A Bu-Shen-Huo-Xue kivonat neuroprotektív hatása a magas glükóz által kiváltott apoptózis ellen PC12 sejtekben

További információért:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1 Hagyományos és nyugati orvoslás integrációs kutatóstúdiója, Első Kórház, Pekingi Egyetem, Peking, Kína.

2 Természetes és biomimetikus gyógyszerek állami kulcslaboratóriuma, Gyógyszertudományi Iskola, Pekingi Egyetem, Peking, Kína.

Kiemelések

A magas glükóz (HG) által kiváltott neurotoxicitás szerepet játszik a patológiábancukorbetegencephalopathia (DE). Tanulmányunkban a Bu-Shen-Huo-Xue kivonat (BSHX), egy poliherbális formula bemutatjaneuroprotektívA HG-indukált PC12 sejtekre gyakorolt ​​​​aktivitás és a lehetséges mechanizmusok összefüggésbe hozhatók a reaktív oxigénfajták (ROS) képződésének elnyomásával, valamint a mitokondriumok által közvetített kaszpáz és a JNK/p38 MAPK jelátviteli útvonalakkal. Ez a tanulmány ígéretes szert kínál a DE klinikai alkalmazásokban történő kezelésére.

Kattintson a cistanche kivonat előnyeihez és a Cistanche a veséhez

Cistancheegy jól ismert tonizáló gyógynövény, amely táplálja és védi avese. A hagyományos kínai orvoslás elméletébenCistancheszámára a legjobb gyógynövényvese.Cistancheechinakozidban, akteozidban és flavonoidokban gazdag.Ezek a hatékony összetevőkCistanchecsökkenthetivesesejt apoptózis és növekedésvesesejtburjánzás. Ezért,Cistancheegytermészetes vese-kiegészítő.

Absztrakt

Célkitűzés: A Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) kivonat, egy poliherbális formula neuroprotektív hatásának vizsgálata a magas glükóz (HG) által kiváltott neurotoxicitás ellen PC12 sejtekben. Módszerek: Sejt életképességi vizsgálat, laktát-dehidrogenáz (LDH) vizsgálat, reaktív oxigénfajták (ROS) kimutatása, Hoechst 33258, akridinnarancs (AO)/etidium-bromid (EB) kettős festés és mitokondriális membránpotenciál (MMP) vizsgálat történt. Ezen kívül Bax, Bcl-2, kaszpáz-3, hasított kaszpáz-3, PARP, hasított PARP, citokróm c és mitogén aktivált protein kinázok (MAPK-k) is kimutathatók Western blot segítségével. Eredmények: A BSHX kivonat koncentrációfüggő módon növelte a sejtek életképességét és csökkentette az LDH szivárgást HG-indukált PC12 sejtekben. Ezenkívül a BSHX kivonat csökkentette az intracelluláris ROS szintjét, növelte a mitokondriális membránpotenciált, szabályozta a Bax és a Bcl-2 expresszióját, és gátolta a citokróm c felszabadulását a mitokondriumokból. Ezenkívül a BSHX-kivonat gyengítette a kaszpáz-3 és a PARP aktivációját, valamint gátolta a c-Jun N-terminális kináz (JNK) és a p38 MAPK-k foszforilációját. Következtetés: A BSHX kivonat jelentős neuroprotektív hatást fejtett ki a HG által kiváltott apoptózisra PC12 sejtekben. Ez a hatás összefüggésbe hozható a ROS-képződés, valamint a mitokondriumok által közvetített kaszpáz és a JNK/p38 MAPK jelátviteli útvonalak elnyomásával.

Kulcsszavak:diabéteszes encephalopathia, hagyományos kínai orvoslás, Bu-Shen-Huo-Xue kivonat,neuroprotektív, magas glükóz

Rövidítés: AO: akridinnarancs; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Diabetikus encephalopathia; DM: Diabetes mellitus; DMSO: dimetil-szulfoxid; EB: etidium-bromid; ERK: Extracellulárisan szabályozott protein kinázok; HG: Magas glükóz; JNK: c-Jun N-terminális kináz; LDH: laktát-dehidrogenáz; MAPK-k: Mitogén által aktivált protein kinázok; MWP: Wu-Zi-Yan-Zong vényköteles; MTT: 3-[4, 5-Dimetil-tiazol-2-il] 2, 5-difenil-tetrazólium-bromid; PBS: foszfátpuffer sóoldat; PBST: foszfáttal pufferolt sóoldat, 0,1 százalék Tween 20; ROS: Reactive Oxygen Species; T2DM: 2-es típusú diabetes mellitus; TCM: Hagyományos kínai orvoslás

Háttér

Az elmúlt években a diabéteszes encephalopathia (DE), a cukorbetegség (DM) szövődménye, amely a központi idegrendszerben (CNS) fordul elő, széles körű figyelmet kapott. A DE számos kockázati tényezővel hozható összefüggésbe, például a cukorbetegség korával, időtartamával és glikémiás kontrolljával [1, 2]. A DE klinikai megnyilvánulásai az agy morfológiai és fiziológiai elváltozásai és az ebből eredő kognitív diszfunkció. A hiperglikémia, az oxidatív stressz és a krónikus gyulladás a DE fontos patogén okai lehetnek [3]. Bár egyre több kísérlet mutatta ki, hogy a hosszú távú, tartós hiperglikémia felgyorsíthatja az agy öregedését, a DE pontos patogenezise még nem tisztázott.

Az apoptózis egy programozott sejthalál, amelyet gének szabályoznak a mikrokörnyezet stabilitásának fenntartása érdekében. Az apoptózisban részt vevő fehérjék közé tartozik a Bcl{0}} család, a kaszpázok, a p53 stb. A Bcl-2 család két kategóriába sorolható, az egyik a sejthalált elősegíti, mint például a Bax, a másik pedig ellenáll az apoptózisnak. mint például a Bcl-2. Szabályozhatják az apoptózist a kaszpáz jelátviteli útvonalon keresztül, amely a kaszpáz irreverzibilis véges hidrolízis szubsztrátjának kaszkád amplifikációs reakciója [4-6]. Ezenkívül a vizsgálatok kimutatták, hogy a magas glükóz (HG) által kiváltott apoptózis mitokondriális diszfunkcióval, DNS-károsodással és a reaktív oxigénfajták (ROS) túlzott termelésével jár [7]. Egy cukorbeteg egereken végzett vizsgálat kimutatta, hogy az adenozin 5'-monofoszfát (AMP) által aktivált protein kináz (AMPK), egy intracelluláris energia- és stresszreceptor, képes gátolni a ROS által közvetített apoptózist. Ezenkívül egyre több bizonyíték igazolja, hogy a mitogén aktivált protein kinázok (MAPK-k) gátlása előnyös lehet a neuronális apoptózis gátlásában. Egy másik jelentés kimutatta, hogy a c-Jun N-terminális kináz (JNK), az Extracelluláris Szabályozott Protein Kinázok (ERK), a p38 MAPK jelátviteli útvonalak potenciálisan szabályozhatják a neuronális apoptózist [8,9].

A hagyományos kínai orvoslás elmélete alapjánveseAz esszencia hiány és a vérpangás a DE alapvető patogenezise. Ezért a táplálkozás stratégiájaveseés az aktiváló vért általában használják a DE klinikai alkalmazásaiban. Korábbi tanulmányok megerősítették, hogy a módosított Wu-Zi-Yan-Zong recept (MWP), egy olyan recept, amelynek célja a táplálás.vese, javíthatja a kognitív károsodást és megvédheti a neuronokat az A toxicitás csökkentésével [10, 11]. A Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) recept, amelyben piócát adnak hozzá az MWP alapján, kifejezetten úgy lett kialakítva, hogytáplálveseés aktiválja a vért. A közelmúltban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a BSHX felírása javíthatja a DM-es betegek memóriaromlási szindrómáját, ami erőteljes neuroprotektív tulajdonságokra utal [12]. A BSHX részletes farmakológiai mechanizmusa azonban továbbra is tisztázatlan. Ebben a tanulmányban a BSHX kivonat HG-indukált PC12 sejtekre gyakorolt ​​​​védő hatásának megfigyelésére és a lehetséges molekuláris mechanizmusok feltárására törekszünk.

Mód

Anyagok és reagensek

Az összes gyógynövényt a Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd.-től (Peking, Kína) vásároltuk, és Dr. PF Tu, farmakonológus hitelesítette a Chinese Pharmacopoeia szerint (The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010). A 3- [4, 5-dimetil-tiazol-2-il] 2, 5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) a Sigma Chemical Co.-tól származott (Saint Louis, MO, USA). A laktát-dehidrogenáz (LDH) vizsgálati készletet a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-tól vásároltuk. (Nanjing, Jiangsu, Kína). Az akridinnarancs (AO)/etidium-bromid (EB) kettős festőkészletet és a Hoechst 33258-at a Solar Co., Ltd.-től (Peking, Kína) szereztük be. A JC-1, 2, 7-diklórfluoreszcein-diacetátot (DCFH-DA) tartalmazó mitokondriális membránpotenciál vizsgálati készletet a Beyotime Institute of Biotechnology-tól (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A kaszpáz-3, hasított kaszpáz-3, PARP, hasított PARP, citokróm C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p elsődleges antitestei A -JNK-t és -tubulint a Cell signaling Technology-tól (Boston, MA, USA) szereztük be.

BSHX kivonat készítése

A BSHX hét gyógyászati ​​komponensből áll (1. táblázat). BSHX kivonat készítéséhez Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) és Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) 8:8:4:1:2:1:8 arányban összekevertük, és 30 percre 10-szeres térfogatú (v/w) desztillált vízbe merítettük. , majd 1 órán át forraljuk, majd ismét 1 órán át forraljuk összesen 5-szörös térfogatú (v/w) desztillált vízben. A felülúszókat egyesítjük és liofilizálással szárítjuk. A végső szárított kivonat a nyers gyógynövények tömegének 25%-a volt, és egy utalványmintát a Pekingi Egyetem Egészségtudományi Központjának Modern Kutatóközpontjában helyeztek el, Pekingben, Kínában.

Sejttenyésztés

A patkány feokromocitóma sejtvonalakat (PC12 sejtek) a Peking Union Medical College Cell Banktól (Peking, Kína) szereztük be, és Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) táptalajban (Macgene, Peking, Kína) 10 százalékos szarvasmarha-magzatszérummal (Biowest, Franciaország) egészítettük ki. ) és 1% Penicillin-Streptomycin (100×, Macgene, Peking, Kína) párásított inkubátorban, amely 95% levegőt és 5% CO2-t tartalmaz 37 °C-on.

Mintakezelés

Az előzetes tesztben a PC12 sejteket csak BSHX kivonattal (20, 50, 100 mg/l) kezeltük 48 órán keresztül a citotoxicitás értékelésére. A BSHX kivonat neuroprotektív hatásának elemzéséhez a magas glükóz (HG) által kiváltott neurotoxicitás ellen a PC12 sejteket BSHX kivonattal (20, 50, 100 mg/l) és HG-vel (75 mM) együtt kezeltük 48 órán keresztül, majd MTT vizsgálatot végeztünk. a sejtek életképességéhez. Az összes többi vizsgálatot azonos körülmények között végeztük, 20-100 mg/l BSHX-kivonat koncentráció tartományban.

Sejtéletképességi vizsgálat

A PC12 sejteket 96-lyuklemezekre oltottuk 3,5 × 103 sejt/lyuk sűrűséggel. 48 órás BSHX-kivonattal (HG-vel vagy anélkül) végzett inkubálás után a felülúszót eltávolítottuk, és MTT-oldatot (0,5 mg/ml) adtunk hozzá. 37 °C-on 4 órás inkubálás után az MTT-oldatot eltávolítottuk, és a sejteket dimetil-szulfoxidban (DMSO) feloldottuk 5 perces rázatás céljából. Az optikai sűrűséget (OD) 570 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval. A sejtek életképessége (százalék)=[OD (kezelés) – OD (vak)]/ [OD (kezeletlen kontroll) – OD (vak)] × 100 százalék .

LDH vizsgálat

A PC12 sejteket tenyésztettük és stimuláltuk HG- és BSHX-kivonatkezelésre a korábban leírtak szerint. Ezután a sejtekből felszabaduló LDH-t egy kereskedelmi forgalomban lévő LDH kit segítségével detektáltuk a gyártó utasításai szerint. Az abszorbanciát 450 nm-en mértük. LDH (U/L)=[OD (kezelés) – OD (üres)] / [OD (standard) – OD (üres)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Hoechst 33258 festés és AO/EB festés

A Hoechst 33258 festéshez a sejteket 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk 30 percig. Ezután a sejteket foszfátpuffer sóoldattal (PBS) háromszor mostuk, és Hoechst 33258 munkaoldattal (1 ug/ml) inkubáltuk sötétben 30 percig szobahőmérsékleten. A képeket fluoreszcens mikroszkóppal (IX73, Olympus, Japán) rögzítettük 352 nm/emissziós hullámhossz 461 nm mellett. Az AO/EB festéshez távolítsa el a táptalajt a 96-lyukú lemezekről, és adjon hozzá AO/EB keveréket (100 ug/ml AO és 100 ug/ml EB keverve) 5 percig sötétben, szobahőmérsékleten. Ezután a sejteket PBS-sel háromszor mostuk. A sejteket fluoreszcens mikroszkóppal tettük láthatóvá 490 nm/emissziós hullámhossz 530 nm gerjesztési hullámhosszon AO festésnél és 520 nm/emissziós hullámhossz 590 nm gerjesztési hullámhosszon EB festésnél.

Intracelluláris ROS kimutatás

Az intracelluláris ROS kimutatáshoz a PC12 sejteket 6-lyuklemezekre oltottuk 5 × 105 sűrűségben, és 24 órán át HG- és BSHX-kivonatkezelésnek vetettük alá. 24 órás inkubáció után a PC12 sejteket szérummentes Dulbecco módosított Eagle táptalajjal mostuk háromszor, és 10 μΜ 2', 7'-diklorofluoreszcein-diacetáthoz (DCF-DA) adtuk, amely fluoreszcens 2', 7'-diklorofluoreszcenssé oxidálódik. (DCF) hidroperoxiddal, 37 °C-on 30 percig, sötétben. Ezután a sejteket háromszor mostuk hideg PBS-sel, és újraszuszpendáltuk PBS-ben. A ROS intracelluláris szintjét az átlagos fluoreszcencia intenzitás mérésével, áramlási citometriával (BD FACSCaliburTM, USA) határoztuk meg. A gerjesztési/emissziós hullámhossz 488/525 nm volt. Mintaként legalább 10,{23}} eseményt számolt a rendszer. Az értékeket a kontrollérték százalékára normalizált átlagos abszorbanciaként fejeztük ki.

Mitokondriális membrán potenciál vizsgálat

A mitokondriális depolarizációt egy kereskedelemben kapható JC-1 vizsgálati készlettel értékelték. HG és BSHX kivonattal történő kezelés után a sejteket JC-1 munkaoldattal (1 ×) 37 fokon, 15 percig sötétben inkubáltuk. Ezután távolítsa el a felülúszót, és mossa meg a sejteket kétszer JC-1 pufferoldattal (1 ×). A sejteket fluoreszcens mikroszkóppal vizualizáltuk 460 nm/emissziós hullámhosszon 530 nm gerjesztési hullámhosszon a JC-1 monomer esetében (depolarizált mitokondriummal rendelkező sejtekben), és 520 nm/emissziós hullámhosszon 590{10}} monomer esetén. }} polimer (jelen van a polarizált mitokondriumokban). A zöld (monomer) fluoreszcenciával rendelkező sejteket depolarizált mitokondriumnak tekintették; a vörös (polimer) fluoreszcenciával rendelkező sejtek normális mitokondriumokkal rendelkeznek.

Western blot analízis

A PC12 sejteket összegyűjtöttük és hideg RIPA pufferben lizáltuk 1x koktélproteáz inhibitorral. A felülúszót nagy sebességű centrifugálással gyűjtöttük össze 12, 000 fordulat/perc mellett 10 percig 4 fokon. A fehérjekoncentrációt Bradford-vizsgálattal határoztuk meg. A citokróm c elemzéshez a citoszolban és mitokondriumban dúsított frakciókat Mitochondria Isolation Kit-tel (Pierce, Rockford, USA) izoláltuk. Más fehérjék esetében az összes sejtlizátumot SDS-PAGE-val választottuk el (10% -15%), és polivinilidén-fluorid (PVDF) membránokra vitték át. A polivinilidén-fluorid membránokat ezután 5% zsírmentes tejjel blokkoltuk, és a jelzett elsődleges antitestekkel inkubáltuk 4 fokon egy éjszakán át. A membránokat PBST-vel (foszfáttal pufferolt sóoldat, 0,1% Tween 20) háromszor mostuk, és másodlagos antitestekkel inkubáltuk szobahőmérsékleten 2 órán át. Ezután a membránokat további háromszor mostuk PBST-vel, és fokozott kemilumineszcens szubsztrát segítségével tettük láthatóvá, és a Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, USA) segítségével szkenneltük.

Statisztikai analízis

Valamennyi érték átlag ± standard deviáció (SD) formában van kifejezve. Az átlagértékek közötti különbségek szignifikanciáját egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) határoztuk meg a Statistical Package for Social Sciences (SPSS 16.0 szoftver) segítségével. P < 0,05="" a="" kontrollcsoporthoz="" képest="" statisztikailag="" szignifikánsnak="">

Eredmények

A BSHX kivonat megvédi a PC12 sejteket a HG által kiváltott sejtkárosodástól

Annak vizsgálatára, hogy a BSHX-kivonat megvédheti-e a PC12 sejteket a HG-sértéstől, PC12-sejteket kezeltünk a BSHX-kivonat különböző koncentrációival (20, 50 és 100 mg/L) 48 órán át HG (75 mM) körülmények között. A sejtek életképességének MTT vizsgálattal történő értékelése azt mutatta, hogy a HG inzultus szignifikánsan csökkentette a PC12 sejtek életképességét (a sejtek életképessége megközelítőleg 56,9 ± 6,7 százalék volt), és hogy a BSHX kivonatkezelés koncentrációfüggő módon jelentősen megakadályozta a sejthalált. A sejtek életképessége 87,8 ± 9,2 százalékra nőtt, amikor a sejteket BSHX-kivonattal (100 mg/l) együtt kezeltük (1A. ábra). A laktát-dehidrogenáz (LDH) felszabadul a sérült sejtekből, ezért a sejttoxicitás indikátoraként is használható. Az MTT assay eredményeivel összhangban azt találtuk, hogy a HG inzultus szignifikánsan növelte a PC12 sejtekből származó LDH felszabadulását, és hogy a BSHX kivonatkezelés koncentrációfüggő módon megakadályozta az LDH felszabadulását (1B. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a BSHX kivonat növeli a sejtek életképességét HG-indukált PC12 sejtekben.

A BSHX kivonat a kaszpáz-9/3-függő útvonalon keresztül gátolja a PC12 sejt apoptózisát

A BSHX kivonat sejtapoptózisra gyakorolt ​​hatásának meghatározásához a Hoechst 33258 DNS-festéket használtuk az apoptózis érzékeny tesztjeként. A Hoechst 33258-cal festett normál sejtek magjai egységes kék fluoreszcenciát mutattak, míg a nukleáris kromatinfelhő-piknózist vizsgáló apoptotikus sejtek hiperkromatikus és sűrű fluoreszcens részecskéket mutattak. Az apoptózis százalékos arányát az apoptotikus sejtek száma és az összes sejtek száma alapján számítottuk ki. Adataink azt mutatták, hogy a HG (75 mM) inzultáció drámaian megnövelte az apoptotikus sejtek arányát (51,7 ± 4,3 százalékkal), és a BSHX kivonattal végzett kezelés szignifikánsan védett a HG által kiváltott apoptózissal szemben PC12 sejtekben (2A. ábra). Ezeket az eredményeket az AO/EB kettős festés elemzése is alátámasztotta. Az AO mind a normál, mind az apoptotikus sejtekbe belép, és zöld fluoreszcenciát bocsát ki, míg az EB csak az apoptotikus sejtekbe jut be és vörös fluoreszcenciát bocsát ki [13]. Az AO/EB vizsgálat azt mutatta, hogy az apoptotikus sejtek százalékos aránya szignifikánsan megnőtt a HG (75 mM) inzultus után (47,8,7 ± 2,6 százalék), és csökkent a BSHX kivonattal végzett kezelés hatására PC12 sejtekben (2B ábra), ami arra utal, hogy a BSHX kivonat hatékonyan képes gátolják a PC12 sejtek HG által kiváltott apoptózisát.

Ezt követően megvizsgáltuk a BSHX kivonat hatását a kaszpáz-3/PARP útvonalra, amely a mitokondriumokkal kapcsolatos apoptózis fontos útvonala [14]. Western blot kimutatta, hogy a HG (75 mM) inzultáció szignifikánsan növelte a kaszpáz-3 és a PARP aktív formáinak expresszióját, valamint csökkentette a teljes kaszpáz-3 és PARP expresszióját a PC12 sejtekben, és ez a hatás jelentősen megfordult. BSHX kivonat kezeléssel (2C ábra), ami arra utal, hogy a BSHX kivonat hatékonyan védte a PC12 sejteket az apoptózis ellen a mitokondriális függő kaszpáz-3/PARP útvonal szabályozásán keresztül.

A BSHX kivonat gátolja az intracelluláris ROS termelést a HG-indukált PC12 sejtekben

Mivel a HG fokozhatja az intracelluláris ROS képződését [15], teszteltük az intracelluláris ROS szintjét annak meghatározására, hogy a BSHX kivonat gátolja-e a ROS képződését. Az átlagos fluoreszcencia intenzitás háromszorosára nőtt azokban a PC12 sejtekben, amelyeket 48 órán keresztül 75 mM HG-nek voltak kitéve, összehasonlítva a kontrollal. Ezzel szemben a BSHX kivonattal történő együttes kezelés jelentősen csökkentette az átlagos fluoreszcencia intenzitást körülbelül 0.76-, 0.{{10}} és 0.{101} {12}}szerese a modellcsoportnak, ami azt jelzi, hogy a BSHX kivonat gátolhatja a HG által indukált ROS termelődését (3A, B ábra).

A BSHX kivonat fenntartja a mitokondriális homeosztázist a HG-indukált PC12 sejtekben a Bax és Bcl-2 expresszió szabályozásával

A mitokondriális membránpotenciál a mitokondriális funkció fontos paramétere, amelyet a sejt egészségének indikátoraként használnak. A JC-1 egy lipofil, kationos festék, amely szelektíven bejuthat a mitokondriumokba, és a membránpotenciál növekedésével visszafordíthatóan megváltoztathatja a színét zöldről vörösre. Magas mitokondriális membránpotenciállal rendelkező egészséges sejtekben a JC-1 spontán komplexeket képez, amelyek J-aggregátumokként ismertek intenzív vörös fluoreszcenciával. Másrészt az alacsony mitokondriális membránpotenciálú apoptotikus sejtekben a JC-1 monomer formában marad, amely csak zöld fluoreszcenciát mutat [16, 17]. A zöld fluoreszcencia és a vörös fluoreszcencia aránya tehát a mitokondriális depolarizációt tükrözheti. Vizsgálatunkban a depolarizált mitokondriumokkal (zöld fluoreszcenciával) rendelkező sejtek száma szignifikánsan megnőtt 48 órás HG (75 mM) hatására, és ezt a növekedést a BSHX kivonatkezelés koncentrációfüggő módon megfordította (4A. ábra).

Ezt követően kimutattuk a citokróm c mitokondriális és citoplazmatikus eloszlását, amely kulcsszerepet játszik az aktivációs kaszpáz-függő apoptózis útvonalban. Azt találtuk, hogy a 48 órán át tartó HG (75 mM) sértés a citokróm c drámai transzlokációját indukálta a mitokondriumokból a citoplazmába, és ezt az áthelyezést a BSHX-kivonattal végzett kezelés jelentősen megakadályozta (4B. ábra), jelezve, hogy a BSHX-kivonat gátolhatja a citokróm-c felszabadulását. citokróm c a mitokondriumokból.

Ezenkívül a Bcl{0}} család fehérjéi a különféle apoptotikus útvonalak fontos szabályozói. A Bcl-2 gátolhatja a különböző citotoxikus faktorok által okozott sejtapoptózist, és gátolja a citokróm c mitokondriumokból a citoplazmába történő felszabadulását. Bax azonban, mint a Bcl-2 család tagja, egy apoptózist elősegítő faktor. Amikor apoptózist indukálnak, a Bax a citoplazmából a mitokondriumokba vándorol, és tönkreteszi a mitokondriális integritást [5, 18]. Vizsgálatunkban a Bcl-2 fehérjeszintjét csökkentette, a Baxot pedig felfelé szabályozta HG (75 mM) inzultus 48 órán keresztül, ezt a hatást koncentrációfüggően megfordította a BSHX kivonat (4C. ábra). Mindezek a fenti eredmények arra utalnak, hogy a BSHX kivonat megvédte a PC12 sejteket a HG által kiváltott mitokondriális depolarizációtól a Bax és a Bcl expressziójának szabályozásával-2.

A BSHX kivonat hatása a sejt apoptózisára JNK/p38 MAPK jelátviteli útvonalakon keresztül

Egyes tanulmányok kimutatták, hogy a megnövekedett ROS termelés összefüggésbe hozható a MAPK útvonalak aktivációjával, ami a sejt apoptózist váltja ki9 [19, 20]. Ezért megvizsgáltuk a BSHX kivonat hatását a mitogén aktivált protein kináz (MAPK) jelátviteli útvonalra, hogy meghatározzuk, vajon a BSHX kivonat képes-e gyengíteni a HG által kiváltott apoptózist. Amint az 5. ábrán látható, a 48 órás HG (75 mM) inzultáció növelte a c-Jun NH2-terminális kináz (JNK) és a p38 foszforilációját PC12 sejtekben, amelyeket a BSHX kivonat szignifikánsan gátolt olyan koncentrációban, függő módon. Hasonló eredményt azonban nem figyeltek meg az Extracelluláris Szabályozott Protein Kináz (ERK) MAPK esetében. Az eredmények arra utalnak, hogy a BSHX kivonat gátolhatja a HG-indukált sejt apoptózist a JNK/p38 MAPK jelátviteli útvonalakon keresztül.

Vita

A diabéteszes encephalopathia (DE) a 2-es típusú diabetes mellitus (T2DM) gyakori szövődménye. Kognitív károsodást okozhat az agyban, és világszerte fontos kockázati tényező a 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő betegek halálozásában és rokkantságában [3]. Ezért kritikus fontosságú a DE mechanizmusának, valamint megelőzési és kezelési stratégiáinak tanulmányozása.

Kínában a hagyományos kínai gyógyszereket (TCM) évek óta használják a DM kezelésére, és ezek gyógyító hatást mutatnak. Egyes klinikai tanulmányok azt sugallják, hogy a vesék táplálásán és az aktiváló vérstratégiákon alapuló TCM-ek csökkenthetik a vércukorszintet, elősegíthetik a keringést és javíthatják az agy kognitív diszfunkcióját. A BSHX recept ezen TCM-ek képviselője. Előzetes klinikai vizsgálatunk kimutatta, hogy a BSHX felírása hatékonyan javíthatja a vércukorszintet, a homociszteint (HCY) és a nagy érzékenységű C-reaktív fehérjét (hs-CPR) a szérumban, és javíthatja az enyhe kognitív károsodásban (MCI) szenvedő cukorbetegek kognitív funkcióit. [12]. A hatékonyságot és a farmakológiai mechanizmust azonban egyelőre nem igazolják bizonyítékok.

Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy a BSHX-kivonat mérsékelheti a HG által kiváltott sejtéletképesség-csökkenést, MTT-vel, LDH assay-vel mérve. A BSHX kivonat sejtéletképességre gyakorolt ​​védő hatásának további feltárása érdekében az apoptózist Hoechst 33258-cal és AO/EB festési analízissel vizsgáltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy a BSHX kivonat jelentősen csökkentheti a HG által kiváltott apoptózist. Az apoptózis markereként a kaszpáz-3 és a PARP szignifikánsan megemelkedett HG-kezelés után, de ezen pro-apoptotikus faktorok aktiválódását a BSHX kivonat koncentrációfüggő módon gátolta. A fenti eredmények azt mutatták, hogy a BSHX kivonat védő hatással volt a HG által kiváltott PC12 sejtkárosodásra.

A ROS a sejtek oxidatív foszforilációja során képződik, és termelésének fokozódása vagy az antioxidáns rendszerek károsodása oxidatív stresszhez vezethet a sejtekben [21]. Tanulmányok kimutatták, hogy a magas glükóz az intracelluláris ROS felhalmozódását és végül egy aktív apoptotikus jelátviteli útvonalat eredményezhet. A cukorbetegség szövődményeinek közös mechanizmusa pedig az oxidatív stressz [22, 23]. Eredményeink azt mutatták, hogy a magas glükózszint a ROS növekedéséhez vezethet a PC12 sejtekben, ami összhangban van a korábbi tanulmányokkal [24]. Feltételezik, hogy a magas glükóz sejtekre gyakorolt ​​toxicitása ROS-indukált apoptózissal érhető el. A mitokondriumok az intracelluláris ROS termelés fő helyei, és a ROS támadások fő célszervei is [25]. Patológiás körülmények között a ROS gyors növekedése mitokondriális diszfunkcióhoz, a mitokondriális membránpotenciál összeomlásához és végül sejtapoptózishoz vezethet [26]. Így észleltük a mitokondriumok integritását. Eredményeink azt mutatták, hogy a magas glükóz jelentősen csökkentette a mitokondriális membránpotenciált, növelte a Bax/Bcl-2 arányát, amely szabályozza a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusának (MPTP) átváltását, és elősegítette a citokróm c kiszivárgását, míg a BSHX kivonat visszafordítani ezeket a változásokat. Ezek arra utalnak, hogy a BSHX kivonat neuroprotektív hatása a HG-indukált PC12 sejtekkel szemben a mitokondriumok integritásának megőrzéséből fakadhat.

A MAPK jelátviteli út szintén fontos szerepet játszik a sejt apoptózisában. A JNK, az ERK és a p38 MAPK a MAPK család leginkább tanulmányozott tagjai. Fő hatásuk a specifikus helyeik foszforilálása, ezáltal szabályozva a sejt apoptózisát [8, 27, 28]. Ezenkívül a vizsgálatok kimutatták, hogy a túlzott ROS termelés kiválthatja a p38MAPK foszforilációját [29-31], és a ROS indukálhatja vagy közvetítheti a MAPK útvonalak aktiválódását [32]. Számos olyan sejtinger, amely párhuzamosan is indukálja a ROS termelését, több sejttípusban is aktiválhatja a MAPK útvonalakat [32, 33]. A MAPK ROS általi aktiválásának lehetséges mechanizmusai közé tartozhat a MAPK foszfatázok inaktiválása és lebontása, amelyek inaktív állapotban tartják az utat [19]. Másrészt annak megerősítésére, hogy a MAPK útvonalak aktiválódtak-e a ROS generálásával, a sejteket antioxidánsokkal (pl. NAC, ROS-fogó) előkezeltük, hogy megakadályozzuk a ROS felhalmozódását. Az eredmények pedig azt mutatták, hogy a MAPK aktiváció szinte gátolt volt a sejtstimuláció után [32, 33], ami azt jelzi, hogy a MAPK útvonalak ROS inaktivációja is szerepet játszik. Ezenkívül a vizsgálatok kimutatták, hogy ha a sejteket a specifikus JNK inhibitor SP600125-tel kezelték, a Cardiotoxin III által kiváltott apoptózis blokkolható [34]. Korábbi vizsgálatunk azt találta, hogy a módosított Wu-Zi-Yan-Zong recept (MWP) gátolhatja az ERK/p38 MAPK aktiválódását A-aktivált BV2 mikrogliában [10]. Ebben a vizsgálatban azonban azt találtuk, hogy a BSHX kivonat gátolhatja a JNK és a p38 MAPK foszforilációját, és nem értük el ugyanazt az eredményt a p-ERK-val. Úgy gondoljuk, hogy a piócák más szerepet játszanak a BSHX kivonatban. Az eredmények arra utalnak, hogy a BSHX-kivonat másik védőmechanizmusa a HG-indukált PC12-sejtek apoptózisával szemben a JNK/p38 MAPK jelátviteli útvonalak szabályozásán keresztül valósulhat meg.

Következtetés

A BSHX kivonat, egy poliherbális formula, neuroprotektív hatást fejt ki a PC12 sejteken a HG inzultus ellen. A BSHX kivonat hatékonyan gátolta a HG által kiváltott PC12 sejt apoptózist azáltal, hogy csökkentette az intracelluláris ROS képződést, megőrizte a mitokondriális membrán integritását, valamint blokkolta a kaszpáz-3 és a JNK/p38 MAPK jelátviteli útvonalakat (6. ábra). Eredményeink összességében azt sugallják, hogy a BSHX kivonat ígéretes szer a DE kezelésében a klinikai alkalmazásokban.

Szerzői hozzájárulások

A kísérletek ötlete és tervezése: Zeng KW, Wang XM. A kísérletet végrehajtotta: Zhao SY. Az adatok elemzése: Zhao SY, Zeng KW és Wang XM. Hozzájárult reagensek/anyagok/elemző eszközök: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW és Wang XM. Írta a patert: Zhao SY.

Hivatkozások

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS et al. A diabéteszes agy és a megismerés. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Agyi sérülés cukorbetegséggel: bizonyítékok, mechanizmusok és kezelési következmények. Expert Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F és mtsai. A "metabolikus memória" elmélete és a hiperglikémia korai kezelése a cukorbetegség szövődményeinek megelőzésében. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. A mitokondriális membránpotenciál (Δψm) in apoptosis; egy frissítés. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. A mitokondriális dinamika és az élet-halál események összekapcsolása a Bcl-2 család fehérjéin keresztül. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R és mtsai. Mitokondriumok és sejthalál. Mechanisztikai szempontok és módszertani kérdések. J 1999. febr., 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S és mtsai. 1,25-(OH)2D3 gátolja a magas glükóz által kiváltott apoptózist és a ROS termelést humán peritoneális mesothel sejtekben a MAPK/P38 útvonalon keresztül. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R., Jiang H., Schaefer E és munkatársai. Az idegi növekedési faktor előkezelés gyengíti az oxigén- és glükózmegvonás által kiváltott c-Jun amino-terminális kináz 1 és a stressz által aktivált p38 és p38 kinázok aktiválását, és neuroprotektív hatást biztosít a pheochromocytoma PC12 modellben. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J és munkatársai. A kaszpáz-3 és a p38 mitogén által aktivált protein kináz részvétele a kobalt-klorid által kiváltott apoptózisban PC12 sejtekben. J Neurosci Res 2002, 67: 837-843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF és társai. A módosított Wu-Zi-Yan-Zong recept neurogyulladásellenes hatásai amiloid-stimulált BV2-microgliában az NF-κB és ERK/p38 MAPK jelátviteli útvonalakon keresztül. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H és mtsai. A módosított Wu-Zi-Yan-Zong recept, egy hagyományos kínai poliherbális formula, elnyomja a lipopoliszacharidok által kiváltott ideggyulladásos folyamatokat patkány asztrocitáiban az NF-κB és a JNK/p38 MAPK jelátviteli útvonalakon keresztül. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, et al. A Bushen Huoxue recept hatása a 2-es típusú cukorbetegség enyhe kognitív károsodásának kezelésére. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Cikloheximid által kiváltott apoptózis elemzése humán leukocitákban: Fluoreszcens mikroszkópos vizsgálat annexin V/propidium-jodid és akridinnarancs/etidium-bromid alkalmazásával. Cell Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S et al. A kaszpázok összekapcsolják a sejthalál jelzését a szervezet homeosztázisával. Immunity 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Nitrogén-monoxid: kulcsfontosságú tényező az endothel progenitor sejtek diszfunkcionalitása mögött diabetes mellitus típusú cukorbetegségben-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M és mtsai. JC-1: Az alternatív gerjesztési hullámhosszok megkönnyítik a mitokondriális membránpotenciál-citometriát. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J és munkatársai. Mitokondriális membránpotenciálszondák és a proton gradiens: gyakorlati használati útmutató. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Hogyan indukálják a BCL-2 fehérjék a mitokondriális külső membrán permeabilizációját? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH és mtsai. Mitogén által aktivált protein kinázok és reaktív oxigénfajták: hogyan aktiválhatja a ROS a MAPK útvonalakat? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F és mtsai. A podofillotoxin aromás heterociklusos észterei MDR-ellenes aktivitást fejtenek ki humán leukémia K562/ADR sejtekben a ROS/MAPK jelátviteli útvonalon keresztül. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J et al. A glikogén-szintáz kináz-3 megcélzása az oxidatív stressz elleni terápiás előnyök érdekében Alzheimer-kórban: az Nrf2-ARE útvonal bevonása. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. Az oxidatív stressz szerepe a diabéteszes neuropátiában: szabadgyök-fajok generálása a glikációs reakcióban és antioxidáns enzimeket kódoló génpolimorfizmusok a diabéteszes neuropátiával szembeni genetikai érzékenységre az I-es típusú cukorbetegek populációjában. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, et al. Sejthalál, reaktív oxigénfajták (ROS) és diabéteszes szövődmények. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD és mtsai. A ginkgolid B gátolja az apoptózist magas glükózszinttel stimulált humán köldökvéna endothel sejtekben. Kínai Gyógyszerészeti Értesítő 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. A szuperoxid-diszmutáz káros szerepe a mitokondriális intermembrán térben. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Storey KB. Mitogén által aktivált protein kinázok: új jelátviteli útvonalak, amelyek a környezeti stresszre adott sejtválaszokban működnek. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X és mtsai. A MiR-125b onkogénként működik a glioblasztóma sejtekben, és gátolja a sejt apoptózisát a p53 és p38MAPK-független útvonalakon keresztül. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H és mtsai. A fejlett glikációs végtermékek reaktív oxigénfajták generálásával, valamint a JNK és p38 MAPK útvonalak aktiválásával indukálják a humán szaruhártya epitélsejtek apoptózisát. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH és mtsai. A ghrelin gátolja az apoptózist a hipotalamusz idegsejtjeiben oxigén-glükóz megvonás alatt. Endokrinológia 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. A Verrucarin A megváltoztatja a sejtciklust szabályozó fehérjéket és apoptózist indukál reaktív oxigénfajtáktól függő p38MAPK aktiváció révén az MCF-7 humán mellrák sejtvonalban. Tumor Biology 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L és mások. ROS által kiváltott oxidatív sérülés, amely részt vesz a gombás keratitis patogenezisében a p38 MAPK aktiválásán keresztül. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. A MAP kináz jelátviteli útvonalak reaktív oxigénfajták által kiváltott aktiválása. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redox signaling and the MAP kinase pathways. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. A Cardiotoxin III c-jun N-terminális kináz-függő apoptózist indukál HL-60 humán leukémia sejtekben. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.