1. rész: A Cistanche Herba cisztanozidja az oxidatív stressz elnyomásával javítja a hipoxia által kiváltott férfi reprodukciós károsodást
Mar 26, 2022
Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Absztrakt:Egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy a hipoxia a férfi meddőség oka, és a hipoxia összefügghet az oxidatív stresszel (OS). A cisztanozid (Cis) egy feniletanoid-glikozid vegyület, amely a CistanchesHerbából kinyerhető, és különféle biológiai funkciókkal rendelkezik. Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy megvizsgálja a Cis védő hatását a hipoxia által kiváltott reproduktív károsodásra, és feltárja a mögöttes specifikus mechanizmusokat. Sejtes és állati hipoxiás kísérleti modelleket építettünk, és a cis különböző altípusainak a hím reproduktív rendszerre gyakorolt védő hatását in vitro és in vivo is értékeltük. Az eredmények azt mutatták, hogy a hipoxia szignifikánsan csökkentette a GC-1 sejtek életképességét a sejtciklus leállása és az apoptózis aktiválása révén, ami a megnövekedett OS-hez kapcsolódik. Ezen túlmenően a Cis erős antioxidáns hatást mutatott mind in vitro, mind in vivo, jelentősen visszaállítva az antioxidáns enzimaktivitásokat. és csökkenti a reaktív oxigénfajták (ROS) szintjét, miközben növeli a sejtek életképességét és csökkenti az apoptózist. Fontos, hogy az itt vizsgált Cis altípusok (Cis-A, Cis-B, Cis-C és Cis-H) mind bizonyos antioxidáns hatásokat mutattak, amelyek közül a Cis-B hatása volt a legjelentősebb. Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a cisz jelentősen csökkenti a hipoxia által kiváltott OS káros hatásait azáltal, hogy befolyásolja az antioxidáns enzimaktivitást a herékben és a GC{7}}sejtekben.
Kulcsszavak: Cisztanozid, hipobárikus hipoxia, férfi meddőség, oxidatív stressz, reproduktív védelem
friss ciszterna növény
Bevezetés
Jelenleg világszerte körülbelül 48,5 millió (15 százalék) reproduktív korú pár érint meddőség [1], amelyek közül az esetek 40-50 százaléka a férfi meddőségnek tulajdonítható [2], amely állapot szorosan összefügg a környezettel és az életmóddal tényezőket. A bizonyítékok arra utalnak, hogy az emlőstest alacsony oxigénnyomásra való érzékenysége a férfi meddőség egyes formáinak okozója [3]. Amint azt a korábbi vizsgálatok kimutatták, a spermatogenezis károsodik és csökken, ha hipobárikus hipoxiának vannak kitéve [4-7].
A mögöttes mechanizmus feltárása érdekében tanulmányok kimutatták, hogy a hipobáriás hipoxiának való kitettség növeli a reaktív oxigénfajták (ROS) termelését [8, 9]. A ROS fontos szerepet játszik a férfiak reproduktív rendszerében. Alacsony szinten szükségesek a spermiumok kapacitációjához, az akroszóma reakcióhoz és a spermium-petesejtek fúziójához[10]. A túlzott ROS azonban spermiumnukleáris/mitokondriális DNS-károsodást és plazmamembrán-peroxidatív károsodást okozhat, amelyek a férfi meddőség megnövekedett kockázatának fő etiológiai tényezői [11, 12]. Így a hipoxia által kiváltott ROS felhalmozódása lehet a férfi meddőség egyik oka.
A Cistanches Herba egy évelő parazita gyógynövény, amely széles körben elterjedt száraz területeken [13], és farmakológiai hatásai miatt széles körben használják [14-17]. A Cistanches Herba összes hatékony tartalma közül a PhG-ket tekintették a fő hatóanyagnak. Eddig 34 PhG-t izoláltak Cistanches növényekből [13]. A Cistanoside (Cis), a Cistanches Herbából izolált anaktív PhG, antioxidáns hatása miatt kapott figyelmet.
Figyelembe véve a Cis antioxidáns hatásait és a ROS szerepét a hipoxia által kiváltott férfi meddőségben, a cis potenciális gyógyszerjelöltnek tekinthető a hipoxia által kiváltott férfimeddőség kezelésére. Azonban kevés jelentés foglalkozott a Cistanches Herbából kivont cis antioxidáns hatásaival a hipoxia által kiváltott férfi meddőség kezelésében, vagy az érintett jelátviteli útvonalakkal. Ebben a tanulmányban in vitro és in vivo hipoxia kísérleti modelleket építettek fel, és értékelték a különböző Cisre hatáskomponenseit.
Cistanche rendelkezik areproduktív termelési hatás.
Anyagok és metódusok
Sejtkultúra és reagens
A GC-1spg(GC-1) egér spermatogónia sejtvonalat az American TypeCulture Collection-től (ATCC) vásároltuk, és DMEM-ben (Invitrogen, USA) tenyésztettük 10 százalék borjúmagzati szérummal, 1 százalék L-val kiegészítve. glutamint (100 mM), penicillint (100 U/ml) és sztreptomicint (100 ug/ml) 37 fokos hőmérsékleten, párásított inkubátorban 5% CO2-val. A Cis-t (Cis-A, B, C, H) a Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd.-től (Kína) vásároltuk.
Sejtéletképességi vizsgálat
A sejtek életképességét sejtszámláló kit{{0}}assay (CCK-8) segítségével teszteltük. Röviden, a GC-1 sejteket lyukanként 1,5×103 96-lyukú lemezekre oltottuk, és 24 órán át 37 fokon tenyésztettük. Ezután a sejteket különböző koncentrációjú (20%, 15%; 10%; 5%) oxigénnel vagy különböző koncentrációjú (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) cisz-szel (Cis-A, Cis-B, Cis-C) kezelték. , Cis-H) a szükséges ideig. Ezután a felülúszót eldobták, és a sejtek életképességét CCK-8 kit (DojindoJapan) segítségével detektáltuk. Mindegyik lyuk abszorbanciáját 450 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval (BioRad USA). Végül a sejtek életképességét a következő képlet szerint számítottuk ki:
A sejtek életképessége=(ODkísérleti csoport – ODblank csoport)/(ODkontroll csoport – ODblank csoport) × 100 százalék.
Western blot analízis
Az összegyűjtött sejteket vagy szöveteket RIPA pufferben homogenizáltuk a fehérjék kivonására (RIPA BeyotimeKína; Koktél Roche Svájc). A felülúszókat összegyűjtöttük, és a fehérjék koncentrációját BCA módszerrel (Beyotime) teszteltük. Az egyes mintákból körülbelül 40 ug extrahált fehérjéket SDS-PAGE-val választottunk el, és elektrotranszferáltunk nitrocellulóz (NC) szűrőmembránra (BeyotimeChina). Az NC szűrőmembránokat 5 százalék zsírmentes tejjel blokkoltuk 1,5 órán keresztül, és specifikus antitestekkel inkubáltuk (anti-PARP 1:1000, anti-kaszpáz-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; az összes antitestet a Cell Signaling Technology-tól (USA) vásároltuk egy éjszakán át 4 fokon. Ezután az összes NC membránt a megfelelő torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitesttel inkubáltuk 1,5 órán keresztül szobahőmérsékleten, és képalkotó rendszerrel (Tannon, Kína) leképeztük.
citanche kivonat por kiegészítők
Sejtciklus kimutatása
A sejtciklus elemzésére áramlási citometrikus vizsgálatot (FCM) végeztünk. A sejteket különböző körülmények között kezeltük 72 órán át, majd összegyűjtöttük. A sejteket ezután PBS-sel mostuk, 75%-os etanolban fixáltuk, és propidiumiodiddal (PI) festettük. Minden mintához 1 × 104 sejtet gyűjtöttünk, és áramlási citometriával elemeztük (FACSCalibur, BD Biosciences). Ezután kiszámítottuk a G1/S/G2 fázisú sejtek arányát és a proliferációs indexet [Fázis(S+G2)/Fázis(G1+S+G2) × 100 százalék].
Ki-67 festés
A sejteket konfokális edényben tenyésztettük, és hipoxiával vagy a Cis különböző altípusaival kezeltük 72 órán keresztül. Miután az összes sejtet 4 százalékos paraformaldehiddel rögzítettük, anti-Ki-67 antitesttel (1:200, Cell Signaling Technology) inkubáltuk. Ezután az összes sejtet megfelelő CY-3-konjugált anti-nyúl IgG antitesttel (1:200, Boster, Kína) és DAPI oldattal (1,0 ug/ml, Beyotime) inkubáltuk. A fluoreszcenciát Fluoview FV1000 konfokális mikroszkóppal (Olympus, Japán) figyeltük meg.
ROS észlelése
Az FCM-et az intracelluláris ROS szint mérésére vezették be DCFH-DA segítségével. A felfüggesztett sejteket 6-lyuklemezekre oltották, és különböző kezeléseknek vetették alá. 72 órás kezelés után a sejteket szérummentes DMEM-ben szuszpendáltuk 10 μM DCFH-DA-val (Beyotime). A ROS-tartalmat ezután fluoreszcenciával aktivált sejtválogatással határozták meg Beckman Coulter Flow CytometrySystem-en, 488 nm gerjesztési hullámhosszú és 525 nm emissziós hullámhosszúsággal [18].
Lipid-peroxidáció (LPO) meghatározása
Az LPO kimutatására tiobarbitursavval reaktív anyagok (TBARS) vizsgálatot végeztek. Az összes műveleti lépést az utasításoknak megfelelően (Sigma USA) végeztük. A koncentrációkat 1,56×105/(M·cm) moláris extinkciós együtthatóval számítottuk ki, amelyet malondialdehid standard felhasználásával kaptunk. Az eredményeket nmol MDA-ekvivalens/mg fehérje értékben fejezzük ki.
Az enzimaktivitások meghatározása
Az enzimaktivitásokat glutation-reduktázt (GR), glutation-peroxidázt (GPx) és szuperoxid-diszmutázt (SOD) tartalmazó tesztkészletekkel tesztelték. Minden műveleti lépést a mellékelt utasításoknak megfelelően hajtottak végre (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute China).
Állatok és kísérleti protokoll
Kifejlett hím Wistar patkányokat (180-220 g, 8 évesek) a Kínai Xi'an állambeli Negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem állatorvosi központjától szerezték be. Az állatok felhasználására az egyetemi etikai bizottság engedélyt kapott (hivatkozási szám). : 20190506). Az állatkísérletet a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó egyetemi irányelvek szerint végeztük.
Minden patkánynak hagytuk alkalmazkodni körülbelül egy hétig a kísérlet megkezdése előtt. Az akklimatizáció után a patkányokat véletlenszerűen 6 csoportba osztottuk, mindegyik csoportban 5 állat volt. A kontrollcsoport patkányait normál nyomáson (PO2: 20 százalék; légnyomás: 101,3 kPa), míg a modellben és a cisztral kezelt csoportban lévő patkányokat alacsony nyomású oxigénkamrában (61,6 kPa belső nyomás, ami megfelel 4000 méteres tengerszint feletti magasságban; PO2: 14,55 százalék), hogy szimulálja a magaslati hipoxiás környezetet. Minden patkány szabadon hozzáférhetett az élelemhez és a vízhez műanyag ketrecekben 22±2 fokos és páratartalom mellett, automatikus 12-h világos/sötét ciklussal. A modellben és a Cis-szel kezelt csoportban a patkányok hipobárikus körülmények között maradtak, de 96 óránként tonormobár körülmények között helyezték át őket, ekkor táplálékot és vizet biztosítottak számukra, és a ketreceket megtisztították. A hipobárból a hipobáriába való átmenet időtartama körülbelül 2 óra volt. Minden kezelt csoportot a megfelelő Cis-szel (8 mg/kg/nap) kezeltünk orális szondán keresztül 8 hétig, míg a kontroll- és modellpatkányokat azonos térfogatú vízzel.
8 hét elteltével a patkányokat altatásban leöltük. A heréket, a mellékheréket és az ondóhólyagokat elválasztottuk és lemértük, és az organindexet a következő képlet szerint számítottuk ki: (szerv/állat tömege) × 100 százalék. Ezt követően a mellékherékben lévő spermiumokat összegyűjtöttük, és megvizsgáltuk motilitását és akroszomenzim aktivitását. Hasonlóképpen hereszöveteket gyűjtöttünk a hisztopatológiai vizsgálatokhoz, valamint a ROS, LPO és antioxidáns enzimaktivitás kimutatásához.
Az élő spermiumok arányának értékelése
Az epididimiszt sebészeti ollóval bemetszették, és a spermium szuszpenziót normál sóoldatban elkészítettük. Az élő spermiumok arányának értékeléséhez 5 μl spermiumszuszpenziót gondosan összekevertünk azonos térfogatú eozin-Ystain-nel. A spermiumokat ezután fénymikroszkóp alatt megszámoltuk. Az élő spermiumok arányát a festett (elhalt spermium) és a festetlen spermiumok (élő spermiumok) kiszámításával is értékelték.
Cistanche tubulosa pornöveli aélő spermiumok aránya.
További információért kattintson ide.
A spermiumok akroszóma enzimaktivitásának meghatározása
A spermium akroszóma enzimaktivitás vizsgálatát a sperma akroszóma enzimek értékelésére használták [19]. Az egyes csoportok eredményeit a következő képlettel számítottuk ki: Akroszóma enzimaktivitás (μIU)=(ODExperimentgroup - ODBlank group)/(247,5×10) × 106.
Statisztikai analízis
Az összes mennyiségi adatot átlag± SD-ben fejeztük ki, és az SPSS 22.{1}} szoftverrel elemeztük. Független Student t-próbát használtunk a két csoport adatainak összehasonlítására. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
