Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kérem kattintson ide a 2. részhez

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* és Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1 Diplomás Neurális Regeneratív Medicina Intézet, Orvostudományi és Technológiai Főiskola, Taipei Orvostudományi Egyetem, Taipei 11031, Tajvan

2 Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, Taipei 11529, Tajvan

3 Klinikai Orvostudományi Intézet, Orvostudományi Főiskola, Nemzeti Cheng Kung Egyetem, Tainan 70403, Tajvan

4 Klinikai Orvostudományi Kutatóközpont, Nemzeti Cheng Kung Egyetemi Kórház, Orvostudományi Főiskola, Nemzeti Cheng Kung Egyetem, Tainan 70403, Tajvan

5 Orvosbiológiai Tudományok Tanszék és Diplomás Intézet, Orvostudományi Főiskola, Chang Gung Egyetem, Taoyuan 33302, Tajvan

6 Neuroscience Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou 33302, Tajvan

7 Vezető érintkező

*Levelezés: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

A Cistanche javíthatja a memóriát

ÖSSZEFOGLALÁS

A fenotípusos variáció alapvető előfeltétele a sejtek és organizmusok természetes szelekcióval történő evolúciójának. Míg a sztochasztikus génexpresszió szerepe a genetikailag azonos sejtek fenotípusos sokféleségében jól tanulmányozott, a sztochasztikus génexpresszió és az állatok egyéni viselkedésbeli változásai közötti kapcsolatról nem sokat tudunk. Bemutatjuk, hogy egy specifikus miRNS (miR-466f-3p) felszabályozott az egyes beltenyésztett egerek egy részének hippokampuszában a Morris vízi labirintusban. Jelentősen, a miR- 466f-3p pozitívan szabályozza a neuronok morfológiáját, működését és a térbeli tanulást, ésmemóriaaz egerek képessége. Mechanikailag a miR{0}}f-3p elnyomja a MEF2A fordítását, amely a tanulás negatív szabályozója/memória. Végül megmutatjuk, hogy a hippokampusz miR-466f-3p változatos felszabályozása a hippocampális ciklikus AMP (cAMP)-response element-binding (CREB) véletlenszerű foszforilációjából ered. A térbeli tanulás modulációjának ez a megállapítása ésmemóriaEgy randomizált hippocampális jelátviteli tengelyen keresztül, neuronális stimuláció hatására, azt mutatja be, hogy a szöveti génexpresszió változása hogyan vezet változatos állati viselkedéshez.

BEVEZETÉS

Az egyedek közötti fenotípusos változatosság evolúciós előnyt jelent, mivel biztosítja a populáció sokféleségét, amelyre a természetes szelekció hat (Pavlicev et al., 2011). A genetikai háttér és a környezeti tényezők hozzájárulnak az ilyen természetes variációk kialakulásához (Bendesky és Bargmann, 2011). Kísérletileg beltenyésztett egereket gyakran használtak az átlagos fenotípusok és viselkedések molekuláris és sejtes alapjainak tanulmányozására, hogy minimalizálják a tesztelt egyedek közötti genetikai különbségek hatását (Casellas, 2011). Mindazonáltal a szöveti transzkriptum bőségében eltéréseket mutattak ki az egyes izogén egerek között. Az erősen változó expressziós szintet mutató gének gyakran összefüggésbe hozhatók az immunfunkcióval, a stresszválaszokkal és a hormonális szabályozással, azaz a környezeti jelzésekre érzékeny folyamatokkal (Vedell et al., 2011). E tanulmányok némelyike ​​azt is kimutatta, hogy a génexpresszióban vagy a sejtjelátvitelben mutatkozó különbségek olyan környezeti tényezők befolyásával együtt vagy anélkül, mint az anyai nyalódás, a méhen belüli tápanyagellátás vagy a stressz által kiváltott reziliencia versus fogékonyság (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011; Lorsch

et al., 2019; Pedersen és mtsai, 2011), fenotípusok és viselkedésbeli különbségekhez vezethetnek (Casellas, 2011; Locke és mtsai, 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

Térbeli tanulás ésmemóriaAz agy által irányított formáció két rendszerre osztható: (1) önmozgást és belső jelzéseket alkalmazó egocentrikus navigáció és (2) allocentrikus navigáció, amely elsősorban a hippocampust és a közeli agyi struktúrákat érinti, amelyet az organizmusokon kívüli disztális jelzések stimulálnak (Ekstrom). et al., 2014). A térbeli tanulás képessége ésmemórialehetővé teszi a legtöbb állatfaj számára, hogy fokozatosan alkalmazkodjanak viselkedésükhöz, hogy alkalmazkodjanak a térben és időben változó környezetben, ami kritikus a túlélésük szempontjából. Ezt laboratóriumi állatokon olyan viselkedési paradigmák alkalmazásával lehet felmérni, mint például a Morris vízi labirintus (MWM) (Vorhees és Williams, 2014). Nevezetesen, a genetikailag azonos beltenyésztett rágcsálókról kimutatták, hogy fenotípusos eltéréseket mutatnak a térbeli tanulásban ésmemória(Tsai et al., 2002), de ennek a viselkedési eltérésnek a mögöttes mechanizmusai ismeretlenek maradtak.

Az új emlékek kialakulása összetett folyamat, amely aktivitásfüggő géntranszkripciót, új fehérjeszintézist és

1. ábra Összefüggés a térbeli tanulás variációja ésmemóriaképesség és miR{0}}f-3p indukció

(A) Vad típusú beltenyésztett C57BL/6J egerek MWM feladata. Bal oldali panel: GLN egerek MWM teljesítménye (pontok) és PLN egerek (négyzetek). Az összesen 289 tesztelt egér közül 180-at GLN-ként és 109-ként PLN-ként soroltak be. Jobb panel:MWMtask(n=47és 30egy csoport) vizsgálata. A négynegyed és a platformrégió metszetében elhelyezkedő mérési eredményeket a hisztogram összehasonlítja. P, a hiányzó emelvény helye; T, célzóna P nélkül; R, jobb zóna; O, ellentétes zóna; L, bal zóna. (B) A miRNS expresszió RT-qPCR analízise. A miR-466-669 klaszteren és a miR-132-3p-n, mint agyban gazdag pozitív kontrollként elhelyezkedő hat miRNS relatív expressziós szintjét elemeztük és normalizáltuk a GLN és PLN egér hippocampusból származó belső kontroll U6 snRNS-sel. (n=9–18 csoportonként). I, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3o.

finoman hangolt specifikus neuronhálózat, mintmemóriaengramokat, hogy új neuronális kapcsolatokat hozzanak létre és fenntartsák a plaszticitást (Asok et al., 2019). A hippocampális engramok, amelyek a gyrus fogazatában (DG) található neuronok ritka populációi, olyan neuronok együtteseit képviselik, amelyek fokozott aktivitást mutatnakmemóriaképződés. Míg a DG engram neuronjai a génexpresszió rendkívül eltérő mintázatát mutatják (Rao-Ruiz et al., 2019), a mögöttes engram-specifikus molekuláris mechanizmusokmemóriakonszolidációja nagyrészt ismeretlen. Ismeretes, hogy különböző tényezők és jelátviteli útvonalak pozitívan vagy negatívan szabályozzák a tanulást ésmemóriafolyamatokat azonosítottak (Abraham et al., 2019; Humeau és Choquet, 2019). Közülük a ciklikus AMP (cAMP)-response element-binding protein (CREB) aktivált formája stimulálja a géntranszkripciót válaszul az intracelluláris Ca2 plusz aktivitástól függő növekedésére a neuronokban (Kandel, 2012). Másrészt a camp/PKApathway elnyomja a myocyteenhancer factor 2 (MEF2) transzkripciós aktivitását azáltal, hogy megakadályozza társrepresszorának, a HDAC5-nek a nukleáris exportját és az NFAT koaktivátor nukleáris importját (Belfield et al., 2006). Ezenkívül a CREB-től eltérően a MEF2A aktivitás korlátozzamemóriaformáció (Cole et al., 2012). A fehérjefaktorokon kívül a mikroRNS-ek (miRNS-ek) a neuronális funkciók szabályozásában is részt vesznek, beleértve a tanulást és a memóriát (McNeill és Van Vactor, 2012). A miRNS-ek kicsi (22 nt) nem kódoló RNS-ek, amelyek elsősorban a génexpresszió poszt-transzkripciós szabályozói a specifikus mRNS-ek 30 nem transzlált régiójában (30 UTR) található felismerési helyükkel szekvencia-specifikus bázispárosodás révén (Daugaard és Hansen, 2017). A miRNS-ek számos jelátviteli útvonalban vesznek részt a posztmitotikus neuronokban, és közvetítik az aktivitástól függő sejtfolyamatokat, beleértve a dendrites növekedést és elágazást, a szinapszisok képződését és az érést. A génexpresszió szabályozásával fontos szerepet játszanak a szinaptikus plaszticitás hosszú távú formáiban ismemóriaformálás, visszakeresés és konszolidáció (Chen és Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

A következőkben bizonyítékokat mutatunk be a sztochasztikus szöveti génexpresszió és az állatok egyéni viselkedésbeli eltérései közötti okozati összefüggésre. Konkrétan megmutatjuk, hogy a hippocampális CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A tengely sztochasztikus aktiválása modulálja a térbeli tanulás és a tanulás egyéni változásait.memóriaképesség beltenyésztett egerekben.

EREDMÉNYEK

A térbeli tanulás egyéni variációja ésmemóriaa képesség korrelál a miR{0}}f-3p indukcióval egy specifikus miRNS klaszterből

A tanulás szabályozásában részt vevő miRNS-ek azonosítása ésmemóriaAz MWM feladatot használtuk a jó vagy gyenge tanulási és memóriaképességű, beltenyésztett, vad típusú C57BL/6J egerek megkülönböztetésére (1A. ábra). Azokat az egereket, amelyek az utolsó (6.) foglalkozáson 30 másodpercen belül teljesítették a feladatot, „jó tanulóknak” (GLN), míg azokat az egereket, amelyek az utolsó foglalkozáson 30 másodpercen belül nem találták meg a platformot, „rossz tanulóknak” tekintettük. ' (PLN). Amint az 1A. ábrán (bal oldali panel) látható, az egerek 62 százaléka a GLN-csoportba tartozott (289 egérből 180), a szökési késleltetés jelentős csökkenést mutatva 98,1 másodpercről (1. munkamenet) 21,8 másodpercre (6. munkamenet). Ezzel szemben az egerek fennmaradó 38 százalékának, a PLN-csoportnak (109 egérből 289) a menekülési késleltetés csak mérsékelten csökkent az első és a hatodik ülés között (az 1. ülés 111,8 másodpercéről a 6. ülés 82,1 másodpercére). . A szondateszt, amely azt jelzi, hogy az egerek valóban megtanulták a feladatot a hat munkamenet során, azt is kimutatta, hogy a GLN egerek tovább maradtak a platform régióban, mint a PLN egerek (1A ábra, bal oldali oszloppár a jobb panelen).

Ezt követően a GLN és PLN egerek hippokampuszából származó RNS-eket elemeztük miRNS microarray hibridizációval (n=4 csoportonként). Általában viszonylag csekély eltéréseket figyeltünk meg a GLN és PLN egerekből származó hippokampusz miRNS-ek expressziós profiljában. Megjegyeztük azonban, hogy az első 10 miRNS, amelyek expressziós szintje magasabb volt a GLN egerekben, mint a PLN egerekben (az adatokat nem mutatjuk be), mind ugyanabból a rágcsáló-specifikus miRNS-klaszterből, a miR-466-669-ból származott, amely a 10. intronban található. az mSfmbt2 gén (lásd alább). A klaszterben kiválasztott miRNS-ek expressziós szintjének reverz transzkripciós-kvantitatív polimeráz láncreakciója (RT-qPCR) elemzése alapján a miR-466f-3p-t választottuk további vizsgálatokhoz (1B. ábra). Ennek a miRNS-nek az átlagos expressziója 1{12}}szer magasabb volt a GLN egerek hippokampuszában, mint a PLN egerekben. Figyelemre méltó, hogy a hippocampalis miR-466f-3p átlagos szintje hasonló volt a PLN-csoportban, az otthoni ketreces (HC) kontrollcsoportban és az úszáskontroll csoportban (1C. ábra), így kizárva az edzéssel kapcsolatos hatásokat úszás, és tovább támogatja azt az elképzelést, hogy a miR-466f-3p térbeli tanulás során indukálódott, ésmemóriaképződés.

Az 1C. ábrán látható adatok azt mutatják, hogy a hippocampalis miR-466f-3p expressziós szintje a GLN egerek több mint 42 százalékánál legalább 15-szer magasabb volt, mint HC kontroll egerek, míg a PLN egerek 15 százalékában a szint fele volt a HC egereknek. A GLN egerek hozzávetőleg 25 százaléka és a PLN egerek 55 százaléka hasonló mR-466f{{10}}p (0.8--1.{14}} szeres a HC-hoz képest). Az 1D. ábrán látható a Pearson-féle korrelációs szórásdiagram, amely pozitív korrelációt mutat a miR-466f-3p szint és a platformon a szonda teszt alatti százalékos időtartama között. MiR-466f-3p és U6 kis nukleáris RNS (snRNS) in situ hibridizációját (ISH) is elvégeztük az agyszeleteken mind GLN, mind PLN egerekben (1E. ábra). A miR- 466f-3p jelek ISH-n keresztüli statisztikai elemzése megerősítette, hogy a miR-466f- 3p indukciója valóban nagyobb volt a GLN egerek DG-ben, mint az

PLN egerek, míg az U6 snRNS jelek összehasonlításakor nem találtunk különbséget (jobb oldali hisztogram, 1E. ábra). Bár a miR-466-3p jelek nem voltak egyenlőek az egyes szemcsesejtek között a DG-ben, mégis szignifikánsan és mindenütt növekedtek a GLN egerek hippokampuszában a PLN egerekhez képest. Ezért a miR-466f-3p indukció nem csak a sejtek kis részében, pl. az engram-neuronokban történt. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a miR-466f-3p felszabályozása az MWM-feladat során szorosan összefügg a jobb térbeli tanulással ésmemóriaképesség a GLN egerek jelentős része körében.

Számos agy-specifikus miRNS átlagos expressziós szintjét is elemeztük RT-qPCR segítségével. Közülük a miR-132-3p az egér hippokampuszában az MWM-feladat után felfelé szabályozódott, de nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a GLN és PLN csoportok között (VII. oszloppár, 1B. ábra). A miR-335-5p és miR-22 expressziós szintje hasonló volt a GLN, PLN és HC csoportban (S1A ábra). Így a miR-466f-3p-vel ellentétben ezeknek a miRNS-eknek a hippocampális expressziója az MWM edzés során nincs összefüggésben a térbeli tanulással ésmemóriaaz egerek képessége.

A miR-466f-3p felszabályozás elősegíti az idegsejtek növekedését és a dendritgerinc képződését

Annak igazolására, hogy a miR-466f-3p valóban expresszálódik neuronokban, miRNS ISH-t végeztünk a NeuN és a MAP2 immunfluoreszcenciás (IF) festésével kombinálva az elsődleges hippocampális neuronokban. Az eredmények azt mutatták, hogy a többi miRNS-hez hasonlóan (Cohen és mtsai, 2011; Thomas és mtsai, 2017) a miR-466f-3p főként a neuronális szóma régióban expresszálódott, néhány további jellel. a dendritekben (S2A ábra). Megérteni a felszabályozott miR-466f-3p tanulással és tanulással való összefüggésének molekuláris és sejtes alapját.memóriaképződése során először átmenetileg túlexpresszáltuk a miR-466f-3p-t egy dsRed fúziós polipeptiddel együtt a pFUGW-miR-466f-3p-ből származó ubiquitin promoter irányítása alatt. dsRed plazmidot a DIV10 elsődleges hippocampális neuronokba (S2B ábra). A miRNA ISH segítségével megerősítettük, hogy a miR-466f-3p jel erősebb a miR-466f-3p túlexpressziós csoportban, mint a vektorkontroll vagy a mutáns miR{{ 12}}f-3p csoport (nyilak, S2B ábra). Ezzel párhuzamosan létrehoztunk egy platformot is, amely megvizsgálja a miR-466f-3p funkcióvesztés hatását a miR-466f-3p gátlása miatt, a ben található miR-szivacs segítségével. a pFUGW-miR-szivacs-EGFP plazmidból expresszált EGFP mRNS 30 UTR-je (S2C ábra). A szivacsplazmidban található EGFP riporter a transzfekció hatékonyságának indikátoraként és a sejtes miRNS aktivitás érzékelőjeként is szolgált (Kluiver et al., 2012). A transzfektált HEK293T sejtek jelentős részében az EGFP jel csökkent a vad típusú miR-466f-3p-vel, de a mutáns miR-466f{{32-vel nem. }}p, az EGFP mRNS transzláció gátlása miatt a miR-466f-3p miR-szivacshoz való kötődése miatt a 30 UTR-ben (hasonlítsa össze a bal oldali négy képet és a két his-programot, S2C ábra) . Ezzel szemben nem figyeltünk meg csökkent EGFP-jelet a pFUGW-SCR-sponge-EGFP plazmidból származó kódolt szekvencia nyolc másolatát kódoló kontrollszivacs koexpressziója esetén sem miR-466f-3p-vel, sem mutánsa (hasonlítsa össze a jobb oldali négy képet és a két hisztogramot).

Amint a 2A. ábrán látható, a miR-466f-3p ektopiás expressziója morfológiai változásokat eredményezett az idegsejtekben, leginkább a fokozott neurit-kinövéshez képest a dsRed-et expresszáló pFUGW- vektorral transzfektált kontroll neuronokhoz képest. dsRed vagy mutáns miR-466f-3p-t expresszáló pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed plazmid. A kvantifikációs adatok azt mutatták, hogy az átlagos dendrites ágak száma neurononként nem különbözött szignifikánsan a miR-466f-3p-túlexpresszáló csoport (II. oszlop) és a vektoros vagy mutáns kontroll (I. és III. oszlop) között (jobbra). felső hisztogram, 2A ábra). Azonban az átlagos teljes dendrithossz és az elsődleges dendritek átlagos hossza megnőtt a miR-466f-3p túlexpresszió hatására (hasonlítsa össze a II. oszlopot az I. és III. oszloppal, a 2A. ábra jobb alsó hisztogramjával). Ezzel párhuzamosan miR-szivacs segítségével gátoltuk az endogén miR-466f-3p-t. Amint látható, nem volt szignifikáns különbség a dendrites ágak számában a miR-466f{-3p-gátlás és a kontrollcsoport között (hasonlítsa össze a IV. oszlopot az I. és V. oszloppal, jobb felső hisztogramot, 2A. ábra) , de a miR-466f-3p-gátló csoport jelentős csökkenést mutatott az átlagos teljes dendrithosszban, valamint az elsődleges és másodlagos dendritek átlagos hosszában a többi csoporthoz képest (hasonlítsa össze a IV. oszlopot az I. oszloppal és V, a 2A. ábra jobb alsó hisztogramja). Ezenkívül az IF-festés azt mutatta, hogy a miR- 466f-3p túlzott expressziója, de nem a gátlása, szintén növelte a dendrittüskék sűrűségét (2B. ábra, felső panelek és bal alsó hisztogram). A posztszinaptikus denzitású fehérje 95 (PSD-95) ko-festését is elvégeztük, és megszámoltuk a kolokalizált dendrittüskék sűrűségét, hogy meghatározzuk a serkentő szinapszisok pontos számát (2B. ábra, jobb alsó hisztogram), ami feltárta, hogy a miR{{40 A }}f-3p túlzott expressziója megnövelte a PSD-95-pozitív tüskék sűrűségét a többi kontrollcsoporthoz képest. A miR-466f-3p gátlás azonban nem változtatta meg szignifikánsan a PSD-95-pozitív tüskék sűrűségét a kontrollcsoportokhoz képest (2B. ábra, jobb alsó hisztogram). Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy neuronális stimuláció hiányában a miR-466f-3p gátlás önmagában nem befolyásolja a serkentő szinapszisok vagy a teljes dendrit tüskék sűrűségét.