Nano tejfehérje-nyálka komplexek: jellemzés és rákellenes hatás 2. rész

További információért vegye fel a kapcsolatottina.xiang@wecistanche.com

Kattintson a linkre az 1. rész megismeréséhez:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3. Anyagok és módszerek

3.1. Anyagok

A Plantago ovata (szubgóális) héjat és a Ziziphus Spina-Christi (Nabeq) érlelő gyümölcsét az egyiptomi Gízából vásárolták; a tejfehérje-koncentrátumot (MP,81,3% fehérje) a Fonterra cégtől (Auckland, Új-Zéland) vásárolták. Az MPC-ben lévő kazein- és tejsavófehérjék nagyrészt natív és hasonló, micelláris formában vannak, mint a tejben. Minden felhasznált vegyi anyag analitikai tisztaságú volt.

3.2.Isabgol Husk Mucilage (IHM) és Nabeg Mucilage (NabM) előkészítése

Az Isabgol héj nyálka (IHM) és a Nabeq mucilage (NabM) az El-Maksoud et al. által leírt módszer szerint készült [5]. Röviden, az isabgol héj szuszpenzióját úgy állítottuk elő, hogy 1,2 g-ot 100 ml desztillált vízben oldottunk és acetonos oldattal tisztítottuk. A kapott gélt használatig hűtőszekrényben (4-5°C) tároltuk.

A NabM esetében az érett Nabeq gyümölcsöket alaposan megmosták csapvízzel, hogy eltávolítsák a szennyeződéseket. A friss gyümölcsöket elválasztottuk a magoktól, és apró darabokra vágva 1:10 (m/v) arányban desztillált vízzel összekevertük. A keveréket laboratóriumi turmixgéppel (Toshiba Mixie, Japán) kevertük, és 12 órán át hagytuk állni a hűtőszekrényben.

A porcos kivonatot ezután 2000 fordulat / perc sebességgel 30 percig centrifugáltuk, és egy muszlinszöveten keresztül szűrtük. A kapott viszkózus oldható nyálkát acetonnal kicsaptuk. A kapott nyers nyálkafolyadékot a hűtőszekrényben tároltuk, amíg fel nem használták.

Analitikai célból a nyálkát légkemencében szárítottuk 40°-os cand-on mm400(Retsch, Németország) golyósmalommal. Megmérték a psyllium héj nyálkás por (PHMP) és a Nabeq mucilage por (NabMP) kémiai összetételét. A nedvesség, a fehérje, a zsír, a hamu, a nyersrost és az összes szénhidráttartalom 8,49, 0,34,0,21,21,2,13,13,53 és 87,44% volt a PHMP és 9,18,4,72,2,05,2,69,1,70 és 78,26% a NabMP esetében. Az így kapott port hűvös hőmérsékleten (4-5 °C) tároltuk a további elemzésig.

Kattintson ide, ha további információt szeretne megtudni

3.3. Tejfehérje-nyálka komplexek (MPMC) előkészítése

Az IHM-mel és NabM-mel rendelkező tejfehérje (MP) komplexeket Morr et al. szerint készítettük, néhány módosítással [44]. A tejfehérje-koncentrátumot desztillált vízben (10%) alakítottuk ki. Az így kapott tejfehérje kolloidot IHM-mel és NabM-mel kevertük 1:3 (o/o) arányban. A keverék pH-ját 10-re állítottuk, és 10 percig állni hagytuk. Ezt követően a pH-t 0,1 N HCl-lel 3,5-re csökkentettük, és további 10 percig hagytuk. A pH-t ezután 4,6-os pH-ra állítottuk 0,5 M NaOH-val, hogy MPMCby-szűrést gyűjtsünk egy szűrőpapíron: az MP-t, valamint az ebből eredő MPMC-t liofilizálással -45 °C-on 24 órán keresztül szárítottuk a Novalyphe-NL500 liofilizátor, Savant Instruments, Holbrook, NY, USA segítségével.

3.4. Fizikai-kémiai és funkcionális jellemzők

3.4.1.pH mérés

A kapott termékek pH-ját 10%-os oldatban kalibrált pH-mérővel (HANNA, HI 902 m, Németország) mértük.

3.4.2.Az ömlesztett sűrűség (BD), a kicsapolt sűrűség (TD) és a Carr-index meghatározása

Az MPMC port egy 50 ml-es mérőhengerbe öntöttük 25 ml-ig, amely megfelel a kiaknázatlan térfogatnak, majd 5-10-szer ütöttük, amíg a por térfogatának további változását nem észlelték a ragasztott térfogatnak megfelelően.

A térfogatsűrűséget, a csapsűrűséget és a Carr-indexet a következő egyenletek alkalmazásával határoztuk meg [45]:

(1) BD = tömeg/ kiaknázatlan térfogat

(2) TD = tömeg/lecsapolt térfogat

(3) Carr indexe (%)= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. Vízfelvételi index (WAI) és vízoldhatósági index (WSD)

Az MP és MPMC vízoldékonyságát és vízelnyelő indexeit a Yagc és Gogus által leírt módszer szerint vizsgálták, néhány módosítással [46]. A mintákat (0,5 g) 10 ml desztillált vízben diszpergáltuk 25°Cin centrifugacsőben. Miután 30 percig álltunk, 5 percenkénti cső inverzióval, a mintákat 3500 fordulat / perc sebességgel centrifugáltuk 15 percig. A szűrletet egy alumínium lemezre vittük, és 3 órán át szárítottuk 105 °C-on. Feljegyeztük a maradék gél súlyát, és a WSI-t és a WAI-t a következőképpen határoztuk meg:

(4) WAI(g/g)= A gél súlygyarapodása/A minta száraz tömege

(5) WSI%= A szárazanyag tömege felülúszóban ×100/A minta száraz tömege

3.4.4. A tejfehérje emészthetősége

A fehérje emészthetőségét Abd El-Ghany et al. szerint határoztuk meg [47]. Röviden, az MP és MPMC mintákat desztillált vízben 6,38 mg/ml koncentrációban diszpergáltuk, és a pH-t 8,0-ra állítottuk. Egy milliliter frissen elkészített enzim törzsoldat (1,6 mg/ml tripszin, 3,1 mg/ml kimotripszin és 1,3 mg/ml ER amino-peptidáz1

(ERAP1)37°C-on fehérjeszuszpenzióval keverték össze. A pH-t 10 perc elteltével rögzítettük, és az enzimaktivitást kazeinnel, referenciaként határoztuk meg. A fehérje emészthetőségének kiszámításához a következő egyenletet használtuk [47]:

(6)% Emészthetőség = 210,46-18,10 (pH)

3.5.A PHM és a NabM fenolos frakciói

A HPLC-analízissel végzett nyálkaminták fenolos vegyületeit az Elsayed et al. által leírt protokoll szerint végeztük [48]. Röviden, a nyálkakivonatot egy Agilent 1260-as sorozatú HPLC-rendszerrel elemeztük (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). Az elválasztást a C18 oszlop segítségével (100 mm×4,6 mm i.d.,5 um) vezettük át. A mozgó fázis (A) 0,2% H3PO4, (B)metanol és(C) acetonitrilt tartalmazott 0,6 ml/perc áramlási sebességgel. A gradiens elute a következő séma szerint volt: 0-11 perc (96% A., 2% B);11-13 perc (50% A,25% B);13-17 perc (40% A,30% B);17-20,5 perc (50% B,50% C); és 20,5-30 perc (96% A,2% B). A detektálási hullámhosszt (UV-detektor,284 nm) 284 nm-re állítottuk be. A befecskendezési méret 20 μL volt, és az oszlop hőmérsékletét 30 °C-on tartották. A vegyületeket úgy ismerték, hogy összehasonlították retenciós idejüket az autentikus szabványokból származókkal. Kalibrációs görbéket használtunk a vegyületmennyiségek kiértékelésére.

3.6.Az MP és MPMC teljes fenolos és flavonoid tartalma

A polifenolos tartalmat folin-ciocalteu módszerrel határoztuk meg, néhány módosítással [5]. Röviden, 2,8 ml 10 mg MP-t vagy MPMC-t tartalmazó milli-Qwatert összekevertünk 2 ml 2% 2% nátrium-karbonáttal és 0,1 ml 50% Folin-Ciocalteau reagenssel. 30 perc szobahőmérsékleten történő inkubálás után a reakcióelegy abszorbanciáját 750 nm-en mértük ionmentes vízzel szemben, spektrofotométerrel (Hitachi, 100-20 modell). A gallinsavat (GA) standard fenolos vegyületként használtuk, és hétpontos standard görbét (0-200 mg/l) építettünk fel. Az eredményeket milligramm galluszsav-egyenértékben fejeztük ki grammfehérjénként (GAE/g).

flavonoidoka tartalmat az Abedelmaksoud és munkatársai által korábban leírt alumínium-klorid módszerrel határoztuk meg, néhány módosítással [5]. Röviden, 2,8 ml milli-Q vizet, amely 10 mg MP-et vagy MPMC-t tartalmaz, összekevertük 0,1 ml 10% alumínium-klorid-hexahidráttal és 0,1 ml 1 M kálium-acetáttal. 40 percig szobahőmérsékleten történő inkubálás után a reakcióelegy abszorbanciáját 415 nm-en mértük ionmentes vízzel szemben, mint vakpróba. A kvercetint standardként használtuk egy hétpontos standard görbét (0-50 mg/l) használva. Az összes flavonoid tartalmat milligramm kvercetin ekvivalensekben (QE/g) fejeztük ki.

3.7. Az MP és az MPMC antioxidáns aktivitása

Az MP és az MPMC teljes szabadgyök-eltávolító képességét három különböző antioxidáns vizsgálattal értékeltük: Stabil 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil(DPPH), Azino-bisz(3-etil-benzitiazolin-6-szulfonsav (ABTS) és hidroxil-gyök (HS) gyökök, amint azt korábban El-Maksoud et al. [5] leírta.

3.8. Mp és MPMC aminosavprofilja

A fehérjemintákat 6 N HCl-lel hidrolizáltuk Peksa et al. [49. Automatizált aminosav-analizátor(AAA 400, INGOs Kft.) aminosavak meghatározására használták.

3.9. Reológiai tulajdonságok

A mintákat Barnes [50] leírása szerint készítettük el, néhány módosítással. A 2,5%(w/w)oldat viszkozitását pH7-en 25±1 °C-on határoztuk meg Brookfield viszkométerrel (DV-II+ Pro, Rheocalc Software, Németország). A feszültséget (σ) és a viszkozitást (n) a nyírási sebesség függvényében ábrázoltuk. A teljesítményjogi modell konzisztenciaindexét(K) és áramlási viselkedési indexét (n) kiszámítottuk:

Az n értéke 1-gyel egyenlő a newtoni folyadékok esetében, és 0-tól 1-ig változik a nyíró-elvékonyodó folyadékok esetében, és nagyobb, mint 1 a nyíró-megvastagodó folyadékok esetében [51].

3.10.Differenciális pásztázó kalorimetria (DSC)

Az MP és az MPMC termikus tulajdonságait differenciális pásztázó kaloriméterrel (PerkinElmer, USA) mértük. A mintákat (4-6 mg) alumíniumlemezbe helyeztük és lezártuk. Ezután minden serpenyőt 350 °C-ra melegítettünk, száraz nitrogéngáz-áramlással 20 ml min-I-nél, 10 °C min-1 fűtési sebességgel. A DSC termogram endoterm csúcsából becsültük meg a denaturáció kezdeti hőmérsékletét, a maximális átmeneti hőmérsékletet és a lebomlási pontot [52]. Meghatároztuk az átmeneti entalpiaértéket (AH) a DSC-görbe endoterm csúcsa alatti területről, és referenciaként az üres alumínium serpenyőt használtuk.

3.11. Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia (FTIR)

A 600 és 3500 cm-I közötti infravörös spektrumokat 25°-on mértük 25°-on, egy FTIR spektrofotométerrel (QFA Flex, USA) a gyengített teljes reflexiós módszerrel, 4 cm-I felbontással és másodpercenként 10 szkenneléssel.

3.12. Transzmissziós elektronmikroszkópia

Az MP és az MPMC mikrostruktúráját transzmissziós elektronmikroszkóppal (JEOL, JEM 1400 Flash, Japán) 80 kV-on vizualizáltuk. A negatív festési módszer krio-stádiumát alkalmaztuk [53].

3.13.Biológiai vizsgálatok MP-n és MPMC-n

3.13.1.In Vitro rákellenes aktivitás

A kísérletben használt összes sejtvonalat az American Type Culture Collection-től (ATCC, Manassas, VA, USA) szereztük be. Ebben a vizsgálatban két humán rákos sejtvonalat használtunk: emlő adenokarcinóma (MCF-7, ATCCHTB-22TM) és hepatocelluláris karcinóma (HepG2, ATCC4 HB-8065TM). A nem rákos bőr fibroblaszt BJ-1 (ATCC(8) CRL-2522TM) és az epiteliális emlő MCF-12F (ATCC CRL-10782TM) sejtvonalakat is tesztelték összehasonlítás céljából. A sejtvonalakat a Dulbecco módosított Eagle közegében (DMEM/magas glükóz, HyCloneTM, USA) termesztették, kiegészítve 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS, Gibco, Brazília), 100 U/ml penicillinnel, 100 ug/ml sztreptomicinnel és 25 ng/ml amfotericin B-vel (Sigma, Oakville, ON, Kanada), és 37°C-on, 5%CO-val, párásított inkubátorban tenyésztettük. A táptalajt minden második nap friss közeggel helyettesítették. Amikor a sejtek elérték a 70%-os összefolyást, a kanadai 0,25%-os Tripszin-EDTA(1X) Gibco segítségével leváltuk őket, és egy új tenyészlombikba vittük őket. A második átjutás után a sejteket tripszinizáltuk és egy 96 lyukú lemezbe csomagoltuk 2×10* sejt/lyuk koncentrációban. 24 órás inkubálás után a közeget dekantáltuk, és a sejteket kétszer megmostuk PBS-sel, majd 200 μl táptalajjal kezeltük, amely különböző koncentrációjú fehérjemintákat tartalmazott (1, 5,10 és 20ug/ml). A doxorubicin HCl(4 ug/ml)-t pozitív kontrollként, míg a nem szubszubkuláris közeggel kezelt sejteket negatív kontrollként vettük fel. A lemezeket 37 °C-on 24 órán át inkubáltuk, és arákellenesa minták aktivitását semleges vörösfelvételi vizsgálattal határoztuk meg Repetto et al. szerint [54]. Röviden, az inkubációs periódus után a táptalajt 150 ml semleges vörös festékkel (100 mg/ml) helyettesítettük szérummentes táptalajban oldva, és a sejteket 37°C-on 3 órán át inkubáltuk. Ezután a sejteket PBS-sel öblítettük, és 150 μl elúciós közeget (EtOH/AcCOOH,50∶1) adtunk hozzá, majd 10 percig gyengéd rázással biztosítottuk a teljes feloldódás érdekében. Az abszorbanciát 540 nm-en mértük mikrotiterlemez-leolvasóval (BioTek,96 Well Plates, ELX808, USA).

ahol Ac a kontroll abszorbanciája és As a minta abszorbanciája. A citotoxicitásként (%), valamint a sejtek 50%-át elpusztító koncentrációt (IC50) minden egyes mintára kiszámítottuk.

3.13.2.A p53, Bax, Kaszpáz-3 és BCl-2 fehérjeszint meghatározása

A kulcsfontosságú apoptózis fehérje markerek sejtszintjét 24 órás kezelés után határoztuk meg az MP és MPMC ICso-jával végzett kezelés után. Röviden, a Hep G-2, MCF-7, Bj-1 és MCF-12F sejteket 5× 10* sejt / kút 6 lyukú lemezeken vetettük be. A mintákkal 37 °C-on végzett 24 órás inkubálás után a sejteket összegyűjtöttük és lüktettük, majd 10 000 fordulat / perc sebességgel 4°C-on 20 percig centrifugáltuk. A fehérjekoncentrációt Bradford-vizsgálattal számszerűsítettük a felülúszóban [55]. A kaszpáz-3 aktivitást kolorimetriás vizsgálati készlettel (Abcam, ab39401) elemeztük a gyártó utasításai szerint [56]. Röviden, 10 mg fehérjét adtunk 50 ml kaszpáz szubsztráthoz, és a végső térfogatot 200 μL-re állítottuk a 37 °C-os reakciópuffer segítségével, és az elegyet sötétben 1 órán át inkubáltuk, majd 405 nm-en mértük a Kaszpáz-3 koncentrációt.

A p53 pro-apoptotikus marker, a kapcsolódó X(Bax) és a B-sejtes limfóma-2(Bcl-2) anti-apoptotikus marker szintjét sejt liázban határoztuk meg enzimhez kötött immunoszorbens vizsgálattal Simple Step ELISA a gyártó utasításainak megfelelően (ab207225, ab119506 és ab199080; Abcam, USA), illetve [57,58].

3.13.3.Az oxidatív stresszvédelem által kiváltott DNS-károsodás

A DNS-károsodási vizsgálatot a Leba et al. [59] által korábban leírt módon, enyhe módosítással végeztük. Röviden, 3 μL ribonukleáz inhibitor plazmid RNH1(NM_203387)Az emberi címkézett ORF klón 10 μg/μL-t összekevertük Fenton reagensével (5 mM H2O2 és 0,3 mM FeSO4 és 0,6 mM EDTA), és a végső térfogatot foszfátpuffer (H2POA, 8,3 mM, pH 7,4) 25 μL-re állítottuk. Ezután az oldatot 20 percig inkubáltuk 37°C-on. Az MP és az MPMC antioxidáns védelmi képességének értékeléséhez a Fenton reagense által okozott DNS-károsodással szemben 5 μg/ml MP/NabM, MP/IHM és MP-t adtunk hozzá az inkubálás előtt. DNS-védelemként RNH1 plazmid DNS-t (3 μL, 10 μg/μL) használtunk.

3.13.4.PCR-alapú genomi DNS-károsodási vizsgálat

A Homo sapiens metilenetrahidrofolát-reduktáz (MTHFR) gént a korábban egészséges vérmintákból kivont vér genomikából származó PCR-rel erősítettük fel egy standard DNS extrakciós készlet segítségével [60]. A DNS-t 10 percig inkubáltuk Fenton MP-vel vagy MPMC-vel kiegészített reagensével vagy anélkül. Egy 198 bp-s fragmenst erősítettünk előre5'-TGAGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' és fordított 5'-AGGACGGTGGGGGTG-3'primerekkel. A kezelt DNS 50ng-jének felhasználásával PCR-erősítést végeztünk a következő termokikler után (94 °C 5 percig, majd 25ciklusos denaturálást, a 30-asokat 94 °C-on; lágyítást, 30-at 60 °C-on; és 30 másodpercet 72 °C-on) követően 25 cikluson keresztül és 1 utolsó hosszabbítási ciklust 72 °C-on 5 percig. A PCR reakciómintákat agaróz gél elektroforézisére alkalmaztuk (2%).

3.13.5. Génexpressziós profilalkotás RT-qPCR-rel

A kulcsfontosságú pro- és anti-apoptotikus marker gének génexpressziójának elemzését HepG-2, MCF-7, Bj-1 és MCF-12F sejtekkel végeztük, amelyek IC50-nek vannak kitéve (3. táblázat) 72 órán keresztül. Röviden, a teljes RNS-t a Total RNS Purification Kit (QIAGEN., Thorold, ON, Kanada) segítségével extraháltuk a gyártó utasításai szerint. cDNS

a szintézist Aboul-Sound et al. [61] által korábban leírtak szerint hajtották végre. Az amplifikációs programokat és a PCR amplikon specificitását egy Rotor-Gene O 5-Plex HRM termikus ciklus (Qiagen, Németország) használatával végeztük el és értékeltük Quanti-Tect SYBR-Green PCR Kittel (Qiagen, Németország), amint azt korábban a szabványos protokollok szerint dokumentálták [61]. A következő alapozókat használtuk: Hs_P53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); B-sejtes limfóma 2 Hs_BCL2_1_SG QuantiTect primer vizsgálat (QT00025011); Bcl-2-szerű fehérje Hs_BAX_1_SG QuantiTect primer vizsgálat (QT00031192); és a 18S rDNS házőrző (HK) gén Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay(QT00199367). A PCR termikus ciklusos programot és a génexpressziós analízist a 18S génhez viszonyított redőváltozás meghatározására lényegében a korábban jelentett módon végezték el [61].

3.14.Statisztikai elemzés

A kapott eredményeket ± szórás átlagában fejeztük ki. A statisztikákat az SPSSsoftware 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, USA) segítségével érték el. Duncan több tartományú tesztjét használtuk az összes minta közötti jelentős különbségek meghatározására, és a különbségeket szignifikánsnak tekintették p-nél<>

4. Következtetések

Összefoglalva, ez a tanulmány kimutatta, hogy a tejfehérje keverésepoliszacharidokaz oldat differenciálódása révén a pH-érték megfelelő komplexizációs technika. Az így kapott tejfehérje-nyálka komplexek (MPMC) lényegesen magasabb fenolos ésflavonoidoktartalom, mint a tejfehérje (MP). A DSC eredményei azt mutatták, hogy az MP poliszacharidokkal való komplexizációja jelentősen növelte a hőstabilitást a denaturációs hőmérséklet eltolódásával. Ftir elemzéseket végeztünk a funkcionális csoportok azonosítására, és megvizsgáltuk az előkészített komplexek áramlási viselkedését. A tejfehérje WSI-jét és WAI-ját a NabM-mel vagy az IHM-mel való komplexáció növelte. A TEM-et az előkészített komplexek mikrostruktúrájának megjelenítésére használták. Másrészt az izobgol héj nyálkékkal (HM) vagy Nabeq mucilage-szal (NabM) kapott tejfehérje-komplexek várhatóan antioxidáns és rákellenes hatásban felülmúlják az őshonos tejfehérjéket. Összefoglalva, az MPMC egyedülálló rákellenes tulajdonságokat mutatott ki az emlőrák és a máj karcinóma sejtvonalak (MCF7 és HEPG2) modellje ellen, amint azt egy semleges vörös felvételi vizsgálat is bizonyítja.

Az MPMC mindkettőt javítottaAntioxidánsés a proliferációellenes tevékenység. A kaszpázok kulcsfontosságú szabályozó fehérjék, amelyek részt vesznek az apoptózis indukciójában. A kaszpáz 3 fehérje és az mRNS transzkriptumok upregulációja (9A, B ábra) szabályozza az apoptózis útján lévő egyéb fehérjéket, amelyet a mitokondriális membrán összeomlása jellemez Bax által indukált citokróm c felszabadulással és a kaszpáz 9 aktiválásávallea kaszpáz 3 későbbi bevonásához vezet. A Casp3, p53 és Bax up-szabályozása, valamint a Bcl-2 expresszió redukciója kimutatta, hogy az MPMCinduced apoptosis indukció, ahol a p53 upregulációja stimulálja a Bax expresszióját, ami viszont citokróm c felszabadulást indukál, majd kaszpáz-9 és -3 aktivációt. Sőt, a Bcl-2-ről ismert, hogy gátolja a citokróm c felszabadulását. Vizsgálatunkban kimutatták, hogy az MPMC által indukált Bcl-2 leszabályozás elősegíti az ellenszenv nélküli Bax-indukált citokróm c felszabadulást és az azt követő apoptózist.

A fehérje-poliszacharid komplexek rákellenes hatása további felvilágosítást nyújt ezeknek a komplexeknek az alkalmazhatóságáról, amelyeket megfizethető és hatékony rákterápiák kifejlesztésében kell alkalmazni, minimális mellékhatásokkal.