Az emlősök veleszületett immunválaszát szabályozó baktericid/permeabilitást növelő fehérje (BPIFA1) molekuláris evolúciója 1. rész

Absztrakt:

A baktériumölő/permeabilitást növelő fehérje, az emlősök veleszületett immunrendszerének elsődleges tényezője, részt vesz a behatoló baktériumok elleni természetes immunvédelemben. A BPIFA1 számos mechanizmuson keresztül aktívan hozzájárul a gazdaszervezet védelméhez, például antibakteriális, felületaktív, légúti felületi folyadékszabályozás és immunmoduláló aktivitások révén. A BPIFA1 gén evolúciós története és szelekciós erői azonban az emlősökben az adaptív evolúció során kevéssé ismertek. Ez a tanulmány megvizsgálta az ember BPIFA1 génjét más emlősfajok génjével összehasonlítva, hogy megbecsülje az adaptív evolúcióból származó szelektív nyomást. Annak felmérésére, hogy pozitív szelekció történt-e vagy sem, több különböző lehetőség tesztet alkalmaztunk (M1 vs. M2 és M7 vs. M8).

A pozitívan kiválasztott helyek aránya szignifikáns volt, a BPIFA1 fehérje valószínűségi logaritmikus értéke 93,63. A Selection szervert ugyanazon az adatkészleten használták arra, hogy a mechanikai-empirikus kombinációs modell alkalmazásával ismét megerősítsék a pozitív szelekciót bizonyos helyek esetében, így további bizonyítékot szolgáltatva a pozitív szelekció megállapításait alátámasztó tényekre. Az emlősfajok BPIFA1 génjeinek pozitív szelekciós szignáljainak meggyőző bizonyítékai voltak, amelyek jelentősebbek voltak a szelekciós jelek és a jelek létrehozása szempontjából.

A BPIFA1 fehérje, más néven LPLUNC1 vagy nasopharyngeal carcinoma-asssociated Gene 6 (NAG6), egy fehérje, amely erősen expresszálódik a felső légutakban és a szájüregben. A BPIFA1 fehérje szorosan kapcsolódik az immunitáshoz.

Tanulmányok kimutatták, hogy a BPIFA1 fehérje antibakteriális és immunmoduláló hatással rendelkezik. A BPIFA1 fehérje kötődhet az invazív Escherichia colihoz, és tönkreteheti annak sejtmembránját, ezáltal antibakteriális szerepet játszik. Ezenkívül a BPIFA1 fehérje immunmoduláló szerepet játszik azáltal, hogy aktiválja a Toll-like receptor (TLR) 4 és TLR2 útvonalakat, elősegítve a gyulladásos válaszokat, az apoptózist és az immunsejtek aktiválódását.

A BPIFA1 fehérje és a légúti betegségek közötti kapcsolatot is alaposan tanulmányozták. Például tanulmányok kimutatták, hogy a BPIFA1 fehérje expressziós szintje légúti betegségekben, például bronchiális asztmában és krónikus obstruktív tüdőbetegségben (COPD) szorosan összefügg a betegség súlyosságával. Főleg fertőzéses körülmények között a BPIFA1 fehérje expressziós szintje jelentősen megnőhet, így részt vesz a légúti immunválasz és a flóra egyensúlyának szabályozásában.

Ezért nem hagyható figyelmen kívül a BPIFA1 fehérje immunrendszerben betöltött szerepe, és a légúti betegségekkel és fertőzésekkel való kapcsolata további mélyreható vizsgálatokat igényel. Ezért fokozott figyelmet kell fordítanunk immunitásunk javítására. A Cistanche jelentős hatással van az immunitás javítására. A húsban található poliszacharidok szabályozhatják az emberi immunrendszer immunválaszát, javíthatják az immunsejtek stressz-képességét, erősíthetik az immunsejteket. baktericid hatás.

Kattintson ide, hogy megtudja a teljes élelmiszereket

Valószínűségi teszteket végeztünk, amelyekben különböző modelleket hasonlítottunk össze a dN/dS arányok alapján, hogy felismerjük a pozitív szelekciós nyomás alatt lévő specifikus kodonokat. Pozitívan szelektált helyeket azonosítottunk a BPIFA1 fehérjék LBP-BPI doménjében az emlős genomban, köztük egy lipidkötő domént, amely nagyon magas fokú DPPC-szelektivitással rendelkezik. A BPIFA1 aktiválja a felső légutak veleszületett immunrendszerét, válaszul számos genetikai jelre az emlős genomban. Ezek az eredmények rávilágítanak az immunszabályozó hatások evolúciós fejlődésére, amelyek jelentős szerepet játszanak az emlősfajok antibakteriális és vírusellenes védekezésében.

Kulcsszavak:

BPIFA1; bakteriális; immunrendszer; molekuláris evolúció; pozitív szelekció.

1. Bemutatkozás

A baktericid permeabilitást növelő fehérje (BPI) egy rendkívül hatékony antimikrobiális fehérje, amely megköti és semlegesíti a baktériumok külső membránjából felszabaduló lipopoliszacharidokat [1]. A BPI foldet tartalmazó család A-tag 1 (BPIFA1) génje ismert, hogy hatással van a helyi immunrendszerre, és ezek a hatások potenciálisan befolyásolhatják a mikroorganizmusok növekedését és invázióját [2]. Ennek a kapcsolatnak az egyik lehetséges mechanizmusa a BPIFA1 azon képessége, hogy fokozza a baktériumok fagocita sejtek általi felszívódását és elpusztító képességét [3].

Bár minimális szekvenciahasonlóságuk van, a BPI-nek két doménje van, amelyek ugyanazt a szerkezeti hajtást veszik fel [1,4]. A Gram-negatív baktériumok behatolása integrált gazdaválaszt eredményez, amelyet a lipopoliszacharid-kötő fehérje (LBP) jelenléte elősegít. Az LBP egy endotoxin-kötő fehérje, amely szorosan kapcsolódik a BPI-hez, és azzal koordinálódik [5]. A BPIFA1 szabályozza a nyálkahártya mikrobiotáját és a kiindulási interferon jelátvitelt. A SPLUNC1 (korábbi nevén BPIFA1) egy fehérjeredős családtag, antibakteriális, felületaktív és immunmoduláló hatással, amelyek mindegyike hozzájárul a gazdaszervezet védelméhez. A légzőrendszer az elsődleges kifejeződési helye [6]. A SPLUNC1, a PLUNC egérgén humán homológja ugyanazt az expressziós mintázatot mutatja a felső légutakban és a nasopharyngealis területeken, mint az egér homológja. A Gram-negatív baktériumok elleni antibakteriális hatást a kódolt antimikrobiális fehérje mutatja [5]. Nem kissejtes tüdőrák esetén potenciális molekuláris markerként szolgálhat a mikrometasztázisok lokalizálásához. Több transzkript variánst fedeztek fel a 3' nem transzlálódó régió alternatív splicing eredményeként; ezen átirat-változatok közül azonban csak három teljes hosszúságú természetét értjük [7].

Mind az egereknél, mind az embereknél jelentős a BPIFA1 génexpresszió szintje a légcső felső részében, de ez az expresszió a légcsőtől való távolság előrehaladtával csökken, a fő szárhörgők bifurkációjánál eléri a minimumot, és a tüdő perifériáján észlelhetetlenné válik. [8]. Egereken és embereken végzett kiterjedt génexpressziós vizsgálatok nem mutatták ki a BPIFA1-et a perifériás tüdőszövetben [9]. Az egér csecsemőmirigyében, a patkányszívben és a szagló nyálkahártyában a BPIFA1 mRNS expressziójának nagyon alacsony szintjétől eltekintve a BPIFA1 nem expresszálódik egyetlen szervben vagy szövetben sem a rágcsálók légzőrendszerén kívül [10]. Nincs arra utaló jel, hogy a BPIFA1 mRNS jelen lenne a következő emberi szövetek bármelyikében: szív, máj, agy, gyomor, vékonybél, méhlepény, vázizom, hasnyálmirigy, lép, normál nyirokcsomók, perifériás limfociták, prosztata, here vagy petefészek [11].

A BPIFA1 mRNS expressziója olyan eloszlási mintát követ, amely nagyon hasonló az embrionális és a felnőtt szövetekben. Ez a mintázat mindkét típusú szövetben megfigyelhető [1]. A BPIFA1 túlzott expressziója transzgenikus egerekben alveoláris makrofágokat termelt a szén nanocsövek fokozott opszonizációjával és fagocitózisával a szabályozott légúti gyulladás modelljében [12]. Ezenkívül kimutatták, hogy a kommenzális Gram-negatív nanobaktériumok a BPIFA1-gyel együtt lokalizálódnak a nasopharyngealis rákos szövetek hámsejtjeiben [13]. A mintákat olyan betegektől vették, akiknél korábban nasopharyngealis karcinómában szenvedtek. Egy közelmúltbeli tanulmány eredményei arra utalnak, hogy a BPIFA1 és a nem bakteriális LPS közötti kölcsönhatások enyhíthetik a szervezet nem bakteriális LPS által okozott gyulladásos válaszát. [1].

Antibakteriális hatásai és szerkezetének megőrzése a levegőt lélegző gerincesekben azt sugallja, hogy a BPIFA1 úgy fejlődött, hogy alapvető gazdavédő képességet biztosítson [14]. A proximális légutakban való elhelyezkedése és a bazális körülmények között fennálló magas szintje miatt azonban a BPIFA1 nélkülözhetetlen lehet. Ennek az az oka, hogy állatokban bőségesen fordulnak elő antimikrobiális effektorok [15]. Következésképpen úgy tűnik, hogy a BPIFA1 rendelkezik a legjelentősebb hatásokkal a fertőzés elkerülésében és a kórokozók inváziója előtti megtisztításában. Ezeknek a funkcióknak köszönhetően megelőzhetők a légúti bakteriális fertőzések, amelyek az immunitás aktiválódását és más légúti funkciók jobb szabályozását jelezhetik [15].

Úgy gondolják, hogy a környezeti igényekre reagáló adaptív változásokat biofizikai tényezők korlátozzák, de az adaptív változásokat tartalmazó helyszínek szerkezeti vonatkozásait egyetlen evolúciós elmélet sem tudja megjósolni [16]. Ennek az az oka, hogy a biofizikai korlátok korlátozzák a fehérjeműködés fenntartásához megengedett szubsztitúciók típusait [17]. A pozitív szelekció elterjedtebb lehet a fehérjék azon szakaszaiban, ahol a mutációk várhatóan kisebb hatást fejtenek ki, mint a fehérje más részein, bár ez nem bizonyított (pl. alloszterikus szabályozási helyek) [18]. A funkcionális régiók azonban várhatóan lényegében konzerváltak maradnak az evolúció során, annak ellenére, hogy az adaptív változások a kedvező mutációk gyors rögzítésével járnak [19]. A fehérjeszekvenciák molekuláris evolúcióját jelentősen befolyásolja a természetes szelekció folyamata.

A genomszekvenálás legújabb fejlesztései, valamint a filogenetikai és populációs szintű megbízható következtetési módszerek lehetővé tették a természetes szelekció által vezérelt evolúciós sebességek és alkalmazkodások gyors és megbízható értékelését [20]. Mind filogenetikai, mind populációs szinten jelentős mennyiségű munka folyt a következtetési módszerek kidolgozására. Ezenkívül a fehérje szerkezeti és funkcionális adataihoz való növekvő hozzáférés lehetővé tette a kutatók számára, hogy megvizsgálják a szerkezeti és funkcionális korlátok hatását a fehérjeszekvenciák evolúciójára és adaptációjára [16]. A szerkezetük és funkcióik által támasztott korlátok miatt az evolúció és az adaptáció sebessége különböző fehérjéknél és ugyanazon fehérjén belüli helyeknél [19].

A sejtek funkcióinak nagy része bonyolultan összefonódik a génexpresszió szabályozó hálózataival, amelyek lehetővé teszik az organizmusok számára, hogy elviseljék a magasabb fertőzési szintet, vagy mérsékeljék e fertőzések hatásait [21]. A sejtfiziológiát alkotó komponensek többsége szorosan kapcsolódik ezekhez a génexpressziós szabályozórendszerekhez, amelyek gyakran régi evolúciós adaptációk [22]. Ezek a mechanizmusok jelentős érdeklődést váltottak ki olyan kutatások iránt, amelyek olyan korlátozott modellfajokat alkalmaztak, amelyekről genetikai információ áll rendelkezésre [23]. Azonban keveset tudunk azokról a mechanizmusokról, amelyek ezeknek a rendszereknek az evolúciójához vezettek, vagy arról, hogy a fejlődés előrehaladtával hogyan alkalmazkodtak a különféle környezeti feltételekhez.

Ennek a tanulmánynak a célja a BPIFA1 gén evolúciós eredetének vizsgálata, hogy feltárja fizikokémiai jellemzőit, és összehasonlító genomika segítségével értékelje a gént különböző emlősfajokban. Mélyreható összehasonlító vizsgálatokat végeztünk az emlősök veleszületett immunválaszát szabályozó baktericid/permeabilitást növelő fehérje (BPIFA1) génnel, hogy jobban megértsük e gének működését. Fennáll annak lehetősége, hogy a szelektív nyomás jelentős hatással lesz az alkalmazkodás alakulására. Ebben a tanulmányban megvizsgáljuk e gének történetét különböző gerinces fajokban, valamint azt, hogy a genetikai sokféleség és a természetes szelekció hogyan befolyásolta az idők során ennek a géncsaládnak a fejlődését.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Szekvencia visszakeresés és elemzés

A BPIFA1 gén aminosav- és kódoló nukleotidszekvenciáját 34 emlősfajban, köztük az embert mint referenciafajt ebben a vizsgálatban, a GenBank-ból gyűjtöttük össze (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, elérhető: 20. 2021. szeptember), és a MEGA 6 szoftver Clustal Omega eszközével igazították őket [24]. A MEGA 6 szoftverben a maximális valószínűség módszerét használták a BPIFA1 gén filogenetikai fának előállítására. Ezt a fát a gének közötti evolúciós kapcsolatok alapján hozták létre. A bootstrap teszt kiszámította a helyenkénti helyettesítések átlagos számát és az átlagos elágazás hosszát egy maximum likelihood módszer alkalmazásával, 1000 ismétléssel a taxonómiai klaszterek meghatározására. Ezt a módszert használták a fejlettebb log-likelihood értékek topológiájának kiválasztására [25,26]. A BPIFA1 gén tanulmányozásához használt fajneveket és hozzáférési számokat az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza.

2.2. Kiválasztás elemzése

Maximális valószínűségi megközelítést alkalmaztunk a dN/dS arányának összehasonlítására az egyes kodonhelyekre, hogy azonosítsuk a pozitív szelekciónak alávetett emlős BPIFA1 génszekvenciák specifikus kodonjait [27,28]. PAML-ben [29] végrehajtott CODEML-t és a DATA MONKEY webszervert (https://www.datamonkey.org, elérve 2021. szeptember 29-én) [30] használtuk az elemzéshez, és az eredményeket a kodonok helyettesítési arányai alapján határoztuk meg. jóval magasabbak voltak, mint 1 a pozitív szelekció alatt álló kodonok esetében. A kutatás kezdeti lépése annak meghatározása volt, hogy a maximális valószínűségi arány teszt segítségével pozitív szelekció történt-e vagy sem.

Ez az elemzés meghatározta egynél nagyobb dN/dS arányú helyek jelenlétét. Ebben a tanulmányban egy diszkrét (általános) modellt, amely ezt a funkciót teljesítette, szembeállítottuk egy nullmodellel, amely megtiltotta az 1-nél nagyobb értékű webhelyek előfordulását [31]. Az elemzéseket valószínűségi log (2∆l) eloszlással hasonlítottuk össze df=4 értékkel. A nullhipotézis (M7) azt állította, hogy az eloszlást az 0 és az 1 értékek határolják. Egy alternatív modell (M8) két paraméterrel, az omega (ω) és a béta ( ) paraméterrel lehetővé teszi egy érték származtatását az adatkészletet, amely nagyobb lehet 1-nél [27]. A rögzített hatás valószínűségét (FEL), az egy valószínűségű ősszámlálást (SLAC) és a véletlen hatás valószínűségét (REL) használó elemzések azt mutatták, hogy a BPIFA1 gén pozitív szelekciónak volt kitéve, amikor az egyes helyeken a szinonim és nem szinonim eltérések globális értékeit hasonlították össze. [32].

A második lépés a maximális valószínűségi becslés felhasználása volt az evolúció során pozitív szelekció tárgyát képező aminosav-pozíciók lokalizálására. A cél eléréséhez a Bayes-tételt használták, amely megjósolja a pozitív szelekciónak alávetett helyek utólagos valószínűségét. Pozitív szelekciót figyeltek meg az aminosav helyeken, 95-99 százalékos posterior valószínűséggel [33]. Azokat az aminosavmaradékokat, amelyek nagy valószínűséggel nagyobbak voltak, mint egy, szelektív eljárásnak vetettük alá. A svájci modell és a Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ec.k/pyre/html, elérve 2021. szeptember 28-án) olyan webalapú alkalmazások, amelyek a fehérjeszerkezeteken jelenítik meg a kedvezően kiválasztott aminosavak elhelyezkedését. [34].

Megjósoltuk a nukleinsavak és aminosavak evolúciós konzerválódásának helyét a fehérjében a ConSurf eszköz segítségével (http://consurftest.tau.ac.il, elérve 2021. szeptember 28-án), amely a szekvenciák közötti filogenetikai kapcsolaton alapult. 35]. A BPIFA1 összehangolt kodonjának szekvenciáját a Selecton 2.2-es verziójában (http://secton.tau.ac.il, elérve 2021. szeptember 28-án) vizsgáltuk, amely lehetővé teszi a különböző kodonok eltérő arányának meghatározását az összehangolt szekvenciákon belül. Ezeket az arányokat a Bayes-féle következtetési módszerrel mértük különböző valószínűségi tesztekkel. Ezt a pozitívan szelektált kodonok megerősítésére végeztük [36]. Ezen túlmenően, a kiválasztási eredmények különböző színekben jelennek meg a különböző kiválasztási kritériumok jelzésére.

2.3. Rekombinációs elemzés

A rekombináció bizonyítékának megtalálása érdekében modellkiválasztási eljárást hajtottunk végre a statisztikai valószínűség alapján, amely számos szekvencia-illesztést képes átszűrni töréspontok keresése és a valószínű rekombináns DNS kiszűrése érdekében. Ez a technika egy genetikai algoritmust használt, hogy több szekvencia igazításában keressen rekombinációs töréspontokat, hogy elérje célját. A GARD megközelítés egyszerűen megragadható, könnyen bővíthető és nagymértékben párhuzamosítható. Kiterjedt szimulációs kísérletek kimutatták, hogy a módszer szinte minden esetben felülmúlja a többi jelenlegi eszközt, különösen a pontosság tekintetében.

A rekombináció bizonyítékainak vizsgálatához először a nukleotidszekvenciákat értékelték, hogy azonosítsák a haplotípusokat (Na) és megbecsüljék a polimorf helyeket (S), a nukleotid-különbségek átlagos számát (K) és a nukleotiddiverzitást (π) DnaSP 5.10 szoftverrel [37]. ]. A töréspontok kimutatását és a rekombináns jelek értékelését a nukleotid szekvenciákban a Datamonkey webszerver online GARD eszközével végeztük [38]. Ezen túlmenően a szekvenciák rekombinációra való szűrésére a GARD alkalmazása biztosítja, hogy a pozitív szelekció azonosítására összpontosító módszerek elfogadható statisztikai jellemzőkkel rendelkeznek.

2.4. Fehérje-fehérje kölcsönhatások elemzése

Nagy érdeklődés irányult annak vizsgálatára, hogy hogyan maradnak fenn a fehérje-fehérje kölcsönhatások egyik fajról a másikra. Mivel az interaktome adatok kísérleti azonosítása és megerősítése számos akadályba ütközik, érdekes lenne megérteni egy olyan fajról átvitt PPI-t, amelyet egy másik fajban igazoltak [39]. A STRING adatbank egy ingyenes bioinformatikai erőforrás, amely információkat tartalmaz arról, hogy a fehérjék hogyan lépnek kölcsönhatásba egymással több útvonal részeként. Az egyes fehérjecsomópontokat összekötő vonalak számát és a közti értékeket a köztes csomópontok azonosítására használják, amelyek olyan fehérjéket képviselnek, amelyek fontos biológiai szerepet játszanak és szorosan kapcsolódnak egymáshoz. A hálózat létrehozása a STRING segítségével történt, és a Cytoscape szoftvert (http://www.cytoscape.org, elérve 2021. szeptember 29-én) használták a hálózat megjelenítéséhez [40]. A BPIFA1 fehérje-fehérje kölcsönhatásainak azonosításával az immunfehérjék között és a koexpressziós elemzéssel a STRING 9.1-es verziójával (http://www.string-db.org, 2021. szeptember 29-én elérhető), tovább tudtuk meghatározni a BPIFA1 működését. molekuláris szinten.

2.5. A BPIFA1 fehérje szerkezeti elemzése

Ebben az elemzésben a humán BPIFA1 fehérje kristályszerkezetét építettük fel homológiamodellezéssel online eszközökkel, például a svájci modellel (http://swissmodel.expasy. org, elérve 2021. szeptember 29-én) [41], I-TESSAR [42] és a Phyre2 (http://www.sbg. bio1.ic.ac.uk/phyre2/html, elérve 2021. szeptember 29-én) [43]. A konjugált gradiens módszert és az Amber erőteret az UCSF Chimera 1.10.1 szoftverben használtuk az összeállított célfehérje csökkentésére. Emellett a ProSA webszervert is felhasználtuk a várt szerkezet sztereokémiai tulajdonságainak értékelésére [22].

For more information:1950477648nn@gmail.com