A norwogonin csökkenti a hipoxia által kiváltott oxidatív stresszt és az apoptózist a PC12 sejtekben

További információért:ali.ma@wecistanche.com

Absztrakt

Háttér: A norwogonin egy természetes flavon, három fenolos hidroxilcsoporttal a csontváz szerkezetében, és kiváló.antioxidánstevékenység. A norwogonin neuroprotektív hatása azonban továbbra is tisztázatlan. Itt megvizsgáltuk a norwogonin védőképességét a PC12 sejtekben a hipoxia által kiváltott oxidatív károsodással szemben. Módszerek: A sejtek életképességét és apoptózisát MTT assay-vel, illetve Annexin V-FITC/PI festéssel vizsgáltuk. A reaktív oxigénfajták (ROS) tartalmát DCFH-DA assay segítségével mértük. Laktát-dehidrogenáz (LDH), malondialdehid (MDA) ésantioxidánsAz enzimszinteket kereskedelmi készletekkel határoztuk meg. A rokon gének és fehérjék expresszióját valós idejű kvantitatív PCR-rel, illetve Western blottal mértük. Eredmények: Megállapítottuk, hogy a norwogonin enyhítette a hipoxia okozta károsodást PC12 sejtekben azáltal, hogy növelte a sejtek életképességét, csökkentette az LDH felszabadulást, és javította a sejtmorfológiai változásokat. Norwogonin is fellépett egyantioxidánsa ROS megkötésével, az MDA termelés csökkentésével, a szuperoxid-diszmutáz (SOD), a kataláz (CAT) és a glutation-peroxidáz (GPx) aktivitásának fenntartásával, valamint a HIF{0}} és a VEGF expressziós szintjének csökkentésével. Ezenkívül a wogonin megakadályozta a sejt apoptózisát azáltal, hogy gátolta a kaszpáz-3, a citokróm c és a Bax expressziós szintjét, miközben növelte a Bcl-2 expressziós szintjét és a Bcl-2/Bax arányát. Következtetések: A norwogonin csökkenti a hipoxia által kiváltott sérüléseket a PC12 sejtekben azáltal, hogy kioltja a ROS-t, fenntartva aantioxidánsenzimeket, és gátolja a mitokondriális apoptózis útvonalat.

Kulcsszavak: Norwogonin,Antioxidáns aktivitás, Hipoxia, Oxidatív stressz, Apoptózis

Háttér

Az aerob szervezeteknek oxigénre (O2) van szükségük az energiatermeléshez. A hipoxiát úgy határozzák meg, mint az elégtelen O2-ellátást a szöveti sejtfunkció fenntartásához, és gyakran előfordul bizonyos fiziológiás helyzetekben, például nagy magasságban [1], és számos kóros helyzetben, például szélütésben [2]. Az agy különösen érzékeny a hipoxia okozta sérülésekre, mivel magas oxigénfogyasztása, gazdag telítetlen zsírsavakban és alacsony.antioxidánskapacitás [3]. Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a hipoxia káros hatásokat válthat ki az agyban [4–6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia és Huiping Ma

Gyógyszerészeti Osztály, a PLA 940. Kórháza Közös Logisztikai Támogató erője, Lanzhou 730050, Gansu, Kína

Az oxidatív stresszt és az apoptózist két tényezőnek tekintik a hipoxia által kiváltott sérülésekben [7, 8]. A hipoxiás expozícióról beszámoltak arról, hogy fokozza az intracelluláris reaktív oxigénfajták (ROS) termelését, ami elősegíti az oxidatív stresszt. A túlzott mennyiségű ROS, mint például a szuperoxid-anion (O2−˙ ), a hidrogén-peroxid (H2O2) és a hidroxilgyök (HO•), strukturális és funkcionális sejtváltozásokhoz vezet azáltal, hogy megtámadja a lipideket, membránokat, fehérjéket és DNS-t, és ezt követően sejtkárosodást okoz. 9].

Kattintson a Cistanches-re az antioxidánsért

Ezzel egyidejűleg a túltermelődött ROS elősegíti a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusának (mPTP) megnyitását [10] és a pro-apoptosis fehérjéknek a mitokondriális külső membránba való átvitelét, ami a mitokondriális membránok depolarizációját és a citokróm c felszabadulását idézi elő [11]. Ezek a változások végső soron mitokondriális függő apoptózist okoznak [12]. Tehát úgy gondolják, hogyantioxidánsokA túlzott ROS gátlására vagy megszüntetésére való képességük a hipoxia által kiváltott oxidatív stressz és apoptózis mérséklésével fejtheti ki védő hatását. Sok tanulmány igazolta eztantioxidánsaz olyan kiegészítők, mint a C-vitamin [13], az izoflavon [8] és a nitroxid gyökök [14], korlátozhatják a hipoxia által kiváltott sérüléseket in vitro és in vivo. A flavonoidok a mindenütt előforduló növényi másodlagos metabolitok nagy és változatos osztályát alkotják. Mindig kiváló természetesnek tartják őketantioxidánsképes megkötni a szabad gyököket és gátolni a lipidperoxidációt.

Manapság egyre nagyobb figyelmet fordítanak erre a vegyületosztályra az emberi egészségre gyakorolt ​​jótékony hatásuk miatt. A flavonoidokról kimutatták, hogy számos farmakológiai hatást fejtenek ki, például gyulladásgátló, antinociceptív és neuroprotektív hatást stb., amelyek mindegyike antioxidáns hatásuknak tulajdonítható [15]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a flavonoidok kiváló védőhatást fejtenek ki a hipoxia által kiváltott kudarcok ellen. Például a rutin erős neuroprotektív hatással bír a retina ganglionsejtek hipoxia által kiváltott halálával szemben [16]. Egy nemrégiben készült tanulmány azt is bizonyítja, hogy a rutin enyhítheti a kobalt-klorid által kiváltott hipoxiás károsodást azáltal, hogy gátolja az oxidatív stresszt és az apoptózist a H9c2 sejtekben [17]. Ezenkívül Liu és munkatársai azt sugallják, hogy a nobiletin (3′,4′,5,6,7,8-hexametoxi-flavon) az Akt/GSK-3 útvonal aktiválásával a H9c2 sejtben gyengíti a szívizom I/R sérülését. [18]. Ezenkívül az acacetin megvédheti a patkány szívizomsejteket és a H9C2 kardiomioblasztokat a hipoxia/reoxigenáció által kiváltott sérülésekkel szemben az AMPK által közvetített Nrf2 jelátviteli útvonal aktiválása révén [19].

A norwogonin (5,7,8-trihidroxi-flavon, 1. ábra) egy farmakológiailag aktív flavon, amelyet a Scutellaria baicalensis Georgi (kínaiul "Huang Qin") gyökerétől választanak el, amely egy hagyományos kínai gyógynövény, amelyet influenza és rák kezelésére használnak. [20, 21]. A norwogonin biológiai aktivitásáról azonban korlátozott számú tanulmányt közöltek a természetes növényekben található alacsony szintje miatt. Ennek a problémának a megoldására számos norwogonin szintézis módszert ismertettek [22, 23].

Korábbi vizsgálatunk egy egyszerű módszert is kialakított a norwogonin chrysinből történő négy lépésben történő előállítására [24]. Ezek a kutatások pozitívan befolyásolták a norwogonin biológiai aktivitásának további értékelését. Tanulmányok kimutatták, hogy a norwogonin antioxidáns [25], rákellenes [26, 27], vírusellenes [28] és antimikrobiális hatása [29], valamint gátolja a cianid által stimulált ROS termelését [30]. Azonban továbbra sem ismert, hogy a norwogonin rendelkezik-e védőképességgel a hipoxia okozta sérülésekkel szemben. Jelen tanulmány célja a norwogonin hipoxia által kiváltott oxidatív stresszel és apoptózissal szembeni védő hatásának vizsgálata volt PC12 sejtekben.

Mód

Anyagok és reagensek

A norwogonint (tisztaság 98 százalék vagy annál nagyobb) a korábban ismertetett módszerünk szerint állítottuk elő [24]. A rutint (tisztaság 96 százalék vagy annál nagyobb) a Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd.-től (Xian, Shannxi, Kína) vásároltuk. A norwogonint és a rutint steril dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldottuk, -20 °C-on tároltuk, és közvetlenül felhasználás előtt sejttenyésztő tápközegben hígítottuk. A Dulbecco módosított Eagle táptalajt (DMEM), magzati szarvasmarha szérumot (FBS), sztreptomicint és penicillint a Solarbio co., Ltd.-től (Peking, Kína) vásároltuk.

A malondialdehidet (MDA), a laktát-dehidrogenázt (LDH), a szuperoxid-diszmutázt (SOD), a katalázt (CAT) és a glutation-peroxidázt (GPx) a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-tól (Jiangsu, Kína) szereztük be. 2',7'-diklorid-hidrofluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) és (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólium bromid) tetrazólium (MTT) a Sigma-Aldrich Co-tól (St. Louis, MO, USA) szereztük be. Elsődleges antitestek a hipoxiával indukálható faktor-1 (HIF-1), vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), B-sejtes limfóma-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} kapcsolódó X-fehérjét (Bax), kaszpázt-3, citokróm C-t és -aktint az Abcam-től (Cambridge, Egyesült Királyság) vásároltuk. A másodlagos antitesteket a ZsBio Company-tól (Peking, Kína) szereztük be.

Egy apoptóziselemző készletet a Beyotime Institute of Biotechnology-tól (Jiangsu, Kína) szereztünk be. Minden vegyszer és oldószer analitikai minőségű volt, és egy kínai kereskedelmi szállítótól szerezték be. Sejttenyésztés A PC12 sejteket a Kínai Tudományos Akadémia Cell Bankjától (TCR 9, Sanghaj, Kína) vásároltuk, és DMEM-ben tartottuk 10% (v/v) FBS-t, 100 U/ml penicillint és 100 U/ml sztreptomicint. 37 fokon 5% CO2-t tartalmazó, párásított inkubátorban. A norwogonin citotoxicitásának értékelésére a PC12 sejteket (4-6. passzázs) előinkubáltuk különböző koncentrációjú (10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 mol/l) nor wogoninnal. 1 órán át, majd 24 órán át tenyésztjük. Hipoxiás expozíció A sejthipoxiás sérülés modelljének indukálásához a PC12 sejteket hipoxiás környezetnek (1% O2, 5% CO2 és 94% N2) 37 °C-on 24 órán át, párásított kamrában tették ki. A Normox kontroll sejteket 37 fokon tenyésztettük 5%-os CO2 inkubátorban 24 órán át.

A norwogonin hipoxia okozta sérülésekkel szembeni védőhatásának értékelésére a PC12 sejteket különböző koncentrációkban előinkubáltuk (10-8, 10-7, 10-6, 10-5 mol/ L) norwogonint 1 órával a hipoxia kezelés előtt. Sejtek életképessége A sejtek életképességét MTT vizsgálattal mértük a korábban leírtak szerint [31]. Röviden, PC12 sejteket (1 x 105 sejt/ml) 96 lyukú tenyésztőlemezekre oltottunk. Ezután különböző koncentrációjú norwogonint adtunk a lyukakba. Egyenlő térfogatú DMSO-t adtunk a kontrollüregekhez. A sejttenyésztő tápközegben a DMSO végső koncentrációja 0,1%. Normoxikus vagy hipoxiás körülmények között végzett inkubálás után 10 μl MTT-t (5,0 mg/ml) adtunk minden egyes lyukba, majd 37 fokon 4 órán át inkubáltuk. Ezután az MTT-t tartalmazó felülúszót eltávolítottuk, és a formazán terméket 100 μl DMSO-ban oldottuk. Az abszorbanciát SpectraMax i3 mikrolemez-leolvasóval (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) mértük 570 nm-en. Az eredményeket a kontrollcsoport relatív százalékában fejeztük ki. Az üveg fedőlemezekre oltott hematoxilinnel és eozinnal (HE) festő PC12 sejteket 24 órán át inkubáltuk, mielőtt norwogoninnal kezeltük őket a fent leírt módon.

A táptalajt eltávolítottuk, és az üveg fedőlemezeket hideg PBS-sel mostuk, majd szobahőmérsékleten 10 percig metanollal fixáltuk, majd háromszor 5 percig hideg PBS-sel mostuk. Végül a sejteket a HE festési protokoll szerint festettük [32]. A sejtelemzéseket OLYMPUS IX73 mikroszkóppal (100×) végeztük a sejtmorfológiai változások igazolására. A digitális képek a mikroszkóphoz társított DXM 1200 C digitális fényképezőgéppel (Nikon) készültek. ROS tartalom A PC12 sejtekben az intracelluláris ROS szintet DCFH-DA assay segítségével határoztuk meg [33]. Röviden, PC12 sejteket (1 × 105 sejt/ml) oltottunk 6-lyukú lemezekre. A hipoxiás kezelés után a PC12 sejteket PBS-sel mostuk, majd 10 μM DCFH-DA-t tartalmazó tápközegben 30 percig sötétben, 37 fokon inkubáltuk. A sejteket Olympus fordított fluoreszcens mikroszkóppal (Tokió, Japán) figyeltük meg, és Bec ton Dickinson FACScan áramlási citométerrel (BD Biosciences, CA, USA) elemeztük 488 nm gerjesztési hullámhosszú és 525 nm emissziós hullámhosszon. A ROS szintet a kontroll relatív százalékában fejeztük ki. Az LDH-szivárgás, az MDA-tartalom és az antioxidáns enzimaktivitás A PC12 sejteket (1 × 105 sejt/ml) 90 mm-es edénybe oltottuk. A fent leírt hipoxiás kezelés után minden edényből 50 μl tenyészet felülúszót gyűjtöttünk, és a tápközegben lévő LDH aktivitást kereskedelmi tesztkészletekkel (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Kína) detektáltuk, és U/ml-ben fejeztük ki. A PC12 sejteket összegyűjtöttük és hideg PBS-sel történő kétszeri mosás után homogenizáltuk. A teljes fehérje koncentrációját a BCA protein assay kittel mértük. Az MDA-tartalmat és az antioxidáns enzimaktivitást kereskedelemben kapható assay kitekkel határoztuk meg (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Kína).

Az MDA-tartalmat nmol/mg fehérjeként adtuk meg. A SOD, a CAT és a GPx aktivitását U/mg fehérje formájában mutattuk be. Sejtapoptózis (Annexin-V/PI festés) A hipoxiás kezelés után a PC12 sejteket összegyűjtöttük, kétszer mostuk hideg PBS-sel, majd kötőpufferrel szuszpendáltuk. A sejteket Annexin V-FITC és PI oldattal kezeltük a gyártó (Beyotime, Shanghai, Kína) protokollja szerint. Az adatgyűjtést Becton Dickinson FACScan áramlási citométerrel (BD Biosciences, CA, USA) végeztük. Kvantitatív valós idejű PCR analízis A PC12 sejtek teljes RNS-ét Trizol reagenssel (Takara, Dalian, Kína) extraháltuk, és a PrimeScript TM RT reagenskészlettel (AK4301,

Takara, Dalian, Kína). A HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, kaszpáz-3, citokróm C és glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) gént kódoló cDNS-t kvantitatív reál- idő PCR 7300 valós idejű detektáló rendszerrel (Applied Biosystems, CA, USA). A felhasznált primereket az 1. táblázatban mutatjuk be. A PCR ciklus körülményei 95 fokos 30 másodpercig, majd 40 ciklus 95 fokos 5 másodpercig és 60 fokos ciklusok 31 másodpercig voltak. Az mRNS-szinteket a 2-ΔΔCt módszerrel számítottuk ki, és GAPDH-ra normalizáltuk, amely a referenciagén. Western blot PC12 sejteket gyűjtöttünk össze, és RIPA szerekben homogenizáltuk. A teljes fehérje koncentrációját a BCA protein assay kit segítségével határoztuk meg. 30 µg mintát 12%-os SDS-PAGE elektroforézissel feloldottunk, majd polivinilidén-fluorid (PVDF) membránokra vittük át (Millipore, Billerica, MA, USA).

A membránokat TBST pufferben lévő 5 százalékos zsírmentes száraz tejjel blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, és elsődleges antitestekkel inkubáltuk: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, Egyesült Királyság), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, UK), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, UK), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, Egyesült Királyság), anti-kaszpáz-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), anti-citokróm C (1:1000, ab13575, Abcam, Egyesült Királyság) és anti- -aktin (1:2000, ab8227) , Abcam, UK) 4 fokos hőmérsékleten éjszaka. Ezután a membránokat mostuk, és másodlagos antitestekkel (1:2000, ZsBio, Peking, Kína;) inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. Az immunreaktív sávokat fokozott kemilumineszcenciás (ECL) reagensekkel tettük láthatóvá. A sávok relatív intenzitását az -aktin belső kontrollra normalizáltuk, és Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) segítségével elemeztük.

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± SD-ként fejeztük ki, amely legalább három független kísérletből származik. A csoportok közötti különbséget egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük, majd a Student–Newman–Keuls post hoc teszttel. A < 0,05="" p-értéket="" statisztikailag="" szignifikánsnak="">

Eredmények

A norwogonin védi a PC12 sejteket a hipoxia által kiváltott sérülésekkel szemben

Először is, a norwogonin proliferatív aktivitásának kizárására, normál PC12 sejtekre gyakorolt ​​citotoxicitását MTT vizsgálattal határoztuk meg. Amint a 2a. ábrán látható, a sejtproliferáció nem változott szignifikánsan az 1 × 10− 8 -1 × 10−5 mol/l koncentrációjú norwogoninnal (P > 0,05) ). A sejtek életképessége azonban szignifikánsan csökkent, amikor a norwogonin koncentrációját 1 × 10-4 mol/l-re emelték (P < 0,05).="" az="" eredmények="" azt="" mutatták,="" hogy="" a="" norwogonin="" nem="" mutat="" toxicitást="" vagy="" proliferatív="" aktivitást="" a="" pc12="" sejteken="" 1="" ×="" 10–="" 8="" -1="" ×="" 10–5="" mol/l="">

Ezután megvizsgáltuk a norwogonin védő hatását a hipoxia által kiváltott PC12 sejtkárosodással szemben. Amint a 2b. ábra mutatja, a kontrollcsoporthoz képest a sejtek életképessége a hipoxiás csoportban 58,71 százalékra csökkent (P < 0.01).="" a="" hipoxia-kezeléshez="" képest="" 1="" ×="" 10−8,="" 1="" ×="" 10−7="" és="" 1="" ×="" 10−6="" mol/l="" norwogonin="" dózisfüggően="" védett="" pc12-vel="" előkezelve.="" sejteket="" a="" hipoxia="" okozta="" sérülések="" ellen,="" helyreállítva="" a="" sejtek="" életképességét="" 58,71-ről="" 62,79="" százalékra="" (p="">< 0,05),="" 66,68="" százalékra="" (p="">< 0,01)="" és="" 69,88="" százalékra="" (p="">< 0,01).="" az="" 1="" ×="" 10−6="" mol/l="" rutinnal="" végzett="" előkezelés="" szintén="" védő="" hatást="" mutatott,="" szignifikánsan,="" 63,78%-ra="" növelve="" a="" sejtek="" életképességét="" a="" hipoxiás="" kezeléshez="" képest.="" az="" 1="" ×="" 10-5="" mol/l="" norwogoninnal="" előkezelt="" életképesség="" 63,43="" százalékra="" csökkent,="" ami="" még="" mindig="" szignifikánsan="" magasabb,="" mint="" a="" hipoxiás="" csoportban="" (p="">< 0,05).="" ezek="" az="" eredmények="" azt="" mutatták,="" hogy="" a="" norwogonin="" szignifikáns="" citovédelmet="" mutatott="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−5="" mol/l="" koncentrációban,="" a="" leghatékonyabb="" koncentráció="" pedig="" 1="" ×="" 10−6="" mol/l.="" ezután="" ezt="" az="" adagot="" használtuk="" optimális="" dózisként="" a="" következő="">

A norwogonin védőképességét morfológiai változások is igazolták. Amint a 2c. ábrán látható, a hipoxia-kezelés nélküli PC12 sejtek szabályos formájú (fusiform) és egyenletes méretűek jól növekedtek. A hipoxiás expozíció után a PC12 sejtek zsugorodást, lekerekített alakot, hámlást és csökkent sejtsűrűséget mutattak. A hypoxia előtt norwogoninnal vagy rutinnal előkezelt sejtek javultak, a hámlásos sejtek száma csökkent, a sejtforma normálisan helyreállt. Emellett a norwogonin védőképességét megerősítette az LDH szivárgása, amely a sejtmembrán integritásának elvesztésével jár. Amint a 2d. ábrán látható, az LDH-aktivitás a táptalajban jelentősen megnőtt a hipoxiás expozíciót követően (P <>

A norwogoninnal vagy rutinnal végzett előkezelés drámaian csökkentette az LDH szivárgását, ami arra utal, hogy a norwogonin és a rutin helyreállította a sejtmembrán integritását. A norwogonin gátolja a hipoxia által kiváltott oxidáns stresszt a PC12 sejtekben A ROS és az MDA a hipoxia által kiváltott celluláris oxidáns stressz két fontos mutatója. Amint a 3a. és b. ábrán látható, a PC12 sejtekben a hipoxiás expozíciót követően jelentősen megnövekedett ROS- és MDA-tartalom volt megfigyelhető. A norwogonin vagy rutin előkezelés jelentősen gátolta a ROS és az MDA termelődését.

Az antioxidáns enzimeket, például a SOD-t, a CAT-t és a GPx-t tekintik a sejtek oxidatív stresszel szembeni fő védekező rendszerének. Amint a 3c-e ábrán látható, a hipoxiás expozíció szignifikánsan gátolta a SOD, CAT és GPx aktivitását PC12 sejtekben. A norwogoninnal vagy rutinnal végzett kezelés megfordította ezeket a változásokat, és helyreállította az antioxidáns enzimek aktivitását. Mindezek az eredmények azt mutatták, hogy a norwogonin megvédte a PC12 sejteket a hipoxia által kiváltott oxidatív stresszel szemben.