 24 órás vírusstimulációra.

A tenyésztés utolsó 4 órájában monenzint (5 µg/ml, Alfa Aesar, Haverhill, MA, USA) adtunk hozzá, hogy blokkoljuk az IFN sejtekből történő felszabadulását. A 24 órás inkubáció befejeztével a replikátumokat egyesítettük és megfestettük az 1. táblázat szerint; átlagosan 276 756 egyetlen élő limfocitát (SLL) rögzítettünk Cytoflexen a CytExpert szoftverrel (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Az adatok elemzése a FlowJo 10.6.1-es verziójával (FLOWJO LLC) történt. Az IFN-válasz elemzésének kapuzási hierarchiája a 4. és 5. ábrán látható a PBMC esetében, valamint a kiegészítő S1 és 7. ábrán a BAL, a tüdőszövet és a TrBr LN-ek esetében.

2.7. Statisztikai analízis

A statisztikai elemzéseket Graphpad Prism 8 (Graphpad Software, San Diego, CA, USA) segítségével végeztük. A teljes adatkészlettel rendelkező adatokat kétutas (a vizsgálat során), vagy egyutas (boncolási) ANOVA-val elemeztük. A hiányzó adatpontokkal rendelkező adatokat (főleg a sertések 50 százalékának 2 dpi-vel végzett boncolása miatt) vegyes hatású modellel (Restricted maximum likelihood, REML) elemeztük. Minden többszörös összehasonlítást Dunnett többszörös összehasonlító tesztjével végeztünk. Az adatok szemléltetése hegedűdiagramokkal történt, amelyek az eloszlást, az egyes pontokat, a mediánt (adott esetben szaggatott fekete vonal) és a 25./75. intervallumokat (alkalmazható, színes vonal) mutatták. A koca- és malac nAb-szintek közötti korrelációs elemzéseket Pearson-korrelációs együtthatók és kétirányú 95 százalékos konfidencia intervallum alkalmazásával végeztük.

3. Eredmények

3.1. Vizsgálat tervezése és vakcina hatékonysága – klinikai tünetek, virémia, súlygyarapodás és tüdőpatológia

A vizsgálatot az 1. ábrán látható módon végezték. A PRRSV-oltáskor a sertéseknél enyhe PRRSV-tünetek jelentkeztek a fertőzést követő 3-4 napon belül – láz [főleg 1 wpi-nél, dns], levertség, csökkent táplálékfogyasztás, enyhe köhögés/tüsszentés. Ezeknél a tüneteknél nem figyeltek meg szignifikáns különbséget, és különböző mértékben fennmaradtak a boncolásig. A 2. ábra a virémiát, a heti testtömeg-növekedést, valamint a bruttó és kórszövettani pontszámokat mutatja.

Amint a 2A. ábrán látható, az összes sertés PRRSV-2 negatív volt az elválasztáskor, és a PRRSV-2 intranazális oltása virémiát indukált, amely 2 wpi-nél tetőzött. Míg a virémiában nem volt különbség a TRT 0 és a TRT 2 között, a TRT 1 szignifikánsan alacsonyabb volt a virémiában az első két hétben, mint a kontrollcsoportban a TRT 0. A sertések súlygyarapodása minden csoportban nagyon hasonló volt az első három hétben; mégis, a vizsgálat végén – és a TRT-hez képest 0 – a TRT 2 és TRT 1 szignifikánsan nagyobb heti súlygyarapodást mutatott – 2B ábra. A legfigyelemreméltóbb, hogy míg a tüdőpatológia általában megoldódik PRRSV-fertőzésben, és ezért hasonló volt a csoportok között 4 dpi-nél (dns), mindkét anyai AIV-oltás, tehát a TRT 1 plusz 2, szignifikánsan csökkentette a tüdőpatológiát 2 wpi-nél: mindkettő csökkentette a százalékos szintet. makroszkópos elváltozások és/vagy intersticiális tüdőgyulladás (2C, D ábra). A makroszkopikus tüdőelváltozások prevalenciája a TRT-ből származó tüdőben 0 20-70 százalék között volt; ezzel szemben a legtöbb TRT 1 plusz 2 sertésnél 20 százalék alatti volt a tüdőlézió prevalenciája – 2C. ábra. Hasonlóképpen, míg az intersticiális tüdőgyulladás medián kórszövettani pontszáma a TRT 0 sertések tüdejében három volt, a TRT 1 esetében 1,8, a TRT 2 esetében pedig 1,2 volt. A TRT 0-hoz képest ez szignifikancia (p=0,07) tendenciát és szignifikáns csökkenést mutat a tüdő kórképében az AIV-vel vakcinázott kocasüldőkből származó sertéseknél – 2D. ábra. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az AIV oltás jelentősen csökkentheti a virémiát és a tüdőpatológiát, emellett azt is kimutatják, hogy az anyai AIV elleni oltás PRRSV-2 ellen fokozhatja a 2-hetes malacok immunitását.

3.2. Az anyai semlegesítő antitestek indukciója és átvitelük a malacokra

A humorális immunválasz kiváltását kocasüldőkben és utódaikban NA FFN titerek meghatározásával elemeztük (3. ábra).

Az összes csoport MLV-vel történő vakcinázása NA-titereket indukált 4 és 64 év közötti kocasüldőkben, anélkül, hogy szignifikáns különbségek voltak a három csoport között (dns). Ezzel szemben, míg az MLV-oltás önmagában (TRT 0) nem tartalmazott NA-kat a heterológ 1-7-4 törzs ellen, mindkét AIV emlékeztető oltás akár 1:16-ig (TRT 2 esetén), sőt 1-ig is indukálta az NA-titereket. :128 (TRT 1 esetén) – 3A ábra.

Ezeket a szérum-NA-kat anyai úton átvitték a malacokba (3B. ábra): Míg a TRT 0 malacok nem mutattak NA-titert 0 wpi-nél, addig a TRT 1 és TRT 2 malacok rendelkeztek szérum NA-kkal a 1-7-4 törzshez képest. fertőzés, amely közvetlenül korrelált az anyai NA szintjével (3C. ábra, r=0.886, p < 0.0001). Ezek az NA-titerek az első két hét során csökkentek, mielőtt 4 wpi-vel stabilizálódtak. Mégis a TRT 0-hoz képest az AIV-vel vakcinázott malacok (TRT 1 plusz 2) már a fertőzés előtt szignifikánsan magasabb szérum NA-titerekkel rendelkeztek, és ezek a megnövekedett titerek 2-3 wpi-ig, tehát 4-5 hetes korukig tartottak. 3B.

For more information:1950477648nn@gmail.com