Absztrakt

A regeneratív gyógyászat, mint új terápiás megközelítés egyre nagyobb figyelmet kapott a vesebetegségek kezelésének szűkössége miatt. Figyelemre méltóak a humán indukált pluripotens őssejtek (hiPSC) felhasználásával végzett vese-regeneráció terén elért közelmúltbeli előrelépések. A vesefejlődés ismerete alapján a hiPSC-k kétféle embrionális vese progenitor sejtre, nephron metabolikus progenitor sejtre (NPC) és ureter bimbóra (UB) differenciálódnak, amelyek képesek nefronokat generálni és ductus-szerű szerveket összegyűjteni. Ezenkívül ezekből a hiPSC-eredetű progenitor sejtekből humán veseszövet állítható elő, amelyekben az NPC-eredetű glomerulusok és tubulusok, valamint az UB-eredetű gyűjtőcsatornák kapcsolódnak egymáshoz. Az indukált veseszövet tovább vaszkularizálódik immunhiányos egerekbe történő transzplantáció után. A transzplantációhoz szükséges vese-rekonstrukció mellett a hiPSC-eredetű NPC-vel végzett sejtterápia javítja az akut vesekárosodást (AKI) egerekben. A betegség-specifikus hiPSC-ket használó betegségmodellezési és gyógyszerkutatási tanulmányokat szintén erősen alkalmazták olyan refrakter vesebetegségekben, mint az autoszomális domináns policisztás vesebetegség (ADPKD). A vesebetegségekkel kapcsolatos szövődmények kezelésére hiPSC-eredetű eritropoetint (EPO) termelő sejteket sikerült előállítani a vesevérszegénység gyógyszerkutatására és sejtterápiák kifejlesztésére. Ez a cikk a vesefejlődésbiológia és a vesebetegségek regeneratív gyógyászatának jelenlegi és jövőbeli perspektíváit tekinti át az iPSC technológián alapuló.

Kulcsszavak

iPSC ;Veseregeneráció ;Nephron progenitor sejt;Ureterius bimbó;Sejtterápia ; Betegség modellezés;Cistanche tubulosa

Bevezetés

A vesebetegség óriási orvosi problémát és gazdasági terhet jelent világszerte, de a donorszerv súlyos hiánya miatt a veseátültetésen kívül kevés kezelési lehetőség kínálkozik. Az egyik megoldás a regeneratív gyógyászati ​​stratégiák kidolgozása humán pluripotens őssejtek (hPSC-k), például embrionális őssejtek (hESC) és indukált pluripotens őssejtek (hiPSC) felhasználásával. Mivel a hPSC-k korlátlan ideig képesek szaporodni és bármilyen sejttípussá differenciálódni, beleértve a vesesejteket is, várhatóan sejtforrásként szolgálnak majd a regeneratív gyógyászatban, például a vese-rekonstrukcióban és a sejtterápiában. Ezenkívül a betegség-specifikus hPSC-k, amelyek genetikailag hajlamosak specifikus betegségek okozására, felhasználhatók olyan kórtani elemzések és gyógyszerkutatási modellek kidolgozására, amelyekben a hPSC-ktől differenciált sérült sejttípusok in vitro replikálják a betegség fenotípusait. Ebben a cikkben összefoglalom a fejlődésbiológiai alapú veseregenerációs kutatás legújabb eredményeit, és leírom a regeneratív gyógyászat és a vesebetegségek betegségmodellezésének jövőbeli kilátásait.

Kattintson ide a vásárláshozCistanche tubulosa kivonat

A vese fejlődése

A vese a korai embrionális blastodermából, az intermedier mezodermából (IM) származik (1a. ábra). Gerinceseknél az IM három vesét eredményez egymás után, az elsődleges, a közbenső és a hátsó vesét (1b. ábra). A középső vese a halak és kétéltűek felnőtt veséje, a hátsó vese pedig a hüllők, madarak és emlősök felnőtt veséje. Bár ez a három vese hasonló, mert nefronokból állnak, amelyek a vese funkcionális egységei, de eltérő számú nefronjuk van. A kifejlett emlős vese posztnefronja két embrionális szövetből áll, a posztnefris mesenchymából (MM) és az ureter bimbójából (UB; 1.c ábra). az MM a felnőtt vese nefronját és mesenchymáját alkotja, az UB pedig differenciálódik, és az alsó húgyutat képezi a gyűjtőcsatornától a hólyag egy részéig.

1. ábra: Vese vonalsejtek irányított differenciálódása. ac Sematikus rajzok, amelyek a mezoderma specifikációját (a), három vese kialakulását (b) metanephros fejlődését (c) mutatják. IM: köztes mezoderma; MM: metanefrikus mezenchima; UB: ureter bimbó.

Egy új klonogén assay létrehozásával először igazoltuk, hogy az MM multipotens progenitor sejteket tartalmaz, amelyek képesek differenciálódni a nephront alkotó több hámsejttípusba, például glomeruláris lábsejtekké és tubuláris epiteliális sejtekké. Később a genealógiai nyomkövetési kísérletek kimutatták, hogy ezeket a progenitor sejteket a Six2 transzkripciós faktor jelöli. Ezeket a progenitor sejteket ma renális metabolikus progenitor sejteknek (NPC) nevezik. Taguchi et al. kimutatták, hogy az IM elülső és hátsó doménekre oszlik, ami UB-t és MM-t eredményez. A vesefejlődésre vonatkozó ezen eredmények alapján erőfeszítések kezdődtek a hPSC-kből származó vese genealógiai sejtek regenerálására.

A hPSC-k irányított differenciálódása vese-vonalakká

A hiPSC-k vesefejlődés utánzása révén történő közvetlen vesevonalba történő megkülönböztetésének előzetes intézkedéseként csoportunk az IM sejtek generálására összpontosított, és génszerkesztéssel riporter hiPSC vonalakat generált az OSR1 génnel, amely az IM specifikus markere. Kvantitatív értékelő rendszer és riporter hiPSC vonalak felhasználásával hatékony differenciálási sémát dolgoztunk ki a hiPSC-k indukálására osr1-et expresszáló IM sejtekbe. Ezek az indukált IM sejtek fejlődési potenciált mutattak a további differenciálódásra felnőtt vesesejt-típusokká, például glomeruláris podocitákká és tubuláris sejtekké, és háromdimenziós (3D) tubuláris struktúrákat hoztak létre az egér hátsó vesesejtekkel történő együtttenyésztésével.

A Cistanche kivonat előnyei

Taguchi et al. kidolgozta az első módszert egér ESC-k (mESC) és hiPSC-k szelektív differenciálására posterior IM-en keresztül NPC-k indukálására, és in vitro indukált NPC-kből glomerulusokat és tubulusokat tartalmazó veseegység-szerű szerveket generált. Takasato et al. több vesesejt-típust, például glomerulusokat, tubulusokat, gyűjtőcsatornákat, intersticiális sejteket és vaszkuláris sejteket tartalmazó veseszerű szervek keletkezéséről számoltak be. Egy 2D tenyésztési rendszer kifejlesztésével Morizane et al. hatékonyan generált NPC-t a hiPSC-kből, majd renális metabolikus organoidokat generált az NPC-ből. Nemrég csoportunk kifejlesztett egy lépcsőzetes differenciálódási módszert, amely hatékonyan indukálja a hiPSC-ket NPC-vé, amelyek differenciálódási potenciállal rendelkeznek, hogy veseegység-szerű szerveket képezzenek (2. d, e ábra). Differenciálási módszerünk hat lépésből áll, és jobban összefoglalja az NPC természetes fejlődési folyamatát, mint a Takasato és munkatársai által leírt módszerek. és Morizane et al. és hatékonyabban generál NPC-t 2D differenciálási formátumban, mint a Taguchi és munkatársai által a 3D-tenyésztést alkalmazó módszer.

Az UB vonal irányított differenciálódását illetően Taguchi és Nishinakamura a mESC-ket és a hiPSC-ket UB-szerű struktúrákká differenciálta az elülső IM és vesetubulusokon (ND) keresztül. Az ND hámsejteket azonban alacsony hatékonysággal indukáltuk, és az ezt követő analízishez az ND-sejtek áramlási citometriával történő tisztítására volt szükség. Kifejlesztettünk egy hatékonyabb 2D-s differenciálódási módszert, amely ND-hámsejteket generál hiPSC-kből pre-IM-sel, és magában foglal egy későbbi, tisztítás nélküli differenciálódási lépést (2. f, g ábra). A 3D tenyészetben az indukált ND sejtek UB-szerű struktúrákat alakítottak ki RET( plus ) hegyekkel és CK8( plus ) törzsszerkezeti doménekkel. Mindazonáltal a mindkét csoportból generált UB-szerű struktúrák korlátozott elágazási potenciált mutattak.

2. ábra: d: HiPSC-eredetű nephron progenitor sejtek (NPC-k) immunfestése OSR1, SIX2 és HOXD11 esetén.e: HiPSC-eredetű NPC-kből képződött nephron organoid immunfestése 10 napos levegő-folyadék interfész tenyésztés után. PODXL: Podocalyxin (podocita marker; fehér); LTL: Lotus tetragonolobus lektin (proximális tubulus marker; piros); CDH1: CADHERIN 1 (distalis tubulus marker; zöld).f, g: Az elülső IM sejtek immunfestése OSR1 (zöld) és GATA3 (piros; f), valamint nephricus ductus sejt aggregátum E-CADHERIN (zöld), GATA3 (piros) és sejtmagok (kék; g) esetén.h: Morfológiai változás az elágazó iUB organoidok rekonstrukciója során 7 napig.

A közelmúltban az UB-differenciálási módszerünk módosításával sikeresen generáltunk indukált UB (iUB)-szerű szerveket epitheliális polaritással, tubuláris lumennel és ismétlődő elágazási morfogenezissel (2,3 hj ábra). Ezen túlmenően, sikeresen indukáltuk ezen iUB-szerű szervek differenciálódását in vivo megfelelőikké azáltal, hogy csatornaszerű szerveket gyűjtöttünk emberi embriókban a terhesség 7. hetében (3k ábra).

3:i ábra: iUB organoid immunfestése RET (zöld), CK8 (piros) és PAX2 (kék) esetén.j Tubuláris lumeneket mutató iUB organoid toluidinkék festése.k: FOXA1 (fehér), AQP2 (piros) és GATA3 (zöld) iUB organoidból származó, csatornaszerű csőszerű struktúrák gyűjtő csatornaszerű csőszerű struktúráinak fényes mezője (balra) és immunfestő képei (középen és jobb oldalon). Skála rudak, 100 μm. (d) és (e) Tsujimoto et al. [12], (f) és (g)–(k) Mae et al. illetőleg

A vese progenitorok kiterjedése

Annak érdekében, hogy nagyszámú vesesejteket biztosítsunk az alap- és klinikai kutatásokhoz, az embrionális vese progenitor sejtjeinek in vitro szaporítási módszereit vizsgáltuk tenyészetben. Brown és mtsai. és Tanigawa et al. beszámoltak az NPC in vitro expanziójáról egérembriókban. Az egér- és humán embriókból származó NPC-t 17, illetve 7 hónapig in vitro szaporították és tartották fenn 3D sejtaggregációs tenyészet alkalmazásával Li és munkatársai. A csoport ugyanezt a módszert alkalmazta a hiPSC-ktől megkülönböztetett NPC in vitro kiterjesztésére 2 hónapig. Bár mindhárom módszer csontmorfogenetikus fehérjét (BMP) használ, a BMP7 szerepe az NPC-k terjeszkedésében továbbra sem ismert. A vegyület szűrésével a JAK3 inhibitort, a TCS21311-et azonosítottuk a BMP7 alternatívájaként a Li és munkatársai által kifejlesztett bb0 expanziós tenyészetben. és feltárta a BMP7 gátló hatását a nasopharyngealis carcinoma expanziójára a JAK{10}} stat3 jelátviteli útvonalon. Ezenkívül a TCS21311 hozzáadása az expanziós tenyészethez javította az egérembriók és a hiPSC-eredetű NPC proliferációs sebességét.

A közelmúltban kifejlesztettünk egy hiPSC-eredetű UB-sejtek expanziós tenyészetét, amelyben az iUB-szerű szervekből izolált egyedi sejtek szaporodtak, és UB tip markereket expresszáló telepeket alkottak. Ezek a csúcskolóniák ismétlődő elágazási potenciálban iUB-szerű szerveket tudnak helyreállítani, és ez a helyreállítási folyamat legalább háromszor megismételhető.

szabványosított Cistanche

Vese rekonstrukció

A veseszerkezetek rekonstrukciójának korai munkája során a feltételezett kétéltű megtermékenyített pete ektodermális régióját, az úgynevezett állati sapkát használták, amely egy pluripotens sejttömeg (4a. ábra). Moriya et al. beszámoltak arról, hogy az aktivin A és a retinsav (RA) kezelés kombinációja in vitro az állati sapkának prorenalis tubulusokká differenciálódását váltotta ki. Brennan et al. exoszómákban prorenális zárvatermőket is indukált. Kimutattuk, hogy az indukált exoszómák prerenális tubulusokat tartalmaznak, és in vitro képesek kétéltűek pluripotens sejtjeiből a prerenális szövetet regenerálni (4. bd. ábra). Bár a prerenalis in vitro regenerációs rendszere nem fordítható közvetlenül klinikai vizsgálatokra, egyszerű és hasznos rendszerként szolgálhat a vesefejlődés tanulmányozására.

4. ábra: A veseszerkezetek rekonstrukciója. a: Egy vázlat, amely bemutatja a pronephros struktúrák létrejöttét a Xenopus embriók állati sapkájából. b–d: Egész mount (b) és metszet kettős immunfestési képek (c, d): 42-es stádiumú ekvivalens Xenopus explantátum (b, c) és 40-es stádiumú lárvák (d) pronephricus tubulus-specifikus antitesttel (3G8, piros) ) és egy pronefris csatorna-specifikus antitest (4A6, kék).

Ellentétben azzal, hogy mESC- és hPSC-eredetű NPC-ből veseegység-szerű szerveket állítanak elő, és hPSC-eredetű UB-sejtekből ductus-szerű szerveket gyűjtenek, Taguchi et al. egérveseszerű szerveket generált a mESC-eredetű NPC és UB, valamint az egérembriókból eltávolított mezenchimális progenitor sejtek kombinálásával, amelyek glomerulusokat, tubulusokat és gyűjtőcsatornákat tartalmaznak, a fent leírtak szerint. Humán veseszerű szerveket hoztunk létre in vitro hiPSC-k által indukált NPC- és UB-sejtek együttes tenyésztésével, amelyekben NPC-eredetű glomerulusok és tubulusok, valamint UB-eredetű gyűjtőcsatornák kapcsolódnak egymáshoz (5. e, f ábra). Amikor immunhiányos egerek szubepitheliális terébe transzplantáltuk, ezek a hiPSC-kből származó veseszerű szervek integrálódtak a gazdaegerek érrendszerébe (5. gi ábra).

5. ábra:e: HiPSC-kből származó veseszerkezetek in vitro rekonstrukcióját bemutató vázlat. f: A 20. napi vese organoidok hármas immunfestése podociták (PODXL), proximális tubulusok (LTL) és disztális tubulusok és gyűjtőcsatornák (CDH1; bal oldali), valamint PODXL és distalis tubulusok és gyűjtőcsatornák markereinek (AVPR2) markereinek és gyűjtésének csak csatornák (CALB1; jobb). Vegye figyelembe, hogy gyenge CDH1 jeleket találtak a bal oldali panel LTL plusz proximális tubulusainak egyes részein is. g: HiPSC-kből származó veseszerkezetek in vivo rekonstrukcióját bemutató vázlat. h: Kisebb nagyítású kép, amely a teljes gazdavesét és a hiPSC-eredetű vesegraftot (zöld) mutatja rodamin B-vel konjugált dextrán beadása után a gazdaegér farokvénáján keresztül. i: Intravitális multifoton mikroszkópos kép rodamin B-konjugált dextrán farokvénába adott injekciója után, amely azt mutatja, hogy a gazdaegerek ér lumenje behatol a hiPSC-eredetű glomerulusszerű struktúrába (zöld). Skálasávok, 100 μm a (b)–(d) és (f) pontban, 500 μm a (h) és 40 μm az (i) pontokban. (b)–(d) és (e)–(i) az Osafune et al. és Tsujimoto et al., illetve

A húgyúti veseszervek transzplantációjához kísérleti állati testeket alkalmazó módszereket, például fajok közötti blasztociszta komplementációt és szervökoton módszert vizsgáltak. Goto et al. vad típusú mESC-ket injektáltak anémiás Sall1(-/-) patkányok blasztocisztáiba, és sikeresen generált egérveséket a gazdapatkányokban. Fujimoto et al. kifejlesztett egy sejttranszplantációs módszert, amelyben a hiPSC-eredetű NPC-ket az egér méhembriók fejlődő veserégiójába (azaz a szerv ekotonjába) ültettek át, és az átültetett NPC-k kiméra sapka-mezenchimát alkottak a gazdaegér UB-jához kapcsolódó gazda-NPC-kkel. Azonban, bár az mm-ből származó glomerulusok és tubulusok injektált PSC-kből vagy NPC-kből származnak, a fennmaradó vese-alkotó sejttípusok, például az UB-eredetű gyűjtőcsatornák és az inferior húgycső- és érsejtek mindkét stratégiában a gazdaállatból származnak.

Gyógynövényes Cistanche

IRODALOM

1. GBD krónikus vesebetegséggel kapcsolatos együttműködés. A krónikus vesebetegség globális, regionális és nemzeti terhe, 1990–2017: szisztematikus elemzés a 2017-es globális betegségterh-tanulmányhoz. Lancet. 2020;395(10225):709–33.

2. Karagiannis P, Takahashi K, Saito M, Yoshida Y, Okita K, Watanabe A, Inoue H, Yamashita JK, Todani M, Nakagawa M, Osawa M, Yashiro Y, Yamanaka S, Osafune K. Indukált pluripotens őssejtek és azok felhasználása a betegségek és fejlődés humán modelljeiben. Physiol Rev. 2019;99(1):79–114.

3. Saxen L. A vese organogenezise. Cambridge: Cambridge University Press; 1987.

4. Osafune K, Takahata M, Kispert A, Asashima M, Nishinakamura R. Multipotens progenitorok azonosítása az embrionális egérvesében egy új kolóniaképző vizsgálattal. Fejlesztés. 2006;133(1):151–61.

5. Kobayashi A, Valerius MT, Mugford JW, Carroll TJ, Self M, Oliver G, McMahon AP. A Six2 meghatározza és szabályozza a multipotens önmegújuló nephron progenitor populációt az emlős vese fejlődése során. Sejt őssejt. 2008;3(2):169–81.

6. Taguchi A, Kaku Y, Ohmori T, Sharmin S, Ogawa M, Sasaki H, Nishinakamura R. A metanephric nephron progenitorok in vivo eredetének újradefiniálása lehetővé teszi összetett vesestruktúrák létrehozását pluripotens őssejtekből. Sejt őssejt. 2014;14(1):53–67.

7. Mugford JW, Sipilä P, McMahon JA, McMahon AP. Az Osr1 expressziója elhatárolja a köztes mezoderma multipotens populációját, amely progresszív restrikción megy keresztül az emlős vesén belüli Osr1-dependens nephron progenitor kompartmentjére. Dev Biol. 2008;324(1):88–98.

8. Mae S, Shono A, Shiota F, Yasuno T, Kajiwara M, Gotoda Nishimura N, Arai S, Sato-Otubo A, Toyoda T, Takahashi K, Nakayama N, Cowan CA, Aoi T, Ogawa S, McMahon AP, Yamanaka S, Osafune K. A humán pluripotens őssejtek nefrogén intermedier mezoderma monitorozása és robusztus indukciója. Nat Commun. 2013; 4:1367.

9. Araoka T, Mae S, Kurose Y, Uesugi M, Ohta A, Yamanaka S, Osafune K. Efficient and rapid induction of human iPSCs/ESC into nephrogenic intermediate mezoderm using small molecule-based differentiation methods. PLoS ONE. 2014;9(1):e84881.

10. Takasato M, Er PX, Chiu HS, Maier B, Baillie GJ, Ferguson C, Parton RG, Wolvetang EJ, Roost MS, de Sousa C, Lopes SM, Little MH. Az emberi iPS sejtekből származó vese organoidok több vonalat tartalmaznak, és modellezik az emberi nefrogenezist. Természet. 2015;526(7574):564–8.

11. Morizane R, Lam AQ, Freedman BS, Kishi S, Valeius MT, Bonventre JV. Az emberi pluripotens őssejtekből származó nephron organoidok modellezik a vese fejlődését és sérülését. Nat Biotechnol. 2015;33(11):1193–200.

12. Tsujimoto H, Kasahara T, Sueta S, Araoka T, Sakamoto S, Okada C, Mae SI, Nakajima T, Okamoto N, Taura D, Nasu M, Shimizu T, Ryosaka M, Li Z, Sone M, Ikeya M, Watanabe A, Osafune K. Egy moduláris differenciáló rendszer több emberi vese-vonalat térképez fel pluripotens őssejtekből. Cell Rep. 2020;31(1):107476.

13. Taguchi A, Nishinakamura R. Magasabb rendű vese organogenezis pluripotens őssejtekből. Sejt őssejt. 2017;21(6):730-46. e6.

14. Mae SI, Ryosaka M, Toyoda T, Matsuse K, Oshima Y, Tsujimoto H, Okumura S, Shibasaki A, Osafune K. Elágazó ureterbimbószövetek generálása humán pluripotens őssejtekből. Biochem Biophys Res Commun. 2018;495(1):954–61.

15. Mae SI, Ryosaka M, Sakamoto S, Matsuse K, Nozaki A, Igami M, Kabai R, Watanabe A, Osafune K. Expansion of human iPSC-derived ureteric bud organoids with ismételt elágazási potenciál. Cell Rep. 2020;32(4):107963.

16. Brown AC, Muthukrishnan SD, Oxburgh L. Szintetikus rés a nephron progenitor sejtek számára. Dev Cell. 2015;34(2):229–41.

17. Tanigawa S, Taguchi A, Sharma N, Perantoni AO, Nishinakamura R. Embriókból és pluripotens őssejtekből származó nephron progenitorok szelektív in vitro szaporítása. Cell Rep. 2016;15(4):801–13.

18. Li Z, Araoka T, Wu J, Liao H, Li M, Lazo M, Zhou B, Sui Y, Wu MZ, Tamura I, Xia Y, Beyret E, Matsusaka T, Pastan I, Rodriguez Esteban C, Guillen I , Guillen P, Campistol JM, Izpisua Belmonte JC. A 3D kultúra támogatja az egér és az emberi nefrogén progenitorok hosszú távú terjeszkedését. Sejt őssejt. 2016;19(4):516–29.

19. Tsujimoto H, Araoka T, Nishi Y, Ohta A, Nakahata T, Osafune K. A TCS21311 kis molekula helyettesítheti a BMP7-et és elősegítheti a sejtproliferációt a nephron progenitor sejtek in vitro expanziós tenyészetében. Biochem Biophys Res Commun. 2020.

20. Moriya N, Uchiyama H, Asashima M. Pronephric tubulusok indukciója aktivinnal és retinsavval a Xenopus laevis feltételezett ektodermájában. Fejlesztői növekedési különbség. 1993;35:123–8.

21. Brennan HC, Nijjar S, Jones EA. A pronephric glomus specifikációja és növekedési faktor indukálhatósága Xenopus laevis-ben. Fejlesztés. 1999;126(24):5847–56.

22. Osafune K, Nishinakamura R, Komazaki S, Asashima M. In vitro induction of the pronephric duct in Xenopus explants. Fejlesztői növekedési különbség. 2002;44(2):161–7.

23. Goto T, Hara H, Sanbo M, Masaki H, Sato H, Yamaguchi T, Hochi S, Kobayashi T, Nakauchi H, Hirabayashi M. Pluripotens őssejtből származó egérvese generálása Sall1-célzott anephricban patkányok. Nat Commun. 2019;10(1):451.

24. Fujimoto T, Yamanaka S, Tajiri S, Takamura T, Saito Y, Matsumoto N, Matsumoto K, Tachibana T, Okano HJ, Yokoo T. Generation of human renal vesiculs in mouse organ niche using nephron progenitor cell helyettesítő rendszer. Cell Rep. 2020;32(11):108130.