Módszerek az emberi vesebetegségek zebrafish modelljeinek létrehozására és értékelésére 1. rész

ABSZTRAKT

A vesebetegségek világszerte emberek millióit érintik. A krónikus vesebetegségben (CKD) szenvedő betegek körében végzett felmérés kimutatta, hogy a vesebetegségek terhe évről évre növekszik. A 2017-es globális betegségterh-vizsgálat (GBD) a CKD-t a 12. vezető halálok közé sorolta világszerte. Ezért nagyon fontos a vesebetegségek okainak feltárása, a pontos diagnosztikai módszerek és az új terápiák kidolgozása. Az emberi betegségeket hűen összefoglaló modellszervezetek fontos szerepet játszanak a betegség folyamatának megértésében, és értékes alapot biztosítanak gyógymódjuk megtalálásához. A zebrahal kiváló modell az emberi vesebetegségek kialakulásának, kórélettanának és molekuláris vonatkozásainak tanulmányozására. Ebben az áttekintésben összefoglaljuk a különböző genetikai és kísérleti manipulációkat, amelyeket zebradán végezhetünk az emberi vesebetegségek patofiziológiájának jobb megértése érdekében. Azt javasoljuk, hogy ezek a módszerek hasznosak lesznek a vesebetegségek kezelésére szolgáló lehetséges terápiák kidolgozásában.

A vonatkozó tanulmányok szerintcistancheegy hagyományos kínai gyógynövény, amelyet évszázadok óta használnak különféle betegségek kezelésére. Tudományosan bizonyított, hogy gyulladáscsökkentő, öregedésgátló és antioxidáns tulajdonságokkal rendelkezik. Tanulmányok kimutatták, hogy a cistanche előnyös a vesebetegségben szenvedő betegek számára. A cistanche hatóanyagairól ismert, hogy csökkentik a gyulladást, javítják a veseműködést és helyreállítják a károsodott vesesejteket. Így a cistanche integrálása a vesebetegség kezelési tervébe nagy előnyökkel járhat a betegek számára állapotuk kezelésében. A Cistanche segít csökkenteni a proteinuriát, csökkenti a BUN- és a kreatininszintet, valamint csökkenti a további vesekárosodás kockázatát. Ezenkívül a cisztanche segít csökkenteni a koleszterin- és trigliceridszinteket, amelyek veszélyesek lehetnek a betegek számáravesebetegség.

Kattintson a Cistanche Norge elemre

További információért:

David.deng

@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

KULCSSZAVAK:CKD, AKI, az emberi vesebetegségek zebrahal modellje, pronephros, vesepatológia

Bevezetés

A vese a gerincesek egyik létfontosságú szerve, amely eltávolítja a salakanyagokat, és a fiziológiás tartományon belül tartja a vér pH-ját, ion- és metabolitkoncentrációját. A vese eritropoetint választ ki, amely szabályozza a vörösvértestek képződését, és aktiválja a D-vitamint, amely segíti a csontokat a kalcium felszívódásában. Minden emberi vesében körülbelül egymillió nefron található, amelyek ennek a szervnek a szerkezeti és funkcionális egységei. Következésképpen a nefronok hibái befolyásolják a vese szerkezetét és funkcióit. A vese diszfunkciója genetikai mutációk, fertőzések, sérülések, gyógyszerek vagy a környezetben lévő mérgező vegyületeknek való kitettség miatt fordulhat elő. Az olyan krónikus betegségek, mint a cukorbetegség, a szív- és érrendszeri betegségek és a magas vérnyomás, nagymértékben hozzájárulnak a vesebetegségek terhéhez (Levey et al., 2010). A károsodott veseműködés más szervrendszerekben is növeli a szövődmények kockázatát (Thomas et al., 2008). A vesebetegségek gyakori típusait és okait az 1. táblázat tartalmazza.

Vesebetegségek

A vesebetegségek világszerte a betegségteher jelentős hányadát teszik ki. Világszerte körülbelül 750 millió embert érintenek vesebetegségek (Crews et al., 2019). A CKD a leggyakoribb köztük, 13,4 százalékos globális prevalenciával (Hill et al., 2016). A GBD 2010-es tanulmánya a CKD-t a 18. vezető halálok közé sorolta világszerte, amely 2017-re a 12. helyre ugrott, mivel a világon a legtöbb halálozást okozta (Jha et al., 2013; Carney, 2020). A GBD 2017-es tanulmánya szerint körülbelül 697,5 millió CKD-esetet jelentettek világszerte, amelyek közül 1,2 millió ember halt meg. A CKD miatti halálozások száma a becslések szerint 2040-re a legrosszabb forgatókönyv szerint 4 millióra emelkedik (Foreman et al., 2018). A CKD-betegek egyharmada két országban, Kínában és Indiában él (Bikbov et al., 2020). A CKD státusza az indiai lakosság körében nem egyértelmű a pontos adatgyűjtési rendszerek hiánya miatt. Indiában 2017-ben körülbelül 115 millió CKD esetet jelentettek (Bikbov et al., 2020). Az indiai lakosság leggyakoribb betegségei a cukorbetegség és a magas vérnyomás (Geldsetzer et al., 2018). Az Indian Council of Medical Research (ICMR) jelentése szerint a cukorbetegség és a magas vérnyomás prevalenciája a városi felnőtt lakosság körében 28 százalék, illetve 21,4 százalék (Varma, 2015). A CKD 40-60 százalékában ezek a szövődmények miatt fordulnak elő esetek, és számuk gyorsan növekszik (Rajapurkar et al., 2012). A Nemzetközi Nephrológiai Társaság vesebetegség adatközpontja a CDK 16,8 százalékos prevalenciájáról számolt be az indiai lakosság körében (Ene-Iordache et al., 2016). A CKD okai Indiában eltérőek. Andhra Pradesh, Odisha és Goa a krónikus intersticiális nefropátia néven ismert, ismeretlen etiológiájú CKD magas szintjéről számoltak be (Varughese és Abraham, 2018). Mivel a krónikus vesebetegségben szenvedők száma világszerte riasztó ütemben növekszik, sürgősen alaposan elemezni kell a gyakori vesebetegségek kiváltó okait, hogy jobb módszereket találjanak megelőzésére és gyógyítására. Az emberi fiziológiát és a beteg állapotokat utánzó modellszervezetek nagyszerű lehetőségeket kínálnak a fenti problémák megoldására. A zebrahal hasznos modelljévé vált a fejlődés és a betegségek tanulmányozásában, és ígéretes módszereket kínál új terápiás célpontok és gyógyszerek azonosítására. Ebben az áttekintésben különböző módszereket tárgyaltunk a zebradánban előforduló emberi vesebetegségek összefoglalására, valamint arra, hogy ezek a modellek hogyan használhatók a betegség patogenitásának és a mögöttes molekuláris mechanizmusok megértésére. Ez újszerű terápiás megközelítések létrehozását eredményezheti a vesebetegségek kezelésére és gyógyítására.

Hasonlóságok az emberi és a zebrahal vese között

Az emlősök vesefejlődése egyedülálló, mivel az embriogenezis során három különböző struktúrán keresztül megy végbe: pronephros, mesonephros és metanephros. Az első két struktúra átmeneti az emlősökben, és csak a metanephros marad fenn az élet során (Smyth et al., 2017; Jain, 2014). A pronephros a funkcionális vese az alsóbbrendű gerincesek, például kétéltűek és halak embrionális fejlődése során, amelyet a későbbi szakaszokban a mesonephros vált fel funkcionális veseként (Tahara et al., 1993; Diep és mtsai, 2015). A 2. táblázat leírja a különböző veseformák időtartamát emberekben, egerekben, Xenopusban és zebrahalban.

Bár a vese általános összetettsége növekszik, ahogy a magasabb formák felé haladunk, a nefronok minden típusú vese szerkezeti és funkcionális egységei. Mindegyik nefron három részből áll: a vesetestek a vér szűrésére, a tubulusok az oldott anyagok felszívódására és kiválasztására, valamint a gyűjtőcsatorna a nem kívánt salakanyagok összegyűjtésére a kiválasztáshoz. A tubuláris hám különböző szegmensekre van mintázva, hogy bizonyos funkciókat hajtson végre. A vese minden formájából származó nefronok hasonló szegmentációs mintázatot mutatnak (Desgrange és Cereghini, 2015). A zebrafish pronephros és mesonephros nefron szegmentális felépítése hasonló az emlős metanephroshoz, amint az 1. ábrán látható. A zebradán pronephros tubulus proximális csavart tubulusra (PCT), proximális egyenes tubulusra (PST) és disztális korai tubulusra (DE) oszlik. ) és disztális késői (DL) tubulusok, amelyek analógok az emlős metanefris nefronok szegmentációs mintázatával. A zebrahalnak van egy Stannius (CS) nevű teste, amely fenntartja a kalcium homeosztázist (Krishnamurthy, 1976). A CS a vese epiteliális sejtek transzdifferenciálódása révén jön létre a DE és DL szegmensek között, amelyek fokozatosan válnak el a tubulustól és alkotják a páros CS mirigyet, amely retroperitoneálisan helyezkedik el a vese felszínén felnőtt halaknál (Roberts és Ellis, 2012; Naylor et al., 2018). Az egyik fő különbség a zebrahal és az emlős nefron között a Henle hurok hiánya a zebrahalban, amely ellenáram-szorzóként működik, és velős ozmotikus gradienst hoz létre a vízmegőrzés érdekében. Ez a szegmens nem használható a zebrahal esetében, mivel édesvízi halról van szó (Elmonem et al., 2018). Mindegyik szegmens különálló sejttípusokkal és szegmens-specifikus génexpressziókkal rendelkezik, amelyek a gerincesek körében konzerváltak (Verlander, 1998; Desgrange és Cereghini, 2015). Minden vesetípus hasonló fejlődési utat követ. A következő négy szakasz egymás után vesz részt a nefron fejlődésében; A: a köztes mezoderma indukciója a vese primordium kialakulásához, B: a nephricus ductus epithelializációja és növekedése, C: a nephron speciális szegmensekre való mintázata és D: a nephron vaszkularizációja a vér szűrésére (Drummond, 2003).

Módszerek az emberi vesebetegségek zebrahal modelljeinek előállítására

A zebrahal egy pár pronephrost tartalmaz, amelyek a megtermékenyítés után 12 órával (hpf) kezdenek kialakulni, és 48 lóerővel válik teljesen működőképessé. A teljes genom szekvencia elérhetősége, 71 százalékban legalább egy zebradán ortológgal rendelkező humán gének, könnyű kezelhetőség, átlátszó embriók, rövid generációs idő, hatékony génmanipulációs technikák, transzgenikus halgenerálási módszerek és gyors szűrése teszi a zebrahalat a legalkalmasabb modellszervezetté veserendellenességeket tanulmányoznak (Howe et al., 2013; Poureetezadi és Wingert, 2016). A kifejlett zebrahal egyik alapvető jellemzője, hogy a vesekárosodásra válaszul új nefronokat képes regenerálni (Chambers és Wingert, 2016). A 3. táblázat a zebrahal és más gyakori modellszervezetek, például az egerek és a Xenopus összehasonlítását írja le. A zebradán végzett genetikai manipulációk kimutatták, hogy a vesefejlődés és -működés új genetikai összetevői azonosíthatók ezzel a modell organizmussal (Poureetezadi és Wingert, 2016). Számos módszer létezik az emberi vesebetegségek zebrahal modelljének létrehozására.

Előre genetika

A forward genetics screen segítségével azonosíthatóak azok a gének, amelyek az érdeklődésre számot tartó fenotípusokhoz kapcsolódnak (Lawson és Wolfe, 2011). Mind a kémiai, mind az inszerciós mutagenezist alkalmazzák az előrehaladó genetikai szűrésekben (Patton és Zon, 2001). A kémiai mutagenezis egy három generáción alapuló szűrés, amelyben a felnőtt férfiakat kémiai mutagénekkel, például etil-metánszulfonáttal (EMS), etil-nitrozoureával (ENU), vagy fizikai mutagénekkel, például gammasugárzással kezelik, hogy számos mutációt generáljanak a csírasejtekben (Varshney és Burgess, 2014). A mutációt hordozó halakat ezután vad típusú nőstényekkel keresztezik, hogy olyan F1 halakat hozzunk létre, amelyek a generált mutáció egyedi alléljait tartalmazzák. Az F1 halakat keresztezzük, hogy F2 hordozókat hozzanak létre, amelyeket azután kereszteznek, hogy megkapják homozigóta mutánsaikat az F3 generációban. A kívánt fenotípusú utódokat ezután izoláljuk, és felhasználjuk genetikai térképezéshez és szekvenáláshoz a mutált gén azonosítására (Patton és Zon, 2001). Ennek a képernyőnek más változatai, mint például a haploid és homozigóta diploid használata, segíthetnek csökkenteni a fenotípus és a kiváltó genetikai mutáció azonosításához szükséges időt és erőfeszítést (részletesen tárgyalta Patton és Zon, 2001). A kérdéses szervben fluoreszcens fehérjéket expresszáló transzgenikus riportervonalak kombinálhatók a hagyományos előrehaladó genetikai szűréssel, hogy könnyen szűrjék a kérdéses mutánsokat. Egy ENU-alapú mutagenezis szűrés vezetett a villanykörte (lib) mutáns zebradán azonosításához, amelyek morfológiai és nefronszegmentációs hibákat mutatnak, hasonlóan a retinsav (RA) hiányos zebradániákhoz. Azt találták, hogy a lib mutánsok az aldh1a2 174. nukleotidjánál C-A átmenettel rendelkeznek, amely az előrejelzések szerint 58 aminosav hosszúságú csonkolt fehérjét szintetizál, ezáltal megszünteti az aldh1a2 funkcióját, és befolyásolja az RA retinaldehidből történő szintézisét. Az aldh1a2-vel és DEAB-val (retinoinsav szintézis gátlóval) kezelt embriók katalitikus doménjében pontmutációt mutató lib, nyak nélküli (nls) mutáns analízise azt mutatta, hogy az RA szintjei modulálják a nefronszegmentációt azáltal, hogy megváltoztatják a szegmensspecifikus transzkripciós faktorok térbeli expresszióját (Wingert és Davidson, 2011; Begemann és mtsai, 2001; Mullins és mtsai, 1994). Egy másik Zeppelin nevű mutáns segített azonosítani a brac2-t, mint a podocita fejlődésének szabályozóját (Kroeger et al., 2017).

Az inszerciós mutagenezis egy transzpozon vagy antivírus alapú módszer, amelyet a DNS véletlenszerű beépítésére használnak különböző genomiális lókuszokba, és ez az idegen DNS segít azonosítani a mutált gént (Amsterdam et al., 1999). Az MIT Hopkins Laboratóriuma inszerciós mutagenezis szűrést hajtott végre zebrahal embriókban retrovírus vektor segítségével. 12 gént azonosítottak, amelyek a glomeruláris tubuláris régióban cisztákat mutató hibás vese fenotípusokhoz kapcsolódnak, amelyek közül négy a csillók képződésével függött össze (Sun et al., 2004). Az előremutató genetikai megközelítés hátránya, hogy a szűrési folyamat nehézkes és időigényes. Az új szekvenálási technológia fejlődése azonban sokkal hatékonyabbá tette a továbbfejlesztett genetikai megközelítést.

Génkiütés programozható nukleázok segítségével

A zebradán modellszervezetként való használatának egyik fő előnye a hatékony genomszerkesztési technikák, például a CRISPR/Cas, a TALEN és a ZFN elérhetősége (Sertori et al., 2016). A CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas9 a legsokoldalúbb és leggyakrabban használt genomszerkesztő technológia a zebrahalban. A CRISPR RNS-ből (crRNS) és a transz-aktiváló crRNS-ből (tracrRNS) álló kiméra egyetlen vezető RNS-ként (sgRNS) van kialakítva, amelyet a Cas9 fehérjével/mRNS-sel együtt injektálnak a zebradán embriókba az egysejtes stádiumban (Varshney et al. , 2016). Az sgRNS a genomban egy protospacer szomszédos motívum (PAM) NGG szekvenciával szomszédos 20 bp cél-DNS-szekvenciához kötődik, a Cas9 ezután kettős szálú elvágást hoz létre a cél DNS-szekvenciában. Ezt azután előnyösen nem homológ végcsatlakozással javítják, ami egy hibára hajlamos javítómechanizmus, amely véletlen beszúrás/deléció (indel) létrehozását eredményezi, ami a kódoló szekvencia olvasási keretének megváltozásához vezet, következésképpen megszünteti a az érdeklődésre számot tartó gén funkciói. Az elmúlt években fejlett módszereket fejlesztettek ki a CRISPR-alapú genomszerkesztési technika hatékonyságának növelésére (Liu et al., 2019). Lehetőség van egy nagy DNS-fragmens törlésére egyszerre két vagy több sgRNS használatával (Kim és Zhang, 2020). Az is lehetséges, hogy egyidejűleg több gént is hatékonyan megcélozzon egyetlen zebrahal embrióban (Shah et al., 2016). Számos tanulmányt végeztek zebrahal mutánsok létrehozására az emberi vesebetegségek összefoglalására a CRISPR/Cas9 technológia segítségével. Az Arl13b ciliáris membránfehérje CRISPR által közvetített kiütése olyan mutánsok létrejöttét eredményezte, amelyek utánozzák a „Joubert-szindrómát” (Cantagrel et al., 2008). Beszámoltak arról, hogy a humán ELMO1 gén mutációi hozzájárulnak a diabéteszes nefropátiához. Az elmo1 mutáns zebradán a pdx1 gén leütése által generált hiperglikémiás embriókban megfigyelhető fenotípusokat mutat, mint például nagyobb glomerulus, hibás podocita, rövidebb nyak és hiperfiltráció, így kiemelve e gén konzervált funkcióját (Sharma et al., 2016). A mutáns magi2a zebradán szteroidrezisztens nefrotikus szindrómát mutat, amely a MAGI2 mutációval rendelkező embereknél is megfigyelhető (Jobst-Schwan et al., 2019). Ezek a megfigyelések rávilágítanak arra, hogy a zebrahal mint organizmus alkalmas emberi vesebetegségek modellezésére.

Egy másik módszer a zebrahal mutánsok előállítására a transzkripciós aktivátorszerű effektornukleázok (TALEN), amelyek genomszerkesztésen alapulnak. Ebben a technikában a TALE DNS-kötő domén monomerekből áll, mindegyik monomer 34 aminosavból álló tandem ismétlődésekből áll, amelyek a DNS-szekvencia egy adott nukleotidjához kötődnek. Ezek a TALE szekvenciák a Xanthomonas patogén baktériumból származnak, amely megváltoztatja a gének transzkripcióját a gazdasejtekben (Boch és Bonas, 2010). A TALEN célzó konstrukció egy nukleáris lokalizációs szignálból, a DNS-kötő doménből és a karboxilvégükön található FokI nukleáz doménből áll. A TALEN párban működik, kötőhelyeik a DNS ellentétes szálain helyezkednek el, amelyeket 12-25 bp spacer szekvencia választ el. A konstrukciók a sejtmagban a célhelyhez kötődnek, és kétszálú szakadást hoznak létre, amelyet aztán egy nem homológ végcsatlakozással javítanak (Liu et al., 2014). A CRISPR vagy a TALEN által generált mutáns zebradán olyan géneket aktiválhat, amelyek kompenzálják az érdeklődésre számot tartó gének elvesztését, így megnehezítve a génfunkciók feltárását (Rossi et al., 2015). Azonban lehetséges ezeknek a kompenzáló géneknek az azonosítása transzkriptomanalízissel, következő generációs szekvenálási (NGS) módszerekkel, amelyek segíthetnek azonosítani a kérdéses gén funkcióját. A gén funkcióvesztését kompenzáló gének és molekuláris útvonalak azonosítása segíthet új kezelési módszereket találni a súlyos betegségeket okozó génmutációk kezelésére (El-Brolosy és Stainier, 2017).

Gének leütése morfolino antiszensz oligókkal

A morfolinok nem anionos oligonukleotidok, amelyek viszonylag stabilak DNS- vagy RNS-oligomereikhez képest (Summerton, 1999). A morfolino antiszensz oligonukleotidok a célfehérje mRNS-éhez kötődnek a transzlációs iniciációs helyén, és blokkolják a transzlációt. A morfolino antiszensz oligók egy másik típusa megcélozhatja az illesztési csomópontokat, és blokkolhatja a pre-mRNS splicinget (Summerton, 1999). A morfolino-antiszensz oligo hatás átmeneti, és felhasználható a kérdéses gének korai fejlődési szerepének tanulmányozására. A morfolino-antiszensz oligo injektálása a zebradán embriók 1-4 sejtstádiumában történik, és hatása a megtermékenyítést követő 3-5 napig látható (pdf) (Bill et al., 2009). A morfolino antiszensz oligonukleotidok gyakran mutatnak célon kívüli hatásokat (Robu et al., 2007). A kontrollkísérleteket, például a mentőkísérletet úgy kell végrehajtani, hogy morfolinót injektálnak mRNS-sel együtt, amelyet ez az antiszensz oligo nem képes megcélozni, hogy ellenőrizzék annak specifitását (Eisen és Smith, 2008). Kifejlesztettek egy fotoaktivált morfolinót, amelynek aktivitása térben és időben UV-sugárzással szabályozható (Tallafuss et al., 2012). Számos tanulmányt végeztek a morfolino antiszensz oligo-mediált génkiütéssel az emberi vesebetegségek megértésére. Például a nephrocisztin-3 gén leütése ciszták és vízfejűség kialakulásához vezetett zebradán embriókban, hasonlóan a nephronophthisis típusú-3 betegséghez (Zhou et al., 2010).

A számos életveszélyes fertőzés kezelésére általánosan használt aminoglikozid antibiotikumok nefrotoxikus és ototoxikus hatásukról ismertek (Mingeot-Leclercq és Tulkens, 1999). A gentamicin egy gyakran használt antibiotikum, amely akut vesekárosodást (AKI) okozhat zebradániában. A gentamicin az ecsetszegély epitéliumának ellaposodását, a tubuláris epitélium elvesztését, a glomerulus szerkezetének deformálódását, lizoszómális foszfolipidózist és leukociták vagy sejttörmelék felhalmozódását okozza a tubuláris lumenben, ami utánozza a gentamicin túladagolását emberben (Cianciolo Cosentino et al.). A zebrahal képes regenerálni és pótolni a sérült nefronokat. A gentamicin inzultus felhasználható a vese regenerációjának tanulmányozására zebradánban (Kamei et al., 2015). A gentamicin sérülése regenerációs választ indukál, amely a vese őssejteket a specifikáció, a proliferáció és a differenciálódás szakaszában indítja el, hogy új nefronokat hozzon létre. Kifejlett halakban körülbelül 14-21 napba telik a nefronok regenerálódása (Diep és mtsai, 2011; McCampbell és mtsai, 2015). A ciszplatinnak, amelyet kemoterápiás gyógyszerként használnak daganatok kezelésére, szintén nefrotoxikus hatása van, amint azt zebradánoknál is megfigyelték (Henschel és mtsai, 2005). Az etimicin egy másik aminoglikozid, amely használható, miközben az alacsony nefrotoxicitást és ototoxicitást utánozza a zebradán embriókban (Shao et al., 2020). Így ezen antibiotikumok segítségével az AKI és a vese regenerációja vizsgálható zebrahalban.

A vese mechanikai sérülése

A zebrafish pronephros fizikailag megsérülhet reszekció, szúrás vagy krio-sérülés segítségével. A sebészi sérülést úgy lehet végrehajtani, hogy finom csipeszekkel megszúrják a pronephros kívánt területét, hogy létrehozzanak egy AKI-modellt. Ezt a technikát a kloákához közeli pronefris csatorna károsodására használták, ami rontotta a folyadékáramlást és 30 percen belül cisztaképződéshez vezetett (Kramer-Zucker, 2005). Azt találták, hogy a pronephrosban a folyadék áramlási sebességének csökkenése ellennyomást generál a folyadék belépési helyén, ami a tubulus luminális tágulását és ciszta kialakulását okozza. A kutatók egy másik csoportja 50 LE-nél 50 LE-vel vagy a 12-hónapos zebrahal pronephricus tubulusában akadályozta meg azt, hogy csipesszel csípte le a disztális gyűjtőtubulusok közelében lévő területet (Hellman et al., 2010). Felfedezték, hogy a tubulusok hegesedése a csillók verésének növekedéséhez és a lipogén génexpressziót szabályozó foxj1a transzkripciós faktor szabályozásához vezet. Ez arra utal, hogy a pronefris tubulusok sérülése csillók alapú mechanoszenzoros jelet generál a nephron homeosztázis fenntartása érdekében.

Lézerrel kiváltott vesekárosodás

A lézerrel közvetített sejtablációt a vesekárosodás tanulmányozására és az AKI utánzására használják zebrahalban. Johnson és munkatársai (2011) leírtak egy módszert a lézeres ablációra, amelyet a regenerálódó nefronok követése követ. 40 kDa dextrán-FITC-t fecskendeztek be a zebradán embriók törzsébe 48-55 hpf sebességgel, hogy megjelöljék a proximális tubulus hámsejteket, amelyeket aztán 72 hpf-nél lézerrel közvetített ablációra céloztak. Az ablált embriókat ezután rodamin-dextránnal injektáltuk újra, hogy nyomon kövessék a proximális tubulus epiteliális sejtjeit. Azt találták, hogy a lézerrel közvetített ablációt követő 7. napon egy teljesen fejlett proximális tubulus képződik (Johnson és mtsai, 2011). Egy másik alternatíva egy vese-specifikus transzgenikus vonal használata a sejtek azonosítására lézer-közvetített ablációhoz és a szomszédos sejtek viselkedésének monitorozására. A Tg(atp1a1a.4:GFP) zebradán pronefris tubulusát 405 nm hullámhosszú ibolya lézerfénnyel céloztuk meg (Palmyre et al., 2014). Mivel a GFP gerjesztési spektruma a kéktől a lila fényig terjedő tartományba esik, 405 nm-es lézerfényt nyelt el, amely energiaelnyelőként működik, és potenciálisan sérülést okozhat a célhámsejtekben. Ez a kísérlet arra a felfedezésre vezetett, hogy a sejtvándorlás a sérült hám elsődleges válasza. A kollektív sejtmigráció mechanikus nyúlást okozott, amely serkentette a sejtproliferációt a sérült tubulus helyreállítása érdekében. Yakulov és munkatársai (2018) egy 2-foton lézer segítségével a Tg(cldn2b:lyn-GFP) pronefris tubulusainak egy kis részének eltávolítására használták annak meghatározására, hogy a zebradán pronefris tubulusa mikor nyeri el a regenerációs képességet. embriókat különböző időpontokban, és követték a regenerációs folyamatot. Azt találták, hogy a 2-napos embriók pronefris tubulusainak eltávolítása gyorsan helyreállt a vándorlási reakciók révén, míg a 1-napos embriók nem rendelkeztek ezzel a képességgel. Sérült zebradánembriók génexpressziós profilozását végezték el, és megállapították, hogy a cxcr4b és a csillám részt vesz ebben a javítási folyamatban (Yakulov és mtsai, 2018).

Kémiai genetika

A kis bioaktív molekulák felhasználhatók a fehérje működésének zavarására és biológiai szerepük megértésére. Számos kémiai könyvtár kapható a kereskedelemben, vagy egyedileg készíthető fehérjefunkciók vizsgálatára. Ezek a kis molekulakönyvtárak magukban foglalják a kináz inhibitorokat, proteáz inhibitorokat, nukleáris receptorokat és ligandumokat, amelyek felhasználhatók a szervek fejlődésében és működésében részt vevő jelátviteli útvonalak szerepének azonosítására (Kawasumi és Nghiem, 2007). Az elmúlt néhány évtizedben a zebrahal erőteljes gerinces modellszervezetként jelent meg a nagy áteresztőképességű kémiai szűréshez és a fenotípusos pontozáshoz (Kaufman et al., 2009). Cao és mtsai (2009) a kémiai szűrési módszert alkalmazták olyan vegyületek azonosítására, amelyek képesek megfordítani a pkd2 (a PKD oki génje) és az ift172 (a csillószálak kialakulásáért felelős gén) mutációi által okozott fenotípusokat. Felfedezték, hogy egy pánhiszton-dezacetiláz (pan-HDAC) inhibitor trichostatin A (TSA) és egy I. osztályú specifikus HDAC-gátló valproinsav (VPA) képes elnyomni a vese ciszta képződését a pkd2 knock-out modellben (Cao et al., 2009). ). Így a kémiai genetika hasznos eszköz lehet új gyógyszerjelöltek azonosítására, amelyek akár visszafordíthatják, akár elnyomhatják a betegségeket.

Genetikailag indukálható vesekárosodás modellek

Genetikailag indukálható szövet-ablációs modell használható zebrahalban, amelyben a bakteriális nitroreduktáz (NTR) expresszálódik egy választott promóter irányítása alatt, amely az NTR expresszióját a pronephros egy adott szegmensében irányítja. Az NTR a metronidazolt citotoxikus metabolittá alakítja, amely az NTR-t expresszáló sejtek halálát okozhatja (Curado és mtsai, 2008). Zhou és Hildebrandt (2012) ezt a technikát a podociták sérülésének indukálására használták azáltal, hogy NTR-t expresszáltak a podocin promoter szabályozása alatt a Tg (pod: NTR-mCherry) zebrahal vonalban. Kifejlesztették a VDBP-GFP (GFP-vel jelölt D-vitamin-kötő fehérje) kettős transzgenikus vonalát is a proteinuria nyomjelzőjeként a Tg (pod: NTR-mCherry) vonal mellett. A metronidazol-kezelés a podocita sérülését okozta, ami az egész test ödémáját és a VDBP-GFP felhalmozódását eredményezte a proximális tubulusokban, utánozva a humán nephrosis szindróma fenotípusát (Zhou és Hildebrandt, 2012).

Módszerek a pronephros fejlődésének és működésének értékelésére zebrahalban

Leírtuk azokat a módszereket, amelyek segítségével humán vesebetegség modelleket lehet létrehozni zebradánok felhasználásával. A betegségmodell létrehozása egy másik organizmus felhasználásával a kezdeti lépés, amelyet fel kell mérni, hogy képes-e hűen összefoglalni az embereknél észlelt betegség különböző aspektusait. A zebrahal számos előnnyel rendelkezik, amelyek segítségével gyorsan felmérhető, hogy képes-e helyettesítőként szolgálni az emberi vesebetegségek megértésében, amint azt alább tárgyaljuk.

Morfológiai alapú szűrés

Leggyakrabban a mutáns zebrahal embriók morfológiai különbségeket mutatnak a vad típushoz képest, amely mikroszkóp alatti megfigyelésekkel könnyen megítélhető. A zebrahal embriók átlátszósága és akár 5 napos túlélési képességük súlyos fejlődési rendellenességek esetén is jelentős előnyt jelent a morfológiai alapú szűrésekben. A hibás pronefrosszal rendelkező zebrahal embriókban megfigyelt gyakori morfológiai változások közé tartozik a szívburok ödéma, pronefris ciszták, görbült testtengely és vízfejűség (Poureetezadi és Wingert, 2016; Outtandy et al., 2019). Az ödéma a veseelégtelenség egyik gyakori tünete, amely más szervek hiányosságaiban is megfigyelhető, mint például a szívfejlődés (Hanke et al., 2013). A vesehibás mutánsokban a hámsejtek egyéb ver-proliferációja miatt ciszták alakulhatnak ki, amint ez mikroszkóp alatt könnyen megfigyelhető (Zhao és Malicki, 2007; Yamaguchi és mtsai, 2006). A hajlított test tengelye gyakran látható pronefris csillóhibákkal rendelkező mutánsokban. A mutáns zebrahalak, mint például a Locke (lok), a shen yantf214a(shy), a garbustm304 (grb) és a zatortg238a (zar) néhány további példa, amely görbült testtengelyt mutat (Zhao és Malicki, 2007). A vesehibás zebrahal mutánsok több morfológiai hibát mutatnak ugyanabban az embrióban. A pkd1a és pkd1b két policisztin gén leütése a szájban görbült testtengelyhez, vízfejűséghez, porc- és craniofacialis defektusokhoz vezetett, alacsony gyakorisággal pronefris cisztákkal (Mangos et al., 2010). Az ift57, ift88 és ift172 intraflagelláris transzportfehérjék mutánsai, ahol a csillók hibásak voltak, ventralisan ívelt testtengelyűek voltak (Lunt et al., 2009). Így a vesehibás zebrahal mutánsok számos morfológiai jellemzőt mutatnak, amelyek könnyen azonosíthatók.

További információ: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501