Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensaada, Blaise Robin3, Joeille Perez, Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine, Lea Guyonnet, Helene Lazareth, Emmanuel Letavernier, Carole Henique, Pierre-Louis Tharaux és Olivia Lenoir

„Université de Paris, PARCC, Inserm, Párizs, Franciaország; és Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, Párizs, Franciaország

A proteinuria erős prediktív értéke krónikus glomerulopathiákban szilárdan megalapozott, valamint az angiotenzin ll patogén szerepe a glomeruláris betegség progressziójának elősegítésében, megváltozott glomeruláris filtrációs gáttal, podocita sérüléssel és a glomerulusok hegesedésével. Itt azt találtuk, hogy a krónikus angiotenzin Il által kiváltott magas vérnyomás gátolta az autofágia fluxust egér glomerulusokban. Az Atg5 (egy autofágiában szerepet játszó fehérjét kódoló gén) deléciója specifikusan a podocitában felgyorsult angiotenzin I által kiváltott podocitopátiát, fokozott albuminuria és glomerulosclerosis kialakulását eredményezte. Ez azt jelzi, hogy az autofágia kulcsfontosságú védelmi mechanizmus a podocitákban ebben az állapotban. Az angiotenzin-Il által kiváltott kalpain aktivitás podocitákban gátolja az autofágia fluxust. Az endogén kalpain-inhibitor, a kalpasztatin transzgénikus expressziójával rendelkező egerekből származó podociták magasabb podocita autofágiát mutattak kiinduláskor, amely rezisztens volt az angiotenzin Il-függő gátlással szemben. Ezenkívül a kalpasztatinnal járó tartós autofágia korlátozta a podocita károsodást és az albuminuriát. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a magas vérnyomás patogén hatással van a glomeruláris szerkezetre és funkcióra, részben a kalpainok aktiválása révén, ami a podocita autofágia blokkolásához vezet. Ezek az eredmények egy eredeti mechanizmust tárnak fel, amely szerint az angiotenzin Il által közvetített hipertónia gátolja az autofágiát a kalcium által kiváltott kalpain toborzáson keresztül, ami patogén következményekkel jár a kalpasztatin aktivitás miatti egyensúlyhiány esetén. Így az autofágia kalpain által közvetített csökkenésének megakadályozása ígéretes új terápiás stratégia lehet a magas renin-angiotenzin rendszeraktivitással összefüggő nephropathiák számára.

Cistanchedeserticola megakadályozzavesebetegség

Fordítási nyilatkozat

Tekintettel az autofágia döntő szerepére a kialakulásábanvesebetegségek, az autofágia farmakológiai modulációja ígéretes stratégia lehet számos vesebetegség megelőzésében és kezelésében. Ezzel párhuzamosan azt találták, hogy a podocitákban a kalpain aktivitás túlzott aktiválása káros hatással van a podociták működésére, míg káros hatásmechanizmusait nem azonosították. Itt bizonyítékot szolgáltatunk arra, hogy a kalpain az angiotenzin II káros hatását összekapcsolja a podociták autofágia káros blokádjával, és azt sugallják, hogy a kalpain gátlása ígéretes terápiás célpont lehet podocita betegségekben, részben a podocita autofágia fenntartása révén.

A magas vérnyomás a cukorbetegség után a második helyen áll, mint a progresszív okakrónikusvesebetegség- és még a mérsékelt vérnyomás-emelkedés is független kockázati tényező a végstádiumú vesebetegségben. Egyre több kísérleti tanulmány rávilágított a podociták fontosságára avesesérülés. A kísérletes hypertoniás nephropathiában a podociták progresszív elvesztése és a mikrovaszkuláris elváltozások korán jelentkeznek a funkcionális vese hanyatlásával. A betegeknél az életképes podociták vizelettel történő kiválasztódása a preeclampsia érzékeny és specifikus markere volt, és a nephrosclerosisban szenvedő betegek glomeruláris podocitáinak sűrűsége szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a vesedonoroknál. Ezen túlmenően, az angiotenzin II (Angel) patogén szerepe a glomeruláris betegségek progressziójában jól megalapozott, nemcsak magas vérnyomásban, hanem számos glomeruláris betegségben is.

A glomeruláris hipertónia a glomeruláris kapillárisok megnyúlását, az endothel károsodását és a glomeruláris fehérje filtrációjának emelkedését eredményezi, ami glomeruláris összeomlást és glomerulosclerosist okoz. Közvetlen hatást fejt ki a glomeruláris struktúrákra is, és a kompenzációt célzó szabályozó jelzési válaszokat okoz. Az aktivált szisztémás és lokális renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer (RAAS) elősegíti a mezangiális hiperpláziát és a vaszkuláris permeabilitási faktorok szintézisét. Ezzel egyidejűleg a podociták kalcium jelátvitelt mutatnak, és módosítják alakjukat az AnglI 1-es típusú receptoron (AT1)-28Ezek a stimulációtól függő adaptív mechanizmusok.24-28 hosszú távon maladaptívvá válnak, végül glomerulosclerosishoz vezetnek. Az AT1 közvetíti a RAAS kiemelkedő szerepét a vérnyomásban, valamint a só és víz homeosztázisában. Az angiotenzin-konvertáló enzim-gátlókat és az AT1-blokkolókat klinikailag alkalmazzák magas vérnyomás és szívelégtelenség kezelésére betegeknél. Érdekes módon mindkét blokkoló védő hatást is mutatvesefunkció.

Bebizonyosodott, hogy az autofágia nélkülözhetetlen a sejtes homeosztázis fenntartásához, különösen posztmitózisban és különösen podocitákban.{0}} Az autofágia a hosszú életű citoplazmatikus fehérjék és a diszfunkcionális organellumok cll9olizoszomális eredetű lebomlási rendszere55, és fehérjék és organellák elkülönítését foglalja magában. autofagoszómákban. Az autofagoszómák kialakulása számos gén, köztük a Mapllc3a/b, a Berlin 1 és az Atgs indukciójától függ. Egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy az autofág útvonal diszregulációja szerepet játszik a patogenezisben.veseöregedő és számosvesebetegségek, például akut vesekárosodás, policisztás vesebetegség, öregedés és diabéteszes nephropathia.

Az autofágia szabályozása a podocitákban, fiziológiás és mindenekelőtt patológiás összefüggésben, nem jól ismert. Nemrég kimutattuk, hogy a podocita autofágia fiziológiás körülmények között független a rapamicin (mTOR) szabályozásának mechanisztikus célpontjától, így ez a sejttípus kivétel. Az AT1 aktiválása serkenti a fehérjeszintézist és a fehérjeforgalmat a sejtekben. Így arra jutottunk, hogy a RAAS aktiválása befolyásolhatja a fehérjeforgalom stimulációját és a proteosztázist is.

Jelen tanulmányunkban az AnglI jelátvitelnek a podocita autofágia szabályozásában betöltött szerepére összpontosítottunk. Azonosítottuk azokat a kalcium-aktivált proteázok calpainokat, amelyek az AnglI podocita autofágiára gyakorolt ​​krónikus blokkoló hatását közvetítik. Továbbá azt találtuk, hogy az endogén calpain inhibitor calpasztatin képes volt megakadályozni az AngI-függő autofágia gátlást és a podocita sérülést magas vérnyomás alatt.

Ezek az eredmények egy eredeti mechanizmust tárnak fel, amelyben az AnglI által közvetített hipertónia gátolja az autofágiát a kalcium által kiváltott kalpain toborzáson keresztül, ami patogén következményekkel jár a kalpasztatin aktivitás egyensúlyhiánya esetén.

MÓD

Állatok

A kalpasztatin transzgenikus (CST18) egereket Dr. E. Letavernier biztosította. Az Atg5 podocita-specifikus megszakításával rendelkező egereket a korábban leírt gén (Nphs2.cre Atg5'o) szerint generáltuk úgy, hogy az Nphs2.cre egereket kereszteztük Ag5lxlomice5-tel a C57BL6/J háttéren. Nphs2.cre Atg5'oxlox egerek és kontroll hím alomtárs A hipertóniás modellt AnglI (Sigma-Aldrich, A9525) sc infúziójával indukáltuk 1 ug/kg/perc dózisban 4-6 héten keresztül. ozmotikus minipumpák (Alzet Corp, 2006-os modell). A szivattyúkat a hátba ültettük be a lapockák és a csípő közé. Az egerek só-kiegészítést (3% NaCl) kaptak a táplálékban. Atgsloxilox (vad típusú [WT]) egereket használtak kontrollként Az összes vizsgálatban. A dezoxikortikoszteron-acetát (DOCA) só esetében a nephronredukciós modellel felnőtt hím egereken egyoldali bal oldali nefrektómiát végeztek. Két héttel a nefrektómia után DOCA-pelletet kaptak a 21-napos felszabadulású (Innovative Research of America) sc beültetéssel. Egy második pelletet ültettünk be 3 héttel az első beültetés után 0,9% NaCl-t kaptak az ivóvízben ad libitum, és 6 hetes DOC beadás után elpusztultak.6 A kísérleteket a francia állatorvosi irányelvek és az Európai Közösség által a kísérleti állatokra vonatkozóan megfogalmazott irányelvek (L358-86/609EEC) szerint végezték. és a francia Kutatási Minisztérium és a helyi egyetemi kutatásetikai bizottság (APAFIS-7646 és -22373) hagyta jóvá.

Primer podocita tenyésztési kísérlet

A differenciált primer podocitákat a korábban leírtak szerint tenyésztettük./Röviden: a frissen izolált vesekéreget kollagenáz I-el (Gibco, {{0}}) kevertük össze és emésztettük meg a Roswell Park Memorial Institute 1640-ben (Life Technologies,{{2). }}). A szöveteket ezután 70 μm-es és 40 μm-es sejtszűrőkön (BD Falcon, 352340 és 352350) vezettük át. A 40 um-es sejtszűrőhöz tapadt glomerulusokat foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS; Life Technologies, 10010023) plusz 0,5 százalékos szarvasmarha szérumalbuminnal (Eurobio, HALALB07-65) injektálva nyomás alatt eltávolítottuk, majd kétszer mostuk. a PBS-ben. A frissen izolált glomerulusokat a Roswell Park Memorial Institute 1640-ben (Gibco, 61870036) 10% magzati borjúszérummal és 1% penicillinnel/sztreptomicinnel (Life Technologies, 15140122) kiegészített 6-lyukas edényekbe helyezték, hogy lehetővé tegyék a glomerulusokból a podocitákból való kiürülést. és növekedni. A podocita dúsítást Western blot analízissel ellenőriztük, mint korábban (S1 kiegészítő ábra). A podocitákat bafilomicin Al (100 nmol/, Sigma-Aldrich, B1793) nélkül vagy jelenlétében tenyésztettük 4 órán keresztül. Az immunfluoreszcenciás kísérletekhez a primer podocitákat 4 edénycímkére szélesztettük (Dutcher, 055071). A podocitákat ezután 4%-os paraformaldehidben fixáltuk 10 percig, és immunfluoreszcenciára dolgoztuk fel.

Calpain aktivitási vizsgálat

Az intracelluláris kalpain aktivitást primer podocitákban határoztuk meg, a korábban leírtak szerint. Összesen 100,000 sejtet tenyésztettek 24-lyukú szövettenyésztő edényekben a Roswell Park Memorial Institute 1640-ben, 10% magzati borjúszérummal és 1% penicillinnel/sztreptomicinnel kiegészítve. A jelzett tenyésztési periódus után a táptalajt 4 mM CaCl2-t tartalmazó Krebs-Ringer HEPES-bikarbonát (KRH) oldattal (pH 7,4) 10 uM kalpaininhibitorral vagy anélkül-1 cseréltük ki, és az adagolás előtt 10 percig inkubáltuk. 50 mM kalpain szubsztrát N-szukcinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metikoumarin (Sigma-Aldrich, S6510). 90-perces inkubációs periódus után a cal-pain aktivitást a fluoreszcencia különbségeként határoztuk meg (360 nm-es gerjesztésnél és 430 nm-es emissziónál mérve) calpain inhibitorral és anélkül-1.

Western blot

Az elsődleges podocitákat 80 ul radioimmunprecipitációs vizsgálati pufferrel karcoltuk meg, amely foszfatázt és proteáz inhibitort tartalmazott. A fehérjekoncentrációt a BCA Protein Assay Kit-tel (Merck Biochemistry, 71285) mértük. Húsz mikrogramm fehérjét elektroforetizáltunk Criterion XT előregyártott gélen (12% Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). A fehérjéket polivinilidén-difluorid membránra vittük át (Thermo Fischer Scientific, 88518). 5 százalékos tejben 0,1 százalékos Tween-t tartalmazó Tris puffer sóoldatban (TBS-T) történő blokkolást követően a membránokat nyúl poliklonális anti-LC3(1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), nyúl poliklonális anti-ATG5-tel inkubáltuk. (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), tengerimalac poliklonális anti-szekvestoszóma 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), nyúl poliklonális anti-kalpain 1 domén IV (1:1000, Abcam,ab39170) ), nyúl poliklonális anti-kalpain 2 amino-terminális vége az I. doménnek (1:1000, Abcam, ab39165), egér monoklonális IgG1 anti-kalpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), nyúl anti-podocin (1:1000, Abcam, ab50339), tengerimalac anti-nephrin (1:500, PROGEN, GP-N2) és patkány monoklonális anti-tubulin (1:5000, Abcam, ab6160) antitest. Mosás után a membránokat torma-peroxidázhoz kapcsolt antitesttel (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077) inkubáltuk. A specifikus jelek kimutatását az ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) segítségével LAS 4000 készüléken (Fuji) végeztük. A számszerűsítéshez az ImageJ szoftverrel (National Institutes of Health) végzett denzitometriás analízist használtuk.

Vérnyomásmérés és fiziológiai felmérés

Az egerek szisztolés vérnyomását farokmandzsetta módszerrel (Visitech Systems Inc., BP-2000) rögzítettük. Minden egérről tíz mérést végeztünk, majd meghatároztuk az átlagértéket. A szisztolés vérnyomást a kiinduláskor (12 hetes korban), majd hetente mértük a kezelési időszak végéig. Valamennyi egeret metabolikus ketrecbe helyeztük, ahol szabadon hozzáférhetett a vízhez egy 6-órás vizeletgyűjtés céljából. A vizelet kreatinin és plazma karbamid koncentrációját spektrofotometriásan elemeztük kolorimetriás módszerrel (Olympus, AU400). A vizelet albumin kiválasztását specifikus enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal mértük az albumin mennyiségi meghatározására egérvizeletben (Crystal Chem, 80630).

Szövettan

A veséket összegyűjtöttük és 4% PBS-pufferolt formalinban rögzítettük. A paraffinba ágyazott metszeteket (3-um vastag) Masson-féle trikrómmal megfestettük a vese morfológiájának értékelésére. A vesékben fellépő rendellenességeket az összetevő-rendellenességek jelenléte és súlyossága alapján osztályozták, beleértve a glomerulosclerosis, a mesangialis expanzió, a tubuláris atrófiát vagy gipszet és a fibrózist. A szklerotikus glomerulusok arányát vesemetszetenként legalább 50 glomerulus vak vizsgálatával értékelték.

Vesemetszetek és primer podociták immunfluoreszcens festése

A rögzített primer podocitákat TBS-T 3 százalékos szarvasmarha szérumalbuminban blokkoltuk, és egy éjszakán át 4 fokon inkubáltuk tengerimalac anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) és nyúl anti-green antitestekkel. fluoreszcens fehérje (GFP; 1:500, Abcam, ab290). A TBS-T öblítések után fluoroforhoz konjugált másodlagos antitestek szamár anti-tengerimalac IgG AF594-konjugált antitestek (Jackson ImmunoResearch,706-585-148) és szamár anti-nyúl IgG AF488-konjugált antitestek ( Invitrogen, A21206) alkalmaztuk. A képek Zeiss 2 fluoreszcens mikroszkóppal, AxioCam HRc kamerával és Axiovision 4.3 szoftverrel készültek.

A formalinnal fixált paraffinba ágyazott (FFPE) vesék esetében a metszeteket (3 um) paraffinmentesítettük és hidratáltuk, és az antigén visszanyerését fűtött citrát pufferben (pH 6) végeztük. A metszeteket ezután Tritonnal 0,1 százalék (Euromedex) permeabilizáltuk, és TBS-T3 százalékos szarvasmarha szérumalbuminnal blokkoltuk, majd egy éjszakán át 4 fokon antitest inkubáltuk. Használtunk kecske anti-nefrint (1:100, PROGEN, GP-N2), tengerimalac anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), nyúl anti-GFP-t (1:1000, Abcam, ab290), kecske anti-podocalyxin (PODXL; 1:1000, Bio-Techne, AF-1556) és nyúl anti-Wilm-tumor 1 (WT1; 1:100, Abcam, ab192) antitest. A másodlagos antitestek az Invitrogentől származó Alexa 488- és Alexa 568- konjugált antitestek voltak. A sejtmagokat kékre festettük Hoechst segítségével. A tárgylemezeket fluoreszcens rögzítőközeggel (Dako, S3023) rögzítettük. A mikrofényképek Zeiss Axiophot fotomikroszkóppal és Axiovision szoftverrel készültek. A Fidzsi-szigeteken félautomata kvantifikációt használtunk a nephrin-pozitív és PODXL plusz területek mennyiségi meghatározására glomeruláris metszetenként legalább 30 glomeruluson egérenként. A podocitaszámot a WT1 plusz magok glomeruláris szakaszonkénti számaként számoltuk legalább 30 glomeruluson egérenként.

Transzmissziós elektronmikroszkópos eljárás

A vesekéreg kis darabjait (1 mm) 3 százalékos glutáraldehid EM fokozatban (Electron Microscopy Sciences) rögzítettük 1-3 0 napig, és háromszor mostuk PBS-ben. A mintákat 1%-os ozmium-te-troxidban 0,1 M (Electron Microscopy Science) 0,1 M PBS-ben (pH 7,4) utófixáltuk, és vízzel mostuk. A mintákat alkoholos minőségben és 100 százalékos propilén-oxidban dehidratáltuk (Electron Microscopy Science). A gyanta infiltrációját a következőképpen végeztük: keverjük össze az Epikote 812-t és a propilén-oxidot 1:1 arányban 30 percig, majd az Epikote 812-t és a propilén-oxidot 1:2 arányban keverjük egy éjszakán át szobahőmérsékleten. A mintákat 4 mm-es zselatin kapszulákba ágyaztuk 100 százalékos Epikote 812-ben, és 60 °C-ra melegített kemencében polimerizáltuk. Ultravékony metszeteket vágtunk UFC7 ultramikrotommal (Leica Microsystems GmbH), és Gilder Grids 200 mesh-re (Electron Microscopy Science) helyeztük el. Ezeket 7 százalékos uranil-acetáttal (LFG eloszlás) és Reynold-féle ólom-citráttal (LFG) ellenfestettük. A mintákat JEM1011 transzmissziós elektronmikroszkópban (JEOL) vizsgáltuk Orius SC1000 CCD kamerával (Gatan), amelyet Digi-talMicrograph szoftverrel (Gatan) működtettünk a felvétel céljából.

Kvantitatív polimeráz láncreakció tömb

A frissen izolált glomerulusokat QIAzol Lysis reagensben (Qiagen) -80 fokon lefagyasztottuk. A fenol alapú módszerrel végzett teljes RNS extrakciót a gyártó ajánlásai szerint dolgoztuk fel. A cDNS-eket az RT²First Strand Kit (Qiagen, 330401) segítségével szintetizáltuk, a valós idejű polimeráz láncreakciót (PCR) pedig egy Custom RT²Profiler PCR Array segítségével hajtottuk végre. Qiagen, CLAM36771C) RT'SYBR Green qPCR Mastermix-szel (Qiagen, 330502). A kvantitatív PCR-lemezeket Applied Bio-systems StepOnePlus ciklusgépen futtattuk. Mindegyik tömb minőség-ellenőrzést tartalmaz a reverz transzkripció hatékonyságára és a genomiális DNS-szennyeződésre vonatkozóan. A kvantitatív PCR-elemzés a 2-△△CT módszerrel, a GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen.com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) segítségével történt. és a génexpresszió Log2-szeres változásaként fejeződik ki.

In silico proteomikai elemzés

A kalpain hasítási hely in silico előrejelzését DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) és CaMPDB (http://) segítségével végeztük. calpain.org/)online eszközök. Az egérfehérje aminosavszekvenciáját az Uniprot-tól szereztük be (https://www.uniprot.org). Az eredményeket az S1 és S2 kiegészítő táblázatok folytatják.

statisztikai elemzések

Minden grafikon az egyedi értékeket és az átlagot ± SEM mutatja. A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism szoftver 9-es verziójával végeztük. Két csoport összehasonlítását parametrikus Student t-próbával végeztük, amikor a minták megfeleltek az Anderson-Darling és a D'Agostino normalitásteszten, valamint a varianciaegyenlőség F tesztjén. Egyébként nem paraméteres Mann-Whitney tesztet használtunk. A több csoport közötti összehasonlítást 1-módszer vagy 2-módú varianciaanalízissel, majd többszörös összehasonlítási teszttel végeztük Sidak korrekciójával. P értékei<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

1. ábra| Az angiotenzin I (Angel) plusz a magas sótartalmú étrend (HSD) által kiváltott magas vérnyomás gátolja a glomeruláris autofágiát. (ac)

Podocalyxin (PODXL;piros) és P62 (zöld) immunfluoreszcenciája vad típusú (WT) egerekből származó glomerulusokban (a,a'), WT egerekből (b,B) 6 hét Angel plusz HSD kezelés után, és (c) Nphs2.cre Atgsl/ox egerekből, amelyek a P62 felhalmozódását mutatják podocitákban magas vérnyomás alatt és podocita-specifikus ATG5-hiányos egerekben. A nyílhegyek a P62-t és a WT-ben lévő pontokat jelzik (a'). A sejtmagokat Hoechst-tel (kék) ellenfestettük. Az ábra-alrészek alapjellel nagyobb nagyítást jeleznek. Bar =50 μm. （d) A P62 plus kapcsolódó mennyiségi meghatározása a glomeruláris terület százalékában van kifejezve.n =4 WT egér és n=5 WT Angel plus HSD és Nphs2.cre Atgsoxlo egerek esetén. Az értékeket egyedi diagramok formájában mutatjuk be, és átlag ± SEM. Mann-Whitney teszt:*P= 0.0159.

Az Angel plusz magas sótartalmú étrend által kiváltott magas vérnyomás gátolta a podocita autofágiát

A podociták magas szintű autofágiát mutatnak in vivo, amint azt az erős GFP expresszió mutatja transzgenikus egerekben, amelyek GFP fúziója LC3-mal (GFP-LC3 egerek), amely az autofágia kulcsmarkere (kiegészítő S2A ábra). Az autofágia egy dinamikus folyamat, állandó autofagoszómák képződésével és az autofagolizoszómák lebomlásával. Az autofagoszómális lebontás blokkolása klorokinnal a GFP plusz pontok felhalmozódását eredményezte, ami magas autofág fluxust jelez a podocitákban (S2A és B kiegészítő ábra). Annak megerősítését, hogy a GFP plusz pontok autofagoszómák, kettős immunfluoreszcenciával mutatták ki a GFP és az SQSTM1/P62, az autofágia által lebontott chaperon fehérje esetében (S2C és D kiegészítő ábra). Ismét a klorokin kezelés indukálta a GFP plusz P62 plusz pontok felhalmozódását, ami fontos autofág fluxust mutatott a podocitákban. Végül a magas autofág fluxust in vitro megőrizték, amint azt a GFP-LC3 egerekből izolált primer podocitákban a GFP és a P62 expressziója, valamint a GFP plusz és a P62 plusz pontok erős felhalmozódása mutatja bafilomicin Al kezelés alatt, amely egy másik blokkoló az autofagoszómális lebomláshoz (S2E kiegészítő ábra). H).

A magas vérnyomás képességét a podocita autofág válaszok modulálására ezután AngII-vel infundált egerekben, magas sótartalmú diétával (HSD) 6 hétig, valamint nem hipertóniás kontrollokban értékelték. Amint az 1. ábrán látható, az AnglI plusz HSD P62-felhalmozódást indukált a glomerulusokban, erős akkumulációval a podocitákban, ami arra utal, hogy az Angl plusz HSD felelős a podocita autofágia blokádért (föld ábra). Érdekes módon a P62 felhalmozódása a podocitákban hasonló volt a podocita autofágia hiányában szenvedő egereknél megfigyelthez (Nphs2.cre Atg5'olox egerek). A hipertónia másik modelljében, a DOCA-só modellben szintén megfigyeltük a P62 progresszív felhalmozódását a podocitákban a podocitákban. a betegség időbeli lefolyása (S3 kiegészítő ábra).

Az Atg5 deléciója specifikusan a podocitákban fokozott albuminuriát, podocitaveszteséget és glomeruláris sérülést eredményez az Angel plus HSD modellben

Ezután megvizsgáltuk, hogy az autofágia blokád csak podocitákban (Nphs2.cre Atg5laxlox egerekben) befolyásolja-e a glomeruláris sérülést az AnglI plusz HSD modellben. Először megerősítettük, hogy az Nphs2. cre Atg5 egerek vérnyomása normális volt, veseműködésük normális volt, és 10 hónapos korukig nem voltak glomeruláris szövettani elváltozások, amint arról korábban beszámoltunk (Kiegészítő lox (WT) és Nphs2.cre Atgslox S4 ábra).2 Ezután az Atg5'cl egereket infúzióval adtuk be. AngII HSD-vel 6 hétig. Fontos, hogy a szisztolés vérnyomás hasonló volt a két csoportban az AnglI infúziót követően a vizsgálat során (2a ábra), bár a vérnyomás mérésére használt farokmandzsetta módszer nem biztos, hogy képes feloldani a kis vérnyomáskülönbségeket. A HSD-vel végzett Angl infúzió jelentősen növelte a vizelet albumin-kreatinin arányát WT egerekben, és ez a hatás szignifikánsan megnőtt egerekben (2b. ábra). A hipertóniás Nphs2.cre Atg5lox/lox Nphs2.cre Atgsoxlox egerek szignifikánsan megnövekedett glomeruláris szklerózist mutattak a WT alomtársakhoz képest (2c-e ábra). A mért proteinuriával összhangban a fehérjeszerű gipsz és a tubuláris dilatáció szignifikánsan gyakoribb volt az ATG5 podocita hiányában szenvedő egerekben (2f-h ábra).

A glomerulusonkénti podocitaszám szignifikánsan csökkent az Nphs2.cre Atg5loxloxban (2i-k. ábra). Podocita sérülés Nphs2.cre Atgsoxlo egerekben AngII infúzióval plusz HSD-vel, még fokális és szegmentális glomerulosclerosisig is fejlődött, amint azt a parietális hámsejt (PEC) expressziója mutatja. ) aktiválási marker CD44 a glomerulusokban (2l és m ábra). Az elektronmikroszkópos elemzés jelentős változásokat azonosított, amelyek az ATG5-hiányhoz kapcsolódnak a HSD-vel járó krónikus AngII infúzió során, beleértve a lábfej kiürülését… egerekben. Ezzel szemben kevés ultrahipertóniás Nph2. cre Atg5'oxlx szerkezeti hibákat találtak a WT egerekből származó podocitákban még 10 hetes HSD-vel végzett AngII infúzió után is (2n és o ábra), ami azt jelzi, hogy a podociták autofágiás aktivitása szükséges az Angel plusz HSD által kiváltott károsodással szembeni rezisztenciájukhoz. Összességében eredményeink azt mutatták, hogy az AnglIl plusz HSD modellben az autofágia gátlása súlyosbítja a podocita sérülését és elvesztését, és ezt követően fokális és szegmentális glomerulosclerosist indukál.

2. ábra: Az Atg5 specifikusan podocitákban történő deléciója az albuminuria, a vesekárosodás és a podocitaveszteség jelentős növekedését eredményezi 6 hetes angiotenzin Il (Angel) infúzió és magas sótartalmú diéta (HSD) után. (a) Szisztolés vérnyomás Atgslo/b és Nphs2.cre Ataslo egerekben 36 napon keresztül Angel plusz HSD.n =9 egér genotípusonként. Az értékeket átlag ± SEM formában adjuk meg. Kétirányú varianciaanalízis (ANOVA): ns. (bm),n =10 egérben genotípusonként. A(b,g,h,k)-ban az értékek egyedi diagramokként és átlag± SEM-ként jelennek meg.(b) Angel plusz HSD (folytatás)

3. ábra| Kalpain expresszió és aktivitás podocitákban.(a) Western blot a calpain-1.calpain-2 és calpain-4 expressziójának elsődleges podocitáiban. A tubulin expresszió normalizálásként szolgál. (b) A kalpainaktivitást angiotenzin ll-lel (Angel; 100 nM) kezelt vagy nem kezelt primer podocitákon mértük 24 órán keresztül calpeptinnel (10 uM) vagy anélkül, n =5 független kísérletben. Az értékeket egyedi diagramok formájában mutatjuk be, és átlag ± SEM. Egyirányú varianciaanalízis (ANOVA): kezelés, P=0.0035.Sidak többszörös összehasonlító tesztje:*P=0.0128 Angll versus alapvonalhoz," P=0.0056 for Angll plusz calpeptin versus Angll.(c) A kalpainaktivitást vad típusú (WT) vagy kalpasztatin transzgenikus (CST') egerek primer podocitáin mértük, akiket 24 órán keresztül Angel-lel (100 nM) kezeltek vagy nem. n {{18} } független kísérletek. Az értékeket egyedi görbékként és átlag ± SEM-ként mutatjuk be. Kétutas ANOVA párosítva a kezelési genotípushoz. P= 0.0483. Sidak többszörös összehasonlító tesztje:**P=0.0009 a WT-hez Szög az alapvonalhoz viszonyítva,*P=0.0420 a CST'9-hez Szög az alapvonalhoz képest, *P=0.0424 a WT-hez és a CST9-hez Angll.

Kérem kattintson ide a 2. részhez