Az NGF modulálja a koleszterin metabolizmust és serkenti az ApoE szekréciót a gliasejtekben, ami neurovédelmet biztosít az oxidatív stressz ellen 2. rész

2.6. Az U373 által NGF által közvetített ApoE szekréció megvédi az idegsejteket az oxidatív károsodástól

A felhalmozódó bizonyítékok rávilágítanak arra, hogy az ApoE növeli a neuronok ellenálló képességét az oxidatív inzultusokkal szemben, így megakadályozza az apoptózist és a neurodegenerációt [17,18,37]. Ebben az összefüggésben értékeltük, hogy az U373 sejtek NGF-indukálta ApoE szekréciója meg tudja-e védeni az N1E-115 neuronokat az oxidatív stressztől. A teljesen differenciált N1E-115 rotenonnal előkezelt, amely a mitokondriális I komplex gátlásával oxidatív stresszt vált ki.

Az apoptózis egy önpusztító folyamat, és ez egy fontos módja annak, hogy a sejtek bizonyos körülmények között programozott önpusztítással fenntartsák a szervezet homeosztázisát. Az apoptózis különböző szerepet játszik az élet különböző szakaszaiban.

A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy van bizonyos kapcsolat az apoptózis és a memória között. Már tudjuk, hogy a memória egy összetett idegi folyamat az agyban, amely több agyrégió közötti kapcsolatokat és koordinációt foglal magában. Az apoptózis szerepet játszhat ebben az idegi folyamatban.

Az apoptózis egyrészt stabilizálni tudja az idegsejtek hálózati struktúráját a felesleges neuronok és szinapszisok megtisztításával, finomítja a neuronok kapcsolatait, javítva ezzel a memória minőségét és hatékonyságát. Másrészt a túlzott apoptózis az agysejtek számának csökkenéséhez is vezethet, ami negatívan befolyásolhatja az emlékek tárolását és rögzítését.

Ezért, miközben fenntartjuk az apoptózis megfelelő szintjét, javíthatjuk a memóriát viselkedések és készségek sorozatán keresztül, mint például az olvasás, a tanulás, a gyakorlatok és a gondolkodásmódunk módosítása. Ezek a viselkedések és készségek elősegíthetik az agysejtek növekedését és összekapcsolódását, valamint javíthatják a memória minőségét és hatékonyságát az agyi neuronok közötti kapcsolatok és koordináció serkentésével.

Összefoglalva, az apoptózis és a memória közötti kapcsolat összetett. Csak a megfelelő apoptózis fenntartása mellett tudjuk stimulálni agyunkat és javítani a memóriánkat egy sor viselkedésen és készségen keresztül. Ebből a szempontból fejlesztenünk kell a memóriánkat. A Cistanche deserticola jelentősen segíthet javítani a memóriánkat, mert a Cistanche deserticola szabályozhatja a neurotranszmitterek egyensúlyát is, például növeli az acetilkolin és a növekedési faktorok szintjét. Ezek az anyagok fontosak a memória szempontjából. Nagyon fontos a tanulás és a tanulás szempontjából. Ezenkívül a húsból származó hús javíthatja a vér folyékonyságát és elősegítheti az oxigénszállítást, ami biztosítja, hogy az agy elegendő tápanyagot és energiát kapjon, ezáltal javítva az agy vitalitását és állóképességét.

Kattintson a know-kiegészítőkre a memória javítása érdekében

16 órás rotenon-expozíció után az N1E-115 neuronokat friss tápközegben (Ctrl), U373 sejtekből származó kondicionált tápközegben (U373-Ctrl), U373-ból NGF-fel előkezelt kondicionált tápközegben tenyésztettük 48 órán keresztül. (U373-NGF), vagy kondicionált táptalaj ApoE-csendesített U373-ból, amelyet 48 órán át NGF-fel kezeltek (U373-NGF ApoE siRNS). A rotenonos előkezelés erősen csökkentette a kontroll táptalajban tenyésztett N1E{16}} számát, ami azt jelzi, hogy ennek a peszticidnek a beadása súlyosan befolyásolja az N1E-115 túlélését.

A rotenon citotoxicitása szintén meghatározta az intenzív neurit visszahúzódást, amint azt a neuritok hossza is megfigyelte. A rotenonkezelés által kiváltott neuritkárosodás különösen nyilvánvaló volt a neuritot hordozó sejtek értékelése során, mivel a neuritokat tartalmazó N1E-115 száma 50%-ra csökkent. Hasonló eredményeket kaptunk, amikor N1E-115 sejteket U373-Ctrl kondicionált tápközegben tenyésztettek, ami arra utal, hogy a nem stimulált asztrocitákból származó felülúszó jelenléte nem elegendő ahhoz, hogy megvédje az idegsejteket a rotenon által közvetített toxicitástól. Az NGF-fel kezelt U373-ból származó kondicionált tápközeg n alkalmazása hatékonyan megakadályozta a neuronok halálát, valamint a neuritot hordozó sejtek számának és a neurithosszúság csökkenését, amelyet a rotenon beadása okozott (5. ábra).

Ennél is fontosabb, hogy az ApoE-csendesített U373 sejtekből származó kondicionált tápközeg teljesen elvesztette a d by U373-NGF kondicionált táptalaj által kiváltott jótékony hatásokat, ami azt jelzi, hogy a neuroprotekciót az NGF által közvetített ApoE felszabadulása vezérli a tápközegben. Nevezetesen, az NGF-fel kezelt U373-ból származó kondicionált tápközeg, amelyet kódolt siRNS-sel transzfektáltak, teljes mértékben megőrizte az U373-NGF kondicionált táptalaj által kifejtett védőhatást, ami azt bizonyítja, hogy az ApoE-csendes sejtekből származó kondicionált tápközegben megfigyelt neuroprotekciós veszteség hatékonyan függ az ApoE-től. leszabályozás (S3C ábra).

5. ábra: U373 kondicionált tápközeg hatása a neuronok oxidatív stresszére. Reprezentatív képek világos mezőben és az N1E neuronális morfológiájának kvantitatív értékelése-115. A sejteket előzőleg kezeltük (+) vagy nem (-) rotenonnal (0,1 µM) 16 órán át, majd friss DMEM-ben (Ctrl) tenyésztettük az U373 kontrollból (U{{) származó kondicionált tápközegben. 9}}Ctrl), NGF-fel előkezelt U373 (U373-NGF) és NGF-fel előkezelt U373 apoE-re (U373-NGF ApoE siRNS) 48 órán keresztül. n=5 különböző kísérlet. Az adatok átlag ± SD. A statisztikai analízist egyutas ANOVA-val, majd Tukey post hoc teszttel értékeltük. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

A kondicionált táptalajon kapott eredmények megerősítésére U373/N1E115 ko-kultúrákat végeztünk. Kezdetben az U373 sejteket 48 órán keresztül előkezeltük NGF-fel vagy nem. Továbbá a differenciált N1E-115 sejteket 16 órán keresztül rotenonnal előkezeltük vagy nem. Ezt követően az U373 táptalajt friss, 0,5% FBS-t tartalmazó táptalajra cseréltük, és az N1E-115-mal beoltott fedőlemezeket az U373 rétegre vittük át, hogy társtenyészeteket készítsünk (6A. ábra).

A rotenonkezelés által kiváltott oxidatív károsodás jelentősen befolyásolta a sejtek viabilineuritot hordozó sejtjeit és az U373-Ctrl asztrocitákkal együtt tenyésztett N1E-115 és N1E-115 neurit hosszát (6B. ábra). A kondicionált táptalajon végzett kísérletekkel összhangban az U373-NGF sejtekkel együtt tenyésztett N1E-115 sejteket megvédték az oxidatív károsodástól, míg az U373-ban az ApoE elnémítása megszüntette az NGF által fenntartott idegvédelmet.

6. ábra: NGF-fel kezelt U373 sejtek ApoE szekréciója neurovédelmet biztosít az oxidatív stressz ellen. (A) Az asztrocita-neuron társkultúrák reprezentatív sémája az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. A neurittartalmú sejteket, a neurit hosszát és a sejtszámot órákkal az együtttenyésztés létrehozása után értékeltük. (B) Reprezentatív képek világos mezőben és az N1E-115 sejtek neuronális morfológiájának kvantitatív értékelése, korábban rotenonnal (0,1 µM) 16 órán át kezelve (+) vagy nem (-).

Az N1E-115-t ezután friss DMEM-ben (Ctrl) tartottuk, vagy együtt tenyésztettük a kontroll U373-mal (U373-Ctrl), az NGF-fel előkezelt U373-mal (U373-NGF) és Az NGF-fel előkezelt U373 ApoE-re (U373-NGF ApoE siRNS) 48 órán keresztül elnémítva. n=5 különböző kísérlet. Az adatok átlag ± SD. A statisztikai elemzést egyutas ANOVA-val, majd Tukey post hoc teszttel végeztük. * p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

3. Megbeszélés

A neurotropin jelátviteli útvonalak egyensúlyhiánya, valamint az agy koleszterin-anyagcseréjének megváltozása erősen összefügg a neurológiai és neurodegeneratív betegségekkel, mint például a Rett-szindróma, a HD, az Alzheimer-kór (AD) és a Parkinson-kór (PD) [2,38,39] . Ebben az összefüggésben a neurotrofinok biológiai aktivitásával kapcsolatos alapkutatások kulcsfontosságúak a koleszterin anyagcserét és az agy fiziopatológiáját összekötő molekuláris mechanizmusok feltárásában. Az elmúlt néhány évben egy érdekes tanulmány beszámolt a BDNF szerepéről az asztrociták koleszterin metabolizmusának szabályozásában [38].

Ennek ellenére nem áll rendelkezésre információ az NGF feltételezett szerepéről az asztrocita koleszterin szabályozásában. Ezért ebben a munkában az NGF várható szerepére összpontosítottunk a koleszterin-anyagcsere szabályozásában, különös tekintettel az ApoE szekréciónak a neuronális differenciálódásra és túlélésre gyakorolt ​​hatására. Az U373, a humán asztrociták kísérleti modelljeként használt asztrocitóma sejtvonal megtartja azt a lehetőséget, hogy teljes mértékben reagáljon az NGF-re, mivel mind a TrkA, mind a p75NTR érezhető szintjét expresszálja.

A fő eredmények azt mutatták, hogy az NGF felszabályozza a koleszterin bioszintézisben (HMGCR), az intracelluláris kereskedelemben (NPC1) és a szekrécióban (ABCA1) részt vevő fő fehérjék szintjét. Ezeket az eseményeket az ApoE és a koleszterin lein egyidejű növekedése kíséri a táptalajban, ami arra utal, hogy az NGF növeli a koleszterin bioszintézisét és a gliasejtekből történő extrudálását. Beszámoltak arról, hogy az NGF az ApoE fehérje expresszióját indukálja a transzkripció fokozásával [40]. Azonban nem figyeltünk meg szignifikáns változást az intracelluláris ApoE expressziójában. Ez a látszólagos következetlenség azzal magyarázható, hogy az ApoE felhalmozódása nem értékelhető az NGF-fel kezelt UIn-ből származó fokozott kiáramlás miatt.
A molekuláris mechanizmusok jobb szétválasztása érdekében az U373-at LM11A-31-el kezeltük, és azt találtuk, hogy a p75NTR modulátor csak az NGF által közvetített HMGCR expresszió növekedését képes utánozni. A p75NTR szerepe a HMGCR-szintek modulálásában összhangban van más sejttípusokon szerzett korábbi adatokkal, amelyek azt mutatják, hogy ez a receptor szabályozza a koleszterogén enzimek transzkripcióját [41]. Az LM11A-31 azonban nem indukált semmilyen változást sem a vizsgálatban elemzett többi fehérjében, beleértve az ABCA1-et, sem a táptalaj koleszterin- és ApoE-szintjét, ami arra utal, hogy a p75NTR szelektív modulációja nem elegendő a koleszterinszint elősegítéséhez. NGF-fel kezelt sejtekben megfigyelt ApoE-dús részecskéken keresztül történő extrudálás. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy az NGF szabályozza a koleszterin metabolizmust a gliasejtekben a p75NTR és a TrkA receptorok részvételén keresztül.

Köztudott, hogy a Trk receptorokhoz kötődő neurotrofin aktiválja az ERK1/2-t, így szabályozza a sejtdifferenciálódásban, -proliferációban és -túlélésben szerepet játszó számos útvonalat [2,38]. Érdekes módon megfigyelték, hogy az ERK1/2 aktiváció az ABCA1 és az ApoE expresszióját is szabályozza különböző sejttípusokban [38,42,43]. Ezek az eredmények, valamint az a bizonyíték, hogy a BDNF/TrkB/ERK tengely elősegíti az ApoE extrudálást és az ABCA1 expressziót gliasejtekben [38], arra utalnak, hogy a TrkA/ERK tengelyt érintő jelátviteli útvonal magyarázatot adhat az NGF által kifejtett hatások egy részére. tanulmányunkban.

Míg a neurit kinövésben nem figyeltek meg változást, az U373- kondicionált tápközeg alkalmazása és az együtttenyésztési kísérletek elvégzése azt mutatta, hogy az NGF által közvetített megnövekedett ApoE szekréció a gliasejtekből meghatározó az oxidatív hatások által kiváltott káros következmények megelőzésében. stressz az idegsejtekben. A citotoxicitás kiváltására rotenont, a preklinikai kutatásokban általánosan használt peszticidet alkalmaztunk a mitokondriumból származó reaktív oxigénfajták (ROS) és az azt követő apoptózis indukálására [44].

Eredményeink rávilágítanak arra, hogy az NGF stimulálja a gliasejtek ApoE szekrécióját, ami szükséges a rotenon beadásával szembeni neuroprotektív hatás garantálásához differenciált N1E-115 sejtekben. Az ApoE szerepe az oxidatív stressz megelőzésében jól dokumentált. Például az ApoE kimerülése egérmodellekben súlyosbítja az oxidatív sérüléseket az agyszövetben [45,46]. Ennek megfelelően az exogén ApoE beadása a másodlagos glutamát toxicitás ellensúlyozásával megvéd a hidrogén-peroxidos kezelés visszafordíthatatlan oxidatív károsodásától [18]. Ezenkívül az ApoE-tartalmú lipoproteinek hatékonyan csillapítják a retina ganglion neuronjaiban a trofikus támogatás megvonása által kiváltott apoptózist [47].

Vizsgálatunkban a rotenon alkalmazása azt sugallja, hogy az ApoE által közvetített neuroprotekció, amelyet NGF-stimulált gliasejtek támogatnak, releváns lehet neurodegeneratív állapotok, például PD összefüggésében. Nevezetesen, a rotenon a PD-ben megfigyelthez hasonló dopaminerg neuron-degenerációt reprodukál, mind állatmodellekben, mind sejttenyészetekben, beleértve az N1E-115- eredetű neuronokat is [48–50]. Eredményeink egybehangzóan alátámasztják a korábbi bizonyítékokat, amelyek azt mutatják, hogy az ApoE neuroprotekciót vált ki a 6-hidroxidopamin (6-OHDA), egy másik neurotoxin, amely képes PD-szerű fenotípust indukálni [51]. Tanulmányunk összességében azt mutatja, hogy az NGF a koleszterin metabolizmus és az ApoE gliasejtekből történő extrudálásának döntő modulátora. A legfontosabb, hogy az ApoE szekréció e neurotrofin által előidézett fokozása szükséges a rotenon citotoxicitással szembeni neuroprotekció biztosításához.

A BDNF a legnagyobb mennyiségben előforduló neurotrofin a felnőtt agyban. E bizonyítékok ellenére kimutatták, hogy az NGF döntő szerepet játszhat nemcsak a fejlődés során, hanem a felnőtt központi idegrendszerében is. Például az NGF befolyásolja a hippocampális aktivitást, és ennek következtében a térbeli memóriát és a tanulást [52]. Más eredmények arra utalnak, hogy az NGF neuroprotektív hatást fejt ki a nigrostriatális dopaminerg neuronokra, és ez a tevékenység megalapozhatja a PD új NGF-alapú terápiás megközelítéseit [53].

E felfogás szerint kimutatták, hogy az NGF termelése felnőttkorban mélyen szabályozott az asztrocitákban, és moduláló hatást fejt ki a neurogyulladásra, agysérülésre és neurodegenerációra [54–56]. Ebben az összefüggésben érdekes lenne a jövőbeli tanulmányok során értékelni, hogy ezek a hatások legalább részben közvetíthetők-e a glia koleszterin NGF által elősegített modulációjával. Jelen munka bemutat néhány korlátot, amelyet a következő kísérleti vizsgálatok során le kell küzdeni; például fontos lenne az NGF-kezelést és a gliasejtek koleszterin-anyagcseréjét összekötő molekuláris mechanizmusok jobb boncolgatása.

A széleskörű ismeretek hasznosak a specifikus molekuláris célpontok azonosításához, amelyek farmakológiai manipulációra alkalmasak, és amelyek neurodegeneratív összefüggésekben alkalmazhatók. Továbbá, bár az U373 és N1E-115 sejteket széles körben használják kezelhető sejtvonalként az asztrocita és neuronális jellemzők reprodukálására [27–29,57], ezeket az eredményeket az elsődleges sejttenyészetekben tovább kell igazolni. Bár további erőfeszítéseket kell tenni a neurotropin jelátvitelnek az agy koleszterin-homeosztázisában való részvételének megerősítésére, ez a munka először bizonyítja, hogy az NGF közvetve neuroprotektív hatást fejthet ki a glia koleszterin metabolizmusának befolyásolásával.

4. Anyag és módszer

4.1. Sejtkultúra

N1E-115 neuroblasztóma sejteket és U373 sejteket tenyésztettünk 5% CO2 mellett DMEM-ben, magas glükóz mellett (Merck Life Science, Milánó, Olaszország), 10% (v/v) magzati szarvasmarha szérummal (FBS) (Merck Life Science). , Milánó, Olaszország), és penicillin/sztreptomicin oldattal adták hozzá.

A neuronális differenciálódás indukálására N1E-115 sejteket 30%-os konfluenciánál oltottunk be, és DMEM-re váltottuk 0,5% FBS-sel 96 órára.

A neuronális differenciálódás indukálására N1E-115 sejteket 30%-os konfluenciánál oltottunk be, és DMEM-re váltottuk 0,5% FBS-sel 96 órára.

Az asztrocita-neuron társtenyészeteket Ioannou és munkatársai által leírt protokoll szerint állítottuk fel, módosításokkal [59]. Paraffin távtartókat nyomtunk a fedőlemezekre, hogy biztosítsuk a tapadást; távtartókat használtunk a neuronális fedőlemezeken, hogy hatékonyan megelőzzük a mechanikai sérüléseket, amikor a sejteket egymással szemben helyeztük el. A fedőlemezeket ezután etanolban sterilizáltuk, és poli-D-lizinnel vontuk be (Merck Life Science, Milánó, Olaszország). Az N1E-115-ot a bevont fedőlemezekre a kívánt sűrűségben oltottuk, és miután készen álltak az együtttenyésztésre, steril csipeszekkel emelték fel az N1E-115 neuronokat tartalmazó fedőlemezeket, és helyezték őket képpel lefelé a { {10}}U373 asztrocitákkal beoltott lyukak.

Az N1E-115 sejtek előkezelését 0,1 µM rotenon (Sigma-Aldrich, Milánó, Olaszország, R8875) 16 órán át történő beadásával végeztük. A kontrollsejtek DMSO-t kaptak (1:1000 hígítás sejttenyésztő tápközegben) vivőanyagként. Az U373 sejteket NGF-fel (Alomone Labs, Jerusalem, Israel, N-245) kezeltük 100 ng/ml dózisban 48 órán keresztül minden kísérletben.

4.2. Lizátum-előkészítés és Western-blot-analízis

Az U373 sejteket ultrahanggal kezeltük (munkaciklus 20%, 3. kimenet) mintapufferben (10% SDS-t tartalmazó 0,1 Tris-HClisHCl, proteáz inhibitor koktél, pH 6,8), hogy teljes lizátumot kapjunk, a korábban leírtak szerint [ 60,61]. Laemmli puffert adtunk hozzá, és a mintákat 95 ◦C-on 5 percig denaturáltuk. A fehérjekivonatokat (20 mikrogramm fehérje) SDS-PAGE-n rezolválták, és a nitrocellulóz membránra történő átvitelt transz-blot turbótranszfer rendszerrel (Biorad Laboratories, Milánó, Olaszország) végeztük, amint azt korábban közöltük [62].

Ezt követően a membránt szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk 5% zsírmentes száraz tejben Tris-pufferolt sóoldatban (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0,05% Tween{ {10}}, pH 6,8), és éjszakán át 4 ◦C-on a következő elsődleges antitestekkel szondáztattuk: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, hígítás 1:500), anti-p75NTR TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, hígítás 1:500), anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-8984 , hígítás 1:1000), anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, UK, ab30682, hígítás 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, UK, ab242315, hígítás 1:1000), anti-LDLr (Abcam, Cambridge, UK, ab30532, hígítás 1:500), anti-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, USA, NB400-148, hígítás 1:3000) ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-58219, hígítás 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-53570, hígítás 1 :400), anti-vinculin (SigmaAldrich, Milánó, Olaszország, V9264, hígítás 1:10 000) és anti- -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{60}}, 1. hígítás :10 000).

A membránokat egymást követően 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk HRP-konjugált másodlagos anti-egér vagy anti-nyúl antitestekkel (Bio-Rad Laboratories, Milánó, Olaszország). A fehérjéhez kötött antitesteket tiszta ECL Western blottal tettük láthatóvá (Bio-Rad Laboratories, Milánó, Olaszország, #1705061), és a kemilumineszcenciát a ChemiDoc MP rendszeren keresztül regisztráltuk (Bio-Rad Laboratories, Milánó, Olaszország). A Western blotból származó denzitometriás elemzést az ImageJ 1.52t verziójú (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) Windows rendszerhez készült szoftverével végeztük. Háztartási fehérjeként Vinculint vagy -aktint használtak, amelyek belső kontrollként szolgáltak a fehérjeterheléshez. A denzitometriás számításokat tetszőleges egységekben kaptuk, a fehérjesáv intenzitása és a megfelelő háztartási fehérje arányából származtatva.

4.3. Olajvörös O festés

Az U373 sejteket poli-L-lizinnel (Sigma-Aldrich, P6282-5 MG) bevont fedőlemezekre oltottuk 6-lyukú lemezeken, és az Olajvörös O festést a korábban leírtak szerint végeztük [60]. Röviden, a sejteket paraformaldehidben (4%-os oldat) fixáltuk 10 percig, és háromszor óvatosan öblítettük PBS-sel. A rögzített sejteket 60%-os izopropanollal 5 percig inkubáltuk, majd desztillált vízzel mostuk. Ezt követően a sejteket 1 ml Oil Red O munkaoldattal (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) vizsgáltuk 15 percig szobahőmérsékleten úgy, hogy a 6-lyuklemezt egy orbitális rotátoros rázóra helyeztük. A festőoldattal való inkubálás után a lyukakat háromszor mostuk desztillált vízzel, hogy eltávolítsuk a felesleges foltot.

A fedőlemezeket végül Fluoroshield rögzítőközeggel (Sigma-Aldrich, F6182) szereltük fel, és az Oil red O autofluoreszcenciát konfokális mikroszkóppal (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Németország) tettük láthatóvá. A képek 63-szoros nagyítással és Leica LAS X szoftverrel (Milánó, Olaszország) felszerelt Leica TCS SP8 segítségével készültek. Az olajvörös O festődés mennyiségi meghatározását az ImageJ for Windows szoftveren keresztül végeztük, és a sejtterületenkénti átlagos fluoreszcencia intenzitásként számítottuk ki.
4.4. Fülöp festés

A filippín festést Filipin komplex (Sigma-Aldrich, F9765) alkalmazásával végeztük. A filippín törzsoldatot (10 mg/ml PBS-ben) mindig közvetlenül felhasználás előtt készítettük el. A sejteket paraformaldehidben (4%-os oldat) fixáltuk 10 percig, és mostuk PBS-sel. Az U373-at ezután 1 ml Filipin munkaoldattal (0,05 mg/ml PBS-ben) festettük 1 órán át sötétben, szobahőmérsékleten. Ezt követően a sejteket háromszor mostuk PBS-sel, és a fedőlemezeket Fluoroshield rögzítőközeggel szereltük fel, és azonnal elemeztük konfokális mikroszkóppal UV-szűrőkészlet segítségével (340-380 nm-es gerjesztés). A képek 40-szeres nagyítással készültek. A filippín kvantifikációt a sejtterületenkénti átlagos fluoreszcencia intenzitásként számítottuk ki az ImageJ for Windows szoftver segítségével.

4.5. Koleszterin mennyiségi meghatározása

A koleszterin mennyiségi meghatározását kolorimetriás assay-vel (Cholesterol Quantitation Kit, MAK043, Sigma-Aldrich, Milánó, Olaszország) végeztük a gyártó utasításait követve.

4.6. ELISA
A tápközegben lévő ApoE-szinteket a Human Apolipoprotein E ELISA Kit (Abcam, Cambridge, UK, ab108813) segítségével határoztuk meg a gyártó utasításai szerint.

4.7. Immunfluoreszcencia

Az U373 sejtek immunfluoreszcenciáját a korábban leírtak szerint végeztük [60]. Az U373-at paraformaldehidben (4% PBS-ben) fixáltuk, és egy éjszakán át elsődleges antitestekkel vizsgáltuk: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{6}}, hígítás 1:100) és anti-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{10}}, hígítás 1:100). Ezt követően a sejteket 1 órán át inkubáltuk kecske anti-egér másodlagos antitesttel, Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA, A28180) és kecske anti-nyúl másodlagos antitesttel, Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, USA Waltham, MA) , A27034). A magok vizualizálására DAPI festést végeztünk, és végül a fedőlemezeket Fluoroshield rögzítőközeggel rögzítettük. A mintákat konfokális mikroszkóppal elemeztük a fent leírtak szerint.

4.8. ApoE csendesítés

Az ApoE mRNS elnémítását U373 sejteken ApoE siRNS-sel (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-29708) végeztük a gyártó utasításai szerint. A transzfekciót egy 6-lyukú szövettenyésztő lemezen végeztük, ahol lyukanként 100,000 sejtet 10% FBS-sel kiegészített DMEM antibiotikum-mentes táptalajba oltottunk 24 órán át. Minden egyes lyukhoz siRNS transzfekciós táptalajt (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc{8}}) ​​adtunk az siRNS Transfection Reaction oldathoz, amelyet siRNS duplex és siRNS transzfekciós reagens (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc29528). Ezután a sejteket egyszer mostuk siRNS transzfekciós tápközeggel, és befedtük az előzőleg elkészített transzfekciós keverékkel. Ezt követően a tenyésztőlemezt 7 órán át 37 °C-on 5%-os CO2 inkubátorban inkubáltuk.

20% FBS-t és antibiotikumot (a normál koncentráció 2--szeresét) tartalmazó DMEM táptalajt adtunk a transzfekciós keverékhez minden egyes lyukban 1:1 arányban. A sejteket 18 órán át inkubáltuk, majd a tápközeget eltávolítottuk, és friss, normál táptalajra cseréltük; 24 órával az utolsó lépés után a sejtek készen álltak a további kísérletekhez. Az ApoE elnémítás hatékonyságát RT-qPCR-rel határoztuk meg U373 sejtekben és ELISA-val a sejtfelülúszóban; Az ApoE siRNS hatékonyan megakadályozta az NGF általi ApoE indukciót a scramble siRNS-hez képest (ApoE mRNS: 83% csökkenés; ApoE ELISA: 78% csökkenés). Nevezetesen, az ApoE expressziója az siRNS elnémításakor alacsonyabb volt, mint a kontroll U373-ban megfigyelt alap expressziós szint (ApoE mRNS: 72%-os csökkenés; ApoE ELISA: 58%-os csökkenés) (S 3A, B ábra).

4.9. RNS extrakció és valós idejű PCR

Az mRNS analízist a korábban leírtak szerint végeztük [22,63]. Röviden, az U373 sejtekből származó teljes RNS-t TRI reagenssel (Merck Life Science, Milánó, Olaszország) extraháltuk a gyártó utasításai szerint. DNS-áz kezelést (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Milánó, Olaszország) végeztünk, majd az RNS-t RNS-tisztító készlettel (Zymo, Olaszország) tisztítottuk. Az RNS-t egymás után fordítottuk cDNS-vé egy nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós sejtkészleten keresztül (Applied Bio-System, Foster City, CA, USA), és qPCR-analízishez használtuk.

A qRT-PCR-ben az apoE-hez használt primerek a következők voltak: előre 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 és fordított 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. A qRT-PCR-ben használt gapdh primerek (referenciagénként) a következők voltak: forward 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 és fordított 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. A megfelelő amplikon képződését az olvadási görbe értékelésével értékeltük. Minden biológiai mintát három párhuzamosban futtattunk SYBR zöld IQ reagenssel (Bio-Rad Laboratories, Milánó, Olaszország) és a CFX Connect detektáló rendszert (Bio-Rad Laboratories, Milánó, Olaszország) használva.

4.10. A neuronális morfológia kvantitatív értékelése

Az N1E{1}} sejtek neuronális morfológiáját fordított mikroszkóppal készített felvételekkel becsülték meg. A morfometriai analízist az ImageJ for Windows szoftveren keresztül végeztük, és megbecsültük az összes sejt számát (a kontroll százalékos variációjában kifejezve), az átlagos neurithosszt (a kontroll százalékában kifejezve) és a neuritot hordozó sejtek számát. A neurittartalmú sejtek százalékos arányát úgy számítottuk ki, hogy a differenciált sejtek számát elosztottuk a mezőnkénti sejtek teljes számával. Az N1E-115 dévák akkor különböztek egymástól, ha legalább egy a neuritjuk volt, amelynek hossza egyenlő vagy nagyobb, mint a szóma átmérője. A morfológiai értékelést legalább öt független kísérleten végeztük, amelyekben legalább három képet elemeztünk.

4.11. Statisztikai analízis

A jelen tanulmányban bemutatott összes eredményt átlag ± SD-ben fejeztük ki (az adatok standard deviációjának normál eloszlását Shapiro–Wilk teszttel ellenőriztük. Két kísérleti csoport összehasonlításakor nem párosított teszteket alkalmaztunk. Három vagy több csoport esetén azonban Összehasonlítottam, egyutas varianciaanalízist (ANOVA), majd Tukey post hoc tesztjét alkalmaztuk A rotenonnal végzett kísérletekhez, ahol két változó volt jelen, kétutas ANOVA-t, majd Bonferroni utótesztet használtunk. A statisztikai analízis a GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) for Windows segítségével történt.

A szerző hozzájárulásai:

Fogalomalkotás, MS; módszertan, MS és MC; validálás, MS és MC; formális elemzés, MS, MC, DP és MP; nyomozás, MC, NM, LL, MP és DP; erőforrások, MS és alelnök; adatkezelés, MS és MC; írás – eredeti tervezet előkészítése, MS és MC; írás – áttekintés és szerkesztés, MP, LL, DP, NM és VP; vizualizáció, MS, MC és MP; felügyelet, MS; projekt adminisztráció, MS; finanszírozás megszerzése, MS Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás:

Ezt a kutatást a Funds for Departmental Research 2021 (Molise Egyetem) finanszírozta az MS-ben, valamint a Jerome Lejeune Alapítvány felhívása a 2021a, #2043.

Az intézményi felülvizsgálati bizottság nyilatkozata:

Nem alkalmazható.

Tájékozott beleegyező nyilatkozat:

Nem alkalmazható.

Adatelérhetőségi nyilatkozat:

Nem alkalmazható.

Köszönetnyilvánítás:

Köszönjük Claudia Tonininek a koleszterinméréshez nyújtott segítséget

Összeférhetetlenség:

A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Hivatkozások

1. Björkhem, I.; Meaney, S.; Fogelman, AM Agykoleszterin: Hosszú titkos élet egy sorompó mögött. Arterioszkler. Thromb. Vasc. Biol. 2004, 24, 806–815. [CrossRef] [PubMed]

2. Colardo, M.; Martella, N.; Pensabene, D.; Siteni, S.; Di Bartolomeo, S.; Pallottini, V.; Segatto, M. Neurotrofinok, mint a sejtmetabolizmus kulcsfontosságú szabályozói: A koleszterin homeosztázisra gyakorolt ​​hatás. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. Goritz, C.; Mauch, DH; Pfrieger, FW Számos mechanizmus közvetíti a koleszterin által kiváltott szinaptogenezist egy központi idegrendszeri neuronban. Mol. Sejt. Neurosci. 2005, 29, 190–201. [CrossRef] [PubMed]

4. Pfenninger, KH Plazma membrán expanziója: Egy neuron herkulesi feladata. Nat. Neurosci tiszteletes. 2009, 10, 251–261. [CrossRef]

5. Takamori, S.; Holt, M.; Stenius, K.; Lemke, EA; Grønborg, M.; Riedel, D.; Urlaub, H.; Schenck, S.; Brügger, B.; Ringler, P.; et al. Egy embercsempész-szervecskék molekuláris anatómiája. Cell 2006, 127, 831–846. [CrossRef] [PubMed]

6. Suzuki, S.; Kiyosue, K.; Hazama, S.; Ogura, A.; Kashihara, M.; Hara, T.; Koshimizu, H.; Kojima, M. Az agyból származó neurotróf faktor szabályozza a koleszterin anyagcserét a szinapszisok kialakulásához. J. Neurosci. 2007, 27, 6417–6427. [CrossRef]

7. Segatto, M.; Leboffe, L.; Trapani, L.; Pallottini, V. A koleszterin homeosztázis kudarca az agyban: A szinaptikus diszfunkció és a kognitív hanyatlás következményei. Curr. Med. Chem. 2014, 21, 2788–2802. [CrossRef] [PubMed]

8. Jeske, DJ; Dietschy, JM A koleszterinszintézis sebességének szabályozása in vivo patkány májában és hasított testében [3H]vízzel mérve. J. Lipid Res. 1980, 21, 364–376. [CrossRef]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. Koleszterin metabolizmus neuronokban és asztrocitákban. Prog. Lipid Res. 2011, 50, 357–371. [CrossRef]

10. Nieweg, K.; Schaller, H.; Pfrieger, FW Jelentős különbségek a koleszterinszintézisben a szülés utáni patkányokból származó neuronok és gliasejtek között. J. Neurochem. 2009, 109, 125–134. [CrossRef]

11. Oram, JF; Heinecke, JW ATP-kötő kazettás transzporter A1: Sejtkoleszterin-exportőr, amely véd a szív- és érrendszeri betegségek ellen. Physiol. Rev. 2005, 85, 1343–1372. [CrossRef]

12. Pfrieger, FW Outsourcing az agyban: Függnek-e a neuronok az asztrociták általi koleszterinszállítástól? BioEssays 2003, 25, 72–78. [CrossRef]

13. Christopherson, KS; Ullian, EM; Stokes, CCA; Mullowney, CE; A pokolba, JW; Agah, A.; Lawler, J.; Mosher, DF; Bornstein, P.; Barres, BA A trombospondinok asztrociták által kiválasztott fehérjék, amelyek elősegítik a központi idegrendszer szinaptogenezisét. Cell 2005, 120, 421–433. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com