1. rész: Az Alzheimer-kórral kombinált csontritkulás egyidejű kísérleti modelljének felállítása patkányokban, valamint a Cistanche Tubulosa-ból származó echinakozid és akteozid kettős hatása
Mar 24, 2022
Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ABSZTRAKT
Etnofarmakológiai jelentősége: Cistanche tubulosaértékes hagyományos kínai orvoslás, amelyet széles körben alkalmaznak a csontritkulás és aAlzheimer kór. Echinakozidés az akteozid a Cistanche tubulosa fő aktív összetevői, amelyek kutatási értékű farmakológiai aktivitással rendelkeznek. Beszámoltak arról, hogy az echinakozid ésakteozidjavíthatja a tanulási és memóriaképességet, elősegítheti az oszteoblasztok proliferációját és differenciálódását. A vizsgálat célja: Echinacoside és acteozid fromCistanche tubulosaszignifikáns csontritkulás és Alzheimer-kór elleni hatást mutattak, miközben ezeket a hatásokat egyidejűleg nem vizsgálták patkánymodellben. A tanulmány célja az volt, hogy felállítsa és igazolja a csontritkulás modelljét kombinálvaAlzheimer kórpatkányokban és a kettős hatások vizsgálatáraechinakozidés az akteozid ezen a párhuzamos modellen.
Anyagok és metódusok:Három modellcsoportot állítottunk be: ovariectomiát (OVX), álműtétet D-galaktózzal és AlCl3-mal (D), ovariectomiát D-galaktózzal és AlCl3-mal (OVX plusz D). A gyógyszeres kezelési csoportokban lévő patkányokat petefészek-eltávolították. A D-galaktóz intraperitoneális injekciója és az AlCl3 intragasztrikus beadása során a gyógyszeres kezelési csoportok patkányainak orálisan adták be a patkányokat.echinakozid(90 mg/kg/nap),akteozid(90 mg/kg/nap), illetve az ösztradiol-valerát (0.6 mg/kg/nap), donepezil HCl (0,8 mg/kg/nap) pozitív kontroll gyógyszerei. A 8 hetes gyógyszeres kezelés után először 6 napig Morris Water Maze (MWM) tesztet végeztek. A patkányokat ezután feláldozták a vér, a méh, a combcsont, a sípcsont és az agyszövetek összegyűjtése céljából. A szérumot biokémiai vizsgálatokhoz használták. A méheket hisztomorfometriához használták. A jobb combcsontot mikro-CTés hisztomorfometria, ill. A biomechanikai teszthez a jobb sípcsontot használtuk. A jégszekrényen összegyűjtött hippocampust biokémiai vizsgálatokhoz használták fel. A perfúzióval gyűjtött agyat 41 használtuk a hisztomorfometriához.
Eredmények:A Sham csoporthoz képest az OVX plusz D csoport jelentősen csökkentheti a tanulási és memóriaképességet azáltal, hogy oxidatív károsodást okoz, károsítja a neuronokat a hippocampusban, és befolyásolja az acetilkolin hidrolízisét és szintézisét. Eközben a BALP és a TRAP aktivitása az OVX plusz D csoportban jelentősen megnőtt (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinakozidésakteozid, a csontritkulás tipikus kóros jellemzői ésAlzheimer kórjavítottak.
Következtetések:A csontritkulás modellje kombinálvaAlzheimer kórpatkányokban megvalósítható és sikeresen bevezetett.Echinakozidés az akteozid is mutatott néhány szignifikáns hatást erre a párhuzamos modellre, és 56 potenciális jelölt lehetCistanche tubulosakettős hatásokkal a további tanulmányozáshoz.
Kulcsszavak:csontritkulás; Alzheimer kór; kettős hatás; echinakozid; akteozid; Cistanche tubulosa
CAz istanche elveszett birodalma gyógynövényei enyhítik az Alzheimer-kórt
1. Bemutatkozás
Az oszteoporózis egy degeneratív csontbetegség, amelyet a csonttömeg fokozatos elvesztése és a mikroarchitektúra pusztulása jellemez, ami növelheti a törékeny törések kockázatát (Rachner et al., 2011).Alzheimer kórAz (AD) az idősek gyakori neurodegeneratív betegsége, amelyet folyamatos mentális hanyatlás, kognitív károsodás és klinikailag az önálló életképesség elvesztése jellemez (Reitz 76 et al., 2011). Az -amiloid lerakódás által kiváltott szenilis plakkok kialakulása, a tau hiperfoszforiláció által okozott neurofibrilláris gubancok és az agyi neuronok degenerációja az AD tipikus kóros jellemzői (Serrano-Pozo et al., 2011). Felületesen az OP és az AD teljesen független betegségek, eltérő patológiával és klinikai jellemzőkkel. A klinikai gyakorlatban azonban gyakran megfigyelhető az OP és az AD együttes előfordulása (Zhang és mtsai, 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus és mtsai, 2009). Mindkét betegség prevalenciája nőtt az életkorral, különösen a posztmenopauzás nőknél (Li et al., 2017; Stern, 2012). Egyre több bizonyíték utal arra, hogy az AD-vel diagnosztizált embereknél fokozott az OP kockázata (Zhou et al., 2014).
Szükséges az összefüggések tanulmányozása és tisztázása a csontritkulás ésAlzheimer kórin vitro és in vivo. Az in vivo vizsgálatok elvégzése előtt fontos kiválasztani a csontritkulás vagy az Alzheimer-kór alkalmazható állatmodelljeit. Az oszteoporózis modell többféle módszerrel is létrehozható, például retinsav intragasztrikus adagolásával, ovariectomiás műtéttel és glükokortikoidok intramuszkuláris injekciójával (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Különösen a patkányokban végzett petefészek-eltávolítással indukált posztmenopauzális osteoporosis modell volt klasszikus ésA legtöbb tanulmányban széles körben alkalmazták (Miao et al., 2012; Liu és mtsai, 2017).A szórványos Alzheimer-kór az Alzheimer-kór fő típusa. Az állatSporadikus modellekAlzheimer kórkülönböző módszerekkel indukálható, mint plD-galaktóz injekció ill -amiloid, AlCl intragasztrikus adagolása3,stb(Bagheri et al., 2011; Gao és mtsai, 2015; Justin Thenmozhi és mtsai, 2017). Ezen kívül aAz Alzheimer-kór konjunkciós modellje, amelyet hosszú távú intraperitoneális indukálA D-galaktóz injekciót petefészek-eltávolítással kombinálva szintén sokat tanulmányozták (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). A csontritkulás jelentőségének feltárása érdekében ésAlzheimer-kór, szükséges létrehozni a modell a csontritkulás kombináltAlzheimer-kórral, hogy tanulmányozzák a gyógyszerek közös mechanizmusaitcsontritkulás ésAlzheimer-kórase.
Cistanche tubulosa(Schenk) A Wight egy élősködő növény, amely főként Északnyugat-Kína sivatagaiban honos. A szárított zamatos száraCistanche tubulosa(CT) híres tonizáló gyógyszerként használják, Cistanches Herba néven, a kínai gyógyszerkönyvben Roucongrong néven (2015). A "sivatagok ginzengejeként" tisztelték, és széles körben használják a derék- és térdfájdalmak, a női sterilitás és a székrekedés kezelésére a hagyományos kínai orvoslásban (Jiang és Tu, 2009). A CT fő aktív összetevői a fenil-etanol-glikozidok (PhG-k), az echinakozid (ECH) ésakteozid(ACT) a reprezentatív vegyületek a PhG-kben (Morikawa et al., 2014). Különösen az ECH-t és az ACT-t választják a CT minőség-ellenőrzési markereiként magas tartalmuk és különféle farmakológiai hatásuk miatt, mint például a neuroprotekció, a csontvédelem,
antioxidánsok, öregedésgátló, valamint a tanulási és memóriaképesség javítása (Wang et al.,2012; Li és mtsai, 2016). Azonban az ECH és az ACT hatása a csontritkulásratársítva valamivelAlzheimer kórmég nem tanulmányozták együtt patkánymodellben.Így ennek a vizsgálatnak a célja az volt, hogy létrehozzuk a kombinált csontritkulás patkánymodelljétAlzheimer-kórral, és fedezze fel annak hatásaitechinakozidés ezen az akteozidpárhuzamos modellt, hogy kísérleti bizonyítékot szolgáltasson a további tanulmányozáshozAz echinakozid vagy akteozid molekuláris mechanizmusa a következő kutatásban.
cistanche pharma specialszámáraHIRDETÉS
2. Anyagok és módszerek
2.1. Állatok
Nyolcvan, 8-hetes nőstény Wistar patkányt (tanúsítványszám: SCXK 2018-0006), súlyuk 180-200 g, a kínai-brit SIPPR/BK Lab-tól szereztük be. Animal Ltd (Sanghaj, Kína), és a Kínai Gyógyszerészeti Egyetem Gyógyszerészeti Állatok Kísérleti Központjában nőtt fel.
2.2. Vegyszerek és reagensek
A klórhidrátot, a penicillin G-nátriumot, a D-galaktózt, az alumínium-klorid-hexahidrátot, az ösztradiol-valerátot, a donepezil-HCl-t az Aladdin Industrial Corporation-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk.Echinakozid(HPLC 94 százalék) a Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd.-től (Chengdu, Kína) szereztük be.Acteozid(HPLC 98 százalék) a Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.-től (Baoji, Kína) vásároltuk. Csontspecifikus alkalikus foszfatáz (BALP), tartarát-rezisztens savas foszfatáz (TRAP), szuperoxid-diszmutáz (SOD), malonaldehid (MDA), acetilkolinészteráz (AChE) és kolin-acetil-transzferáz (ChAT) enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati kit (ELISA) volt. vásárolt a Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd.-től (Sanghaj, Kína). Univerzális szövetrögzítőt szereztünk beChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kína).
echinakozid
2.3. Állatmodellek és kezelések
Az összes állatkísérletet a Kínai Gyógyszerészeti Egyetem Állat-etikai Bizottsága engedélyezte és felügyelte. A patkányokat 12 órás világos/sötét ciklusban tartottuk egy szabályozott hőmérsékletű szobában (22±2 fok), és standard pelletált takarmány- és csapvízzel etettük.
Az egyhetes adaptációt követően petefészek-eltávolítással sikerült elérni a csontritkulás modelljét (French et al., 2008). A műtét befejezése után egy alkalommal penicillin G-nátriumot szórtunk a sebvarratra a fertőzés megelőzése érdekében. A patkányokat ezután három hétig normálisan tápláltuk. A hivatkozás szerint (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017) a modellAlzheimer kórD-galaktóz hosszú távú intraperitoneális injekciójával ovariektómiával vagy AlCl3 hosszú távú intragasztrikus beadásával indukálható. Az Alzheimer-kórral kombinált csontritkulás modelljének megvalósíthatóságának tanulmányozásához három modellcsoport ovariectomia (OVX csoport), álműtét 150 mg/kg/nap D-galaktóz intraperitoneális injekcióval és 30 mg/kg/nap AlCl3 intragasztrikus adagolása. (D csoport), petefészekeltávolítást 150 mg/kg/nap D-galaktóz intraperitoneális injekcióval és 30 mg/kg/nap AlCl3 intragasztrikus adagolással (OVX plusz D csoport) határozták meg ebben a vizsgálatban.
Ezért a patkányokat véletlenszerűen nyolc csoportra osztották (minden csoportban n{{0}}) 3 hét elteltével, és 8 hétig szájon át gyógyszerekkel kezelték őket: Ál-csoport; OVX csoport; D csoport; OVX plusz D csoport; ösztradiol-valerát kezelési csoport (EV-csoport, OVX plusz D plusz 0,6 mg/kg/d ösztradiol-valerát); donepezil HCl kezelési csoport (DPZ csoport, OVX plusz D plusz 0,8 mg/kg/nap donepezil HCl);echinakozidkezelési csoport (ECH csoport, OVX plusz D plusz 90 mg/kg/nap echinakozid);akteozidkezelési csoport (ACT csoport, OVX plusz D plusz 90 mg/kg/nap akteozid). A Human-Rat Equivalent Dose Conversion Principle és a kapcsolódó referencia dózisa (Li et al., 2013; Gao et al., 2014) szerint a vizsgálatban szereplő gyógyszeres kezelési csoportok adagjait elfogadták.
Minden patkány testtömegét hetente megmértük. A teljes, 8 hétig tartó gyógyszeres kezelés után először 6 napig Morris Water Maze (MWM) tesztet végeztek. Ezt követően minden csoportból 6 patkányt leöltünk, hogy begyűjtsük az anyagokat. A patkányokat 30 ml/kg 10%-os klorálhidrát intraperitoneális injekciójával érzéstelenítettük, és vért vettünk az aorta hasüregéből. A vért szobahőmérsékletre helyeztük, hogy megalvadjon, és 3500 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 10 percig. A szérumot egy 1,5 ml-es centrifugacsőben (NEST Biotechnology) gyűjtöttük össze, és -80 fokon tároltuk a biokémiai vizsgálatokhoz való felhasználásig. Ezután összegyűjtöttük a méhet, a combcsontot, a sípcsontot és az agyszöveteket. A méheket hisztomorfometriához használták. A jobb combcsontot használtuk a Micro-CT-hez, illetve a hisztomorfometriához. A biomechanikai teszthez a jobb sípcsontot használtuk. A jégszekrényen összegyűjtött hippocampust biokémiai vizsgálatokhoz használták fel. Ezt követően mindegyik csoportból a másik három patkányt szívből perfundáltuk sóoldattal és univerzális szövetrögzítővel, hogy begyűjtsük az agyat hisztomorfometriához.
2.4. Morris Water Maze (MWM) teszt
A patkányokat 8 hetes beavatkozás után térbeli referencia tanulásnak és memóriatesztnek vetettük alá az MWM tesztben. Az MWM-tesztet a korábban ismertetett módszerek szerint végezték el (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Röviden, 5 egymást követő napon, napi négy próbával, a patkányokat arra nevelték, hogy különféle, a medence falán elhelyezett vizuális jeleket használják, hogy egy kör alakú medencében (130 cm átmérőjű) egy rejtett víz alatti platformot (11 cm átmérőjű, 29 cm magasságú) találjanak, magassága 50 cm) nem mérgező széntintával színezett vízzel töltve. A medencét képzeletben négy kvadránsra osztották, és négy kiindulási pozíciót helyeztek el a kvadránsok metszéspontjában. A platform az egyik kvadráns közepén helyezkedett el, és a helyzet állandó volt a kísérletek során. Mindegyik kísérletben a patkányokat véletlenszerűen kiválasztott helyekre helyezték el, a medence fala felé nézve. Minden kísérletet akkor fejeztünk be, amikor a patkány elérte a platformot, vagy 60 másodperc elteltével, és az eltelt időt menekülési késleltetésként rögzítettük. A patkányokat, akik nem értek el az emelvényre, rávezették. Minden rejtett platformos próba után a patkány 10 másodpercig a platformon maradt. Az edzés eredményeként napi négy kísérlet átlagos látenciaidejét számítottuk ki. A 6. napon az összes patkányt szondavizsgálatnak vetettük alá, amelyben 60 másodpercig úsztak a medencében, platform nélkül. Végeredményként a peron helyén áthaladási időt és a célkvadránsban való utazási időt rögzítettük. A patkányokat közvetlenül a medence feletti mennyezetre szerelt kamerával figyelték, és az összes kísérletet a MORRIS MAZE program segítségével elemezték, amelyet a Beijing Zhongshidichuang Science and Technology Development Co., Ltd. (Peking, Kína) biztosított.
2.5. Biokémiai teszt ELISA-val
Az ELISA készletek gyártói előírásai szerint a csontspecifikus alkalikus foszfatáz (BALP) aktivitást, a tartarát-rezisztens savas foszfatáz (TRAP) aktivitást, a szuperoxid-diszmutáz (SOD) aktivitást és a szérum malondialdehid (MDA) tartalmát a BioTek Synergy tesztelte. 2 többmódú mikrolemez-olvasó (BioTek, USA). Az egyes csoportok hippocampus szöveteit PBS-sel (0,01 M, pH 7,4) mostuk, hogy eltávolítsuk a vért vagy a szövetfelszínen maradt szennyeződéseket. Az egyik oldalon lévő hippocampus szöveteit lemértük, majd a lehető legkisebb darabokra vágtuk. A hippocampus szöveteit 1:9 arányban homogenizáltuk (szövettömeg: PBS térfogat). A homogenizátumot 4 fokon, 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 15 percig. A felülúszót összegyűjtöttük és hígítottuk a fehérjekoncentráció BCA-módszerrel történő mérésére. A hippocampus szövet acetilkolinészteráz (AChE) aktivitását, kolin-acetiltranszferáz (ChAT) aktivitását, szuperoxid-diszmutáz (SOD) aktivitását és malondialdehid (MDA) tartalmát ELISA módszerekkel teszteltük.
2.6. Hippocampus hisztomorfometria
Az agyszöveteket (n=3/csoport) univerzális szövetrögzítőben rögzítettük. Az agyszövet-mintákat ezután mostuk, gradiens etanollal dehidratáltuk, paraffinviaszba ágyaztuk, és 5 μm-es koronális metszetekre vágtuk. A metszeteket hematoxilinnel és eozinnal (HE) festettük. Ezt követően fordított fluoreszcens mikroszkóppal (Nikon, Japán) lefényképeztük az agyszövetek koronális metszeteit. Különösen megfigyelhető volt a CA1, CA2, CA3 és DG morfológiai változása a hippocampusban.
2.7. Méh hisztomorfometria és morfometria
A kiválasztott méheket (n{{0}}/csoport) univerzális szövetfixálóval rögzítettük. A méhszövetmintákat ezután mostuk, gradiens etanollal dehidratáltuk, paraffinviaszba ágyaztuk, és 5 μm-es keresztmetszetekre vágtuk. A metszeteket hematoxilinnel és eozinnal (HE) festettük. A méh keresztirányú metszeteit megfigyeltük és lefényképeztük. Véletlenszerűen öt látómezőt választottunk ki, majd Image-Pro Plus 6.0 szoftverrel megmértük a méh keresztmetszetének átmérőjét és a méh nyálkahártya hám vastagságát. Megszámoltuk a lamina propriában lévő méhmirigyek számát is.
2.8. Mikro-CT
A kiválasztott jobb combcsontot (n=3/csoport) olyan helyzetben vizsgáltuk, ahol a tárgy távolsága a forrástól 121 mm, a kamera távolsága a forrástól pedig 171 mm a SkyScan 1176 micro X- segítségével. sugárkomputertomográfia (mikro-CT) szkenner (Bruker, Németország). Referencia felületként a disztális növekedési lemezt választottuk. A referenciafelület alatt 1 mm távolságban egy 1,8 mm vastag területet választottunk ki a vizsgált térfogatnak (VOI, 100 réteg). Az eredményül kapott szürkeárnyalatos képek pixelmérete 17,76 μm volt a csontrekonstrukcióból (65 kV, 385 μA). Félautomata kontúrozási módszert alkalmaztak a trabekulák kiválasztására a kérgi csontból. Közvetlen 3D mérési módszereket alkalmaztunk a csonttérfogat százalékos (BV/TV), csontfelszíni sűrűség (BS/TV), trabekuláris szeparáció (Tb. Sp), trabekuláris szám (Tb. N), trabekuláris vastagság (Tb. Th) meghatározására. , szerkezeti modell index (SMI), trabekuláris mintázat faktor (Tb. Pd) és átlagos csontsűrűség (átlagos BMD) ugyanazon VOI esetén, aCTElemző program (Bruker, Németország). A VOI 3D-s megjelenítése adaptív renderelő algoritmus segítségével a CTvol szoftverrel (Bruker, Németország) történt.
cistanche növényi kivonat
2.9. Csont hisztomorfometria
A kiválasztott jobb combcsontot (n=3/csoport) univerzális szövetrögzítőben rögzítettük, majd 10 százalékos EDTA-2Na oldatban vízkőtelenítettük 3 hétig. A vízkőmentesített mintákat megmostuk, gradiens etanollal dehidratáltuk, paraffinviaszba ágyaztuk, és 5 μm-es hosszmetszetekre vágtuk. A metszeteket hematoxilinnel és eozinnal (HE) festettük. A combcsont hosszanti metszeteit fényképeztük. Megfigyeltük az egyes csoportok csontszöveti struktúráit, különösen a trabekuláris csontstruktúrákat.
2.10. Biomechanikai teszt
A véletlenszerűen kiválasztott jobb sípcsontokat (n=4/csoport) egy univerzális vizsgálógép segítségével (SHIMADZU, Japán) értékeltük a hárompontos hajlítási teszthez. Ezen minták átmérőjét nóniuszos tolómérővel mértük 2.16-2.38 mm (d) tartományban. A mintát ezután két támasztó keresztrúdra helyezték 25 mm (L) távolsággal a két sín között, és a minta fiziológiás görbülete felfelé irányult. A terhelés terhelő rúdja a próbatest közepén helyezkedett el, és állandó, 1,5 mm/perc sebességgel ejtett, amíg a minta el nem tört. Az erő (F) és az elmozdulás adatait automatikusan rögzítettük a vizsgálógéphez csatlakoztatott számítógépbe, és egyidejűleg felrajzoltuk a terhelés-deformációs görbét. A maximális terhelés (N) és az energiaelnyelés (mJ) értékeit a TRAPEZIUM X anyagvizsgáló szoftver egyidejűleg rögzítette. A maximális feszültség (MPa) értékeit a következő képlet alapján számítottuk ki: Feszültség (σ)=hajlítónyomaték (M) / Metszettényező (Z)=(8×L×F) / ( π×d3 )
2.11. Statisztikai analízis
A modellcsoportok eredményeit a Sham csoporttal, a gyógyszerrel kezelt csoportokat pedig az OVX plusz D csoporttal hasonlítottuk össze. Az adatokat egyutas ANOVA-val, majd Bonferroni többszörös összehasonlító tesztjével elemeztük a Graph Pad Prism 5.{3}} szoftverrel. Az adatokat átlag ± SD-ben fejeztük ki, és a 0,05-nél kisebb P-értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.
miricetinéscistanche
