Contact:jerry.he@wecistanche.com

L.P. Arantes1, M.L. Machado1, D.C. Zamberlan1, T.L. da Silveira1, T.C. da Silva1, I.B.M. da Cruz1 , E.E. Ribeiro2, M. Aschner3 és F.A.A. Soares1

1Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil 2Universidade Aberta da Terceira Idade, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM, Brasil

3A molekuláris farmakológia részlege, Albert Einstein Orvostudományi Főiskola, Bronx, NY, USA

A Cistanche öregedésgátló hatású

Elvont

A guaranát (Paullinia cupana) az Amazonas-vidéken élő emberek rendszeresen fogyasztják, és a világszerte fogyasztott különféle energiaitalok kulcsfontosságú összetevője. A hosszú élettartam meghosszabbítása és a krónikus életkorral összefüggő betegségek alacsony prevalenciája összefüggésbe hozható a guarana szokásos bevitelével.Az öregedésgátlóa guarana potenciálját a Caenorhabditis elegans-ban is kimutatták; a hatásaiban szerepet játszó mechanizmusok azonban nem egyértelműek. Itt megvizsgáltuk azokat a feltételezett útvonalakat, amelyek a guarana etanolos kivonat (GEE) élettartamra gyakorolt hatását szabályozzák a C. elegans segítségével. A főbb ismert hosszú élettartamú útvonalakat mutáns férgekkel és RT-qPCR vizsgálattal (DAF-2, DAF-16, SKN-1, SIR-2.1, HSF-1) elemeztük. A purinerg jelátvitel lehetséges részvételét is vizsgálták. Ez a tanulmány kimutatta, hogy a GEE a következőkön keresztül hat:Antioxidánsaktivitás, DAF-16, HSF-1 és SKN-1 útvonalak, valamint humán adenozin receptor ortológ (ADOR-1) az élettartam meghosszabbítása érdekében. A GEE a 9 napos C. eleganokban az skn-1, daf-16, sir-2.1 és hsp-16.2 lejjebb is szabályozta az skn-1, daf-16, sir-2.1 és hsp-16,2 értékeket, amelyek azt tükrözik, hogy a közvetlenAntioxidánsingóságok. Eredményeink hozzájárulnak a guarana hatásának in vivo megértéséhez, ami hasznos lehet az öregedéssel összefüggő rendellenességek megelőzésében vagy kezelésében, és azt is sugallja, hogy a purinerg jelátvitel a hosszú élettartamú vizsgálatok hihető terápiás célpontja.

Kulcsszavak: Öregedés; antioxidáns; Guarana; élettartam; Természetes termékek; Xantinok

Bevezetés

A Paullinia cupana, más néven guarana, az Amazonas-medence őshonos növénye, és különösen gyakori Brazíliában. Magjainak porát az Amazonas-régió minden korosztálya rendszeresen lenyeli, elsősorban tonizáló és stimuláns tulajdonságai miatt (1). Ezenkívül a guarana kulcsfontosságú összetevője a sok országban fogyasztott különböző energiaitaloknak (2). A guarana egyéb jelentett farmakológiai hatásai közé tartozik a fogyás, a vérlemezke trombox-ane szintézisének csökkentése, a gyomorelváltozások elleni védelem, az antiox- idáns aktivitás és a gyulladáscsökkentő hatások [áttekintés céljából lásd: (1)]. Azonban ha feleslegben fogyasztják, a guarana káros hatással lehet az emberi egészségre is, szorongást, alvászavart és tachycardiát okozva, például magas koffeintartalma miatt (2,3).

A brazíliai Amazonas régióban, Mauésben élő emberek hosszú élettartamának meghosszabbítása az amazóniai étrendhez kapcsolódik, beleértve a guarana szokásos bevitelét is (4). Ezenkívül egy epidemiológiai vizsgálat a guarana lenyelését a krónikus életkorral összefüggő betegségek alacsony prevalenciájával társította az amazóniai lakosság körében (5). A közelmúltban egy tanulmány azt is kimutatta, hogy aöregedésgátlóa guarana magkivonat potenciálja Caenorhabditis elegansban (6). Az öregedésre gyakorolt guarana hatások mögött meghúzódó mechanizmusokat azonban nem azonosították.

A C. elegans alkalmas modell volt a különböző szintetikus és természetes vegyületekre adott alulálló organizmusválaszokra, valamint azoknak az öregedésre és az élettartamra gyakorolt hatására. A létfontosságú biológiai útvonalak és az öregedés számos aspektusa analóg a fonálférgekben és az emlősökben, beleértve az embereket is (7).

Mivel az idősek aránya világszerte növekszik, és az életkorral összefüggő betegségek megnövekedett gyakoriságával jár együtt, elengedhetetlen a hatékony terápiák és terápiás célpontok azonosítása, amelyek javíthatják az életminőséget (8). Itt megvizsgáltuk azokat a feltételezett útvonalakat, amelyek a C. elegans segítségével szabályozzák a guarana élettartamát.

Anyag és módszerek

Vegyszerek

Az agart, az etanolt (96%), a kloroformot, a koleszterint, a FUDR-t (5-fluoro-20-dezoxiuridin), a proteáz inhibitort, a foszfatáz inhibitor koktélokat, a polimeráz láncreakció (PCR) primereket és a szarvasmarha szérumalbumint (BSA) a Sigma-tól (USA) vásárolták. A qRT-PCR elemzéshez és a Trizolhoz használt TaqMans alapozókat az Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific Corporation -től (USA) vásárolták. Az összes többi reagenst a Synth-től (Brazília) vásárolták.

Törzsek és karbantartás

A vizsgálatban használt törzsek a Bristol N2 (vad típusú) voltak; CB1370, daf-2 (e1370) III; CF1038, daf-16 (mu86) I; EU1, skn-1(zu67); PS3551, hsf-1(sy441) I; TK22, mev-1(kn1); és a VC199, sir-2.1 (ok434), amelyet a Caenor- habditis Genetics Center (CGC), Minnesotai Egyetem, USA, valamint az Escherichia coli OP50-től szereztek be. Az EG6890 törzset, az ador-1-et (ox489) szívesen szállították Dr. Erik Jorgensen laboratóriumából (University of Utah, USA). Ennek a törzsnek az ador-1 gén első három exonjától 1 kb-ról deléciója van, és 6-szor volt túlszárnyalva; az ador-1 gén az emberi adenozin receptor ortogsorát kódolja (9).

A fonálférgeket 20°C-on tartották karban és vizsgálták fonálféreg-táptalajon (NGM) agarlemezeken, amelyek E. coli OP50 pázsitot hordoztak (10). A fonálféreg tenyészetek szinkronizálását a gravid hermafroditák fehérítésével érték el, és a tojásokat hagyták egyik napról a másikra kikelni M9 pufferben (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl és 1 mM MgSO4) (10).

Növényi anyag és kivonat előkészítése

A Paullinia cupana Kunth var. sorbilis (Mart.), a guarana pirított magjának porát az EMBRAPA Oriental (Agropecuary Research Brazilian Enterprise) izolálta és szállította, amely Az Amazonas nyugati részén, Mauésben, Amazo- nasban, Brazíliában található. A hidroalkoholikus kivonatot a máshol leírtak szerint kaptuk (11). Röviden, a kivonatot 70% etanol felhasználásával állítottuk elő. 24 óra elteltével a kapott oldatot leszűrtük, az etanolt eltávolítottuk, és a kivonatot liofilizáltuk. A guarana kivonatban bemutatott domináns xantinokat és katechineket HPLC-vel elemeztük, a következő koncentrációkat mutatva: koffein = 12,240 mg / g, teobromin = 6,733 mg / g és összes katechin = 4,336 mg / g (11).

A férgek kezelése

Az E. coli OP50 gyepet (táplálékforrásként) tartalmazó NGM lemezeket korábban 37 °C-on inkubálták egyik napról a másikra. A liofilizált guarana etanolos kivonatot (GEE) hidegen desztillált autoklávozott vízben (121 °C, 30 perc) oldottuk fel, és 100, 500 és 1 000 mg/ml agar végső koncentrációban eloszlattuk a lemezeken. A szinkronizált L1 lárvákat (10) pipettával vitték át a kezelőlemezek felületére, és 20°C-on felnőttkorra tenyésztették.

Élettartama

Az élettartam-analízisek az E. coli OP50-nel beolt ngm-lemezeken lévő L4 lárváknál kezdődtek GEE hiányában vagy jelenlétében (0. nap). Az állatokat minden második nap friss tányérokra helyezték át GEE-vel vagy anélkül, hogy elkerüljék a generációk összezavarását, és a halálig ugyanabban az időben pontozták őket. A mechanikus ingerre adott válasz hiányát halálként pontozták. A férgeket cenzúrázták, ha lekúsztak a lemezről, extrudált belső szerveket mutattak ki, vagy a méh belsejében lévő keltető utódok miatt haltak meg. Az élettartam-vizsgálatokat háromszor megismételték, vizsgálatonként 60–120 férggel. Mutáns törzseken keresztül elemeztük a fő ismert hosszú élettartamú útvonalat (12,13): i) daf-2 és daf-16, az inzulin/ inzulinszerű növekedési faktor (IGF)-1 jelátvitel (IIS), amelyet a DAF-2 receptor egy konzervált PI3-kináz / AKT útvonalon keresztül jelez, és lefelé szabályozza a DAF-16 /FOXO-t, és felelősségteljesen elősegíti a gének expresszióját, amelyek hosszabb élettartamot és fokozott stresszállóságot biztosítanak; ii. skn-1, amely a gerinces Nrf család fehérjéihez kapcsolódik, és elősegíti a méregtelenítő enzimek expresszióját az oxidatív stresszre, például a glutation-S-transzferázra adott válaszként; iii) sir-2.1, amely egy hiszton-deacetiláz-szerű fehérjét kódol, amely integrálja az anyagcsere-állapotot az élettartammal, és kalóriakorlátozáshoz kapcsolódik; és iv. hsf-1, amely kódolja a hő-sokk transzkripciós faktor-1-et (HSF-1), és különböző hősokk-gének vagy chaperonok aktivációját indukálja, amelyek részt vesznek a pro- teinek konformációs homeosztázisának fenntartásában más fontos funkciók mellett. A hosszú élettartam és a purinerg jelátvitel közötti lehetséges összefüggést az ador-1 mutáns törzsön keresztül is megvizsgálták.

Mivel a baktériumok szerepet játszanak a C. elegans mortalitásában, az E.coli OP50 növekedését a GEE jelenlétében vagy hiányában értékelték annak vizsgálatára, hogy a jótékony hatások választ adhatnak-e egy antimikrobiális tulajdonságra. A baktériumok abszorbanciáját 12 órás periódusban mértük folyékony közegben (14).

Egészségügyi span

A rendszer kiértékelte az egészségügyi tartományhoz kapcsolódó viselkedési paramétereket (15). A garatszivattyúzást Nikon E200 mikroszkóppal értékeltük úgy, hogy megfigyeltük a garat összehúzódások számát 60 másodperces intervallumban vad típusú fiatal felnőtteknél.

A Thrash frekvenciát választottuk ki a locomo- tion elemzésére. A kontrollból vagy a GEE kezelésekből származó vad típusú fiatal felnőtteket egyenként szedték ki és helyezték el egy csepp M9-esbe. A férgeket 1 percig hagyták alkalmazkodni, majd a thrashok számát Nikon E200 mikroszkóppal számszerűsítettük egy 20 másodperces intervallum alatt. A thrash-t úgy határozták meg, mint a test közepén a hajlítás irányának változását.

Az elemzéseket három független vizsgálatban végezték el. Csoportonként harminc fonálférgét vizsgáltak.

RNS-izolálás és valós idejű polimeráz láncreakció (RT-qPCR)

A 9 napos felnőtt férgek vad típusú férgeit elemezték a hosszú élettartammal és az oxidatív stresszválaszokkal kapcsolatos génexpresszió szempontjából. Felnőttkor után a férgeket minden második nap 150 mM FUDR-t (5-fluoro-20-dezoxiuridin) tartalmazó lemezekre vitték át, hogy gátolják a szaporodást, GEE jelenlétében vagy hiányában. Állapotonként 20 000 férgből származó RNS-t Trizollal izoláltunk, majd kloroform extrakcióval, amint azt korábban leírtuk (16), és 1 mg bemeneti RNS-t fordított átírtunk cDNS-re az Applied Biosystems nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlete (Applied Biosystems, USA). Expressziós analízist végeztünk a Custom TaqMans Array analízissel, a megfelelő TaqMans génexpressziós vizsgálatokkal a mitokondriális szuperoxid-diszmutáz sod-3 (Ce02404515_g1), glutation-S-transzferáz gst-4 (Ce02 458730_g1), gamma glutamil-cisztein szintetáz gcs-1 (Ce02436726_g1), daf-16 (Ce02422835_g1), sir-2.1 (Ce02 459018_g1), hsf-1 (Ce02423758_m1), hsp-16.2 (Ce02506738_s1) hősokkfehérje és skn-1 (Ce02407445_g1) (Applied Biosystems) esetében. A célgén expressziót normalizáltuk az afd-1 aktin expressziós értékeire (Ce02414 573_m1). Az egyes gének relatív expresszióját a 2 DDCt módszerrel (17) határoztuk meg, és az adatokat az mRNS-szinteknek az afd-1-hez viszonyított változásaként jelentették. Ezt a kísérletet három független féregkészítményben végeztük, mindegyik háromszoros.

Statisztikai elemzés

A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism 5-ös verziójával végeztük Windows rendszerhez (GraphPad Software, USA). Az eredményeket legalább három egyedi kísérlet ±SD-jének eszközeként jelentik. A diákok t-tesztjét a csoportpárok összehasonlítására használták, míg egy vagy kétirányú ANOVA-t, majd Bonferroni poszt hoc tesztjét három vagy több csoport összehasonlítására használták. Az összes túlélési görbét a log-rank (Mantel-Cox) teszt elemezte. A statisztikai szignifikanciát Po0,05-ként határoztuk meg.

Eredmények

Vizsgálatunkban a kontroll vad típusú C. elegans átlagos élettartama 11 nap, maximális élettartama pedig 14 nap. A GEE-t tartalmazó közegekben a vad típusú férgek átlagos élettartamát 13 napra hosszabbították meg 100 mg/ml-nél (18%), 15 napra pedig 500 és 1 000 mg/ml-nél (36%). A maximális élettartamot átlagosan 28%-kal hosszabbították meg a három vizsgált koncentrációnál (1. táblázat). Az E. coli növekedésében nem volt különbség 1,000 mg/ml GEE jelenlétében vagy hiányában (az adatok nem láthatók).

A férgek egészségügyi időtartama is meghosszabbodott a GEE-kezelés után. A kivonat késleltette a garatszivattyúzás (100, 500 és 1,000 mg /ml) és a thrashes (1,000 mg /ml) életkorral összefüggő csökkenését a felnőttkor 9. napjától kezdve (1 A és B ábra). Ennek megfelelően további elemzés céljából 1 000 mg/ml GEE-t és 9 napos felnőtt férgek mintáit választottuk ki.

A GEE kivonat (1,000 mg/ml) 44%-kal meghosszabbította a mev-1 mutánsok átlagos élettartamát és 77,8%-kal a maximális élettartamot (1. táblázat), ami a következők közötti kapcsolatot mutatja:Antioxidáns

Az élettartam-vizsgálatokat 20°C-on végeztük. A maximális élettartamot a féregpopuláció leghosszabb ideig élő 10% -ának átlagos élettartamaként ábrázolják. Minden kísérletet háromszor megismételtünk, csoportonként legalább 60 fonálférggel kezdve. Az adatokat átlag±SD. *Po0,05 a kezeletlen csoporthoz képest átlagosként jelentik (Mantel-Cox log-rank test).

1. ábra. A guarana etanolos kivonat (GEE) hatása az egészséghez kapcsolódó viselkedési paraméterekre. Garatszivattyúzási sebesség (A) és

thrash frekvencia (B) az öregedés során vad típusú férgeknél. Az adatokat átlagos ±SD-ként kell jelenteni (n = 30 féreg csoportonként). *P o0.05 a kontrollhoz képest (egyirányú ANOVA, majd Bonferroni többszörös összehasonlító teszt.

ésöregedésgátlóTevékenységek. A kivonat meghosszabbította a daf-2 és a sir 2.1 mutánsok átlagos élettartamát is, megállapítva, hogy a kivonat nem hatott ezeken az útvonalakon az élettartam meghosszabbítása érdekében. Ezzel szemben a kezelés nem hosszabbította meg a daf-16, skn-1, hsf-1 és ador-1 mutánsok élettartamát (1. táblázat).

A PCR-elemzések a GEE génmodulációját értékelték (2. táblázat). GEE 1,000 mg / ml-nél szabályozott skn-1, daf-16, sir-2.1 és hsp-16.2 9 napos felnőtteknél. Nem figyeltek meg hatást a hsf-1, gst-4, gcs-1 és sod-3 expresszióra.

Megbeszélés

Amint azt korábban bemutattuk (1), tanulmányunkban a guarana kivonat meghosszabbította a vadon élő C. eleganok élettartamát és egészségügyi időtartamát is. Így a feltételezett utak, amelyek részt vehetnek aöregedésgátlóhatásokat vizsgáltak. Ittöregedésgátlóhatásokat mutattak ki a kivonat magasabb koncentrációjánál (1.000 vs. 300 mg/ml, ahogy azt korábban démonrétegzettük). Ez az eltérés az extraktum-készítmény (hidro-alkohol és vizes kivonat) különbségeinek tudható be.

2. táblázat. Hajtsa meg a hosszú élettartammal és az oxidatív stresszel kapcsolatos gének mRNS-expresszióját a guarana etanolos kivonattal (GEE) kezelt vad típusú 9 napos felnőtt férgeknél.

Ezt a kísérletet rt-qPCR értékelte, és három független féregkészítményben végezték, mindegyiket három példányban. Az adatokat az mRNS-szinteknek az afd-1 (aktin) ±SD-hez viszonyított hajtásváltozásának eszközeként jelentik. *Po0.05 a kezeletlenhez képest (kétirányú ANOVA, majd Bonferroni többszörös összehasonlító tesztje).

és szállítási módszer (agar vs folyékony közeg), és a férgek populációjában a genetikai variáció természetes elsodródásának eredménye lehet (18,19).

Úgy tűnik, hogy az oxidatív stressz az élettartamot korlátozó fő tényező mind a C. elegans, mind az emberek esetében, és számos életkorral összefüggő betegséghez kapcsolódik (20,21), ami a figyelmet aAntioxidánsin vivo hatású vegyületek. Annak további vizsgálata, hogy a GEE meghosszabbíthatja-e az élettartamot aAntioxidánsaktivitást, a mev-1 férgekre gyakorolt hatását értékelték. Ezt a törzset szuperoxid túltermelés jellemzi, és rövidebb élettartammal rendelkezik, mint a vad típusú törzs (22). Konzisztens a korábban leírtakkalAntioxidánsa guarana kivonat (6) hatásai, a GEE kezelés jelentősen meghosszabbította a mev-1 férgek átlagos és maximális élettartamát.

Emellett az inzulin/IGF jelátvitelben (IIS) részt vevő DAF-16, HSF-1 és SKN-1 útvonalak elengedhetetlennek tűntek a GEE által közvetített élettartam-hosszabbításhoz. A csökkent IIS a C. elegans, a Drosophila, az emlősök és esetleg az emberek hosszú élettartamával és a kedvezőtlen környezeti feltételekhez való alkalmazkodással jár (13). A HSF-1 a DAF-16-tal együttműködve aktiválja a közös célgének expresszióját, beleértve az sHsp családot (kis hősokkoló fehérjék génjei) (23). Az SKN-1/Nrf integrálja az IIS-t, és szabályozza az oxidatív stresszre adott választ és a méregtelenítő gének expresszióját (24).

A DAF-16, a HSF-1 és az SKN-1 szintén közvetítheti az egészségügyi hossz-kiterjesztést és a fehérje homeosztázist (25). A DAF-16 részt vesz a kevésbé mérgező, nagy molekulatömegű fehérje aggregátumok képződésében (26), és bár a HSF-1 szabályozza a kis toxikus aggregátumokat felszabadító fehérjebontási aktivitást, jótékony hatása lehet, hozzájárulva a fehérjék eltávolításához az enzimatikus anyagcsere révén (27,28). Az SKN-1 leginkább szabályozóként ismertAntioxidánsés a xenobiotikus védekezés, de további funkciókban is részt vett, amelyek magukban foglalják a proteosztázist és az anyagcsere szabályozást (24).

A metil-xantinok mint koffein a guarana fő összetevői, és jól ismert, hogy ezek a vegyületek emlősök adenozin receptorain keresztül hathatnak (29). A koffeint jótékony hatásokkal társították, beleértve az öregedéssel kapcsolatos hatásokat (30,31) és a kognitív károsodás fenotípusainak javulását az A1 és A2A adenozin receptorok rágcsálókban történő antagonizálásával (32). Így teszteltük, hogy az élettartam GEE által kiváltott meghosszabbítása függhet-e az ADOR-1-től, egy adenozin receptor homológtól is (33). Eredményeink azt mutatták, hogy az ador-1(ox489) férgek nem mutattak hosszabb élettartamot, ami először bizonyítja a purinerg rendszer lehetséges szerepét az élettartam meghosszabbításában. Ennek megfelelően a purinerg jelátvitel a jövőben nyereségesen tanulmányozható, mint a hosszú élettartam modulációjának potenciális célpontja.

Bár a GEE magas koffeinszinttel rendelkezik, és korábbi tanulmányok leírták a koffein férgekre gyakorolt hatását (34–36), aöregedésgátlóa GEE hatásai a különböző vegyületek szinergikus hatásaihoz kapcsolódhatnak. A koffein koncentrációja a kivonatban sokkal alacsonyabb, mint a korábban kimutatott effektív koncentráció, és kimutatták, hogy a guaránából származó alkaloid kivonatnak nem volt ugyanolyan kedvező hatása (6). Ezenkívül a szakirodalomból származó adatok azt mutatják, hogy a kivonatok nagyobb farmakológiai aktivitással rendelkezhetnek, mint az izolált vegyületek (37,38).

Az skn-1, daf-16, sir-2.1 és hsp-16.2 leszabályozása a GEE-vel kezelt 9 napos C. eleganokban azt tükrözheti, hogy kevésbé kell aktiválni ezeket a géneket a sejtkárosodás helyreállításához az öregedés során, mint a kezeletlen férgek, amelyek közvetlen miatt lehetségesekAntioxidánsa kivonat által kifejtett hatások (39,40).

Így ez a tanulmány kimutatta, hogy aöregedésgátlóa guarana hatásait aAntioxidánsaktivitás és DAF-16, HSF-1 és SKN-1 útvonalak. Ezenkívül az ADOR-1-re is szükség volt a GEE élettartamra gyakorolt hatásaihoz, jelezve a purinerg rendszer lehetséges részvételét a hosszú élettartamban. Eredményeink hozzájárulnak a guarana hatásainak in vivo megértéséhez, ami hasznos lehet az öregedéssel összefüggő rendellenességek megelőzésében vagy kezelésében, és purinerg jelátvitelt javasolnak, mint a hosszú élettartamú vizsgálatok hihető terápiás célpontját.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők hálásak a Caenorhabditis Genetikának

Központ (CGC) a Minnesotai Egyetemen, az Egyesült Államokban a féregtörzsek pro- viding hatására, és Dr. Erik Jorgensen laboratóriumába (University of Utah, USA) az EG6890 törzs kedves ellátására. Ezt a tanulmányt a conselho nacional de de desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brazília (CNPq), a Coordenac ̧ão de Aperfeic ̧oamento de Pessoal a Nível Superior, Brazília (CAPES), a PRONEM/FAPERGS/ CNPQ és az MCTI/CNPq #472669/2011-7 és a #475896/ 2012-2 támogatta. Michael Aschnert részben támogatta az NIH R01 ES10563 támogatása. A finanszírozási források nem vettek részt

a vizsgálat megtervezésében vagy az adatok értelmezésében.