2. rész: A kvercetin 3-O- -D-glükuronid gyulladáscsökkentő, antioxidáns, hidratáló és melanogenezis elleni hatásai emberi keratinocitákban és melanomasejtekben az NF-κB és AP-1 útvonalak aktiválásával

További részletekért forduljontina.xiang@wecistanche.com

Kattintson a linkre az 1. rész megismeréséhez:https://www.xjcistanche.com/news/part-1-gyulladásgátló-antioxidáns-moistu-55118257.html

3. Vita

A korábban publikált tanulmányokban a Q-3-G-t a fülödéma, a peritoneális permeabilitás és a tüdőödéma [50] gátlására használták, ami hatékonyan hatantioxidánsalacsony sűrűségű lipoproteint tartalmazó vérplazmában [42], csökkenti a peroxinitrit által kiváltott oxidatív módosulást [51],gyulladáscsökkentőhatást azáltal, hogy gátolja a JNK és ERK jelátviteli útvonalakat LPS-fertőzés alatt [52], és rákellenes tulajdonságokkal rendelkezik az emlőráksejtekkel szemben [56]. Azonban a széles körben vizsgált kiindulási vegyületétől eltérően,kvercetin, a Q{0}}G farmakológiai előnyei és mechanizmusai még feltárásra várnak. Legjobb tudomásunk szerint a Q-3-G bőrvédő hatásokra gyakorolt ​​szerepe még nem teljesen tisztázott. Ebben a tanulmányban különböző in vitro vizsgálatok segítségével a Q-3-G bőrvédő hatásának jellemzésére összpontosítottunk az UVBor H2O2, indukált oxidatív stressz és gyulladás ellen, a bőr hidratációjára HaCaT-ben (egy humán keratinocita sejtvonal), valamintantimelanogenezisaktivitása a B16F10-ben (egy egér melanoma sejtvonal).

A HaCaT, B16F10 és HEK293T sejtek életképességét Q-3-G-vel végzett kezelés után határoztuk meg, nem citotoxikus koncentrációtartományban. Az eredmények azt mutatták, hogy a HaCaT, B16F10 és HEK293T sejtekben a sejtek életképessége nem gátolt szignifikánsan 20 μM-ig terjedő Q-3-G koncentráció felett (2a, 3a és 4f ábra). A HaCaT, B16F10 és HEK293T sejtekben a sejtek életképessége O-3-G koncentrációig 20 μM-ig alacsonyabb volt, mint a kvercetin koncentrációja, amikor azt SCC citotoxikus hatásainak vizsgálatára használták{18} } és HSC-6 sejtek (50 μM）【57】vagy a spermiumok életképessége （50-100μM）【58】). A Q-3-G azonban sokkal kevésbé toxikusnak bizonyult az aglikonjához képest [59]. A szabad OH-csoport hiánya a három pozícióban hozzájárulhat a Q-3-G kevésbé toxikus hatásához [29].

A 280-315 nm hullámhosszú UVB-sugarak áthatolnak a bőr felső rétegén, és hatékonyabbak, mint az UVA és UVC[60]. Az UVB-sugarak a legtöbb bőrrák és sejthalál oka. Ezenkívül kimutatták, hogy a HaCaT sejtekben a sejtkárosodást UVB besugárzás váltja ki [61]. Következésképpen megvizsgáltuk a HaCaT sejtek életképességét UVB besugárzás után Q-3-G kezeléssel összehasonlítva. A korábbi jelentések szerint a sejtek, szövetek és szervek sérüléséhez vezető egyik fő tényező az UVB-expozíció [62,63]. A Q-3-G helyreállította az UVB besugárzás által kiváltott csökkent sejtéletképességet (2b-d ábra). Az eredmények hasonlóak a kvercetin HaCaT UVB által kiváltott citotoxicitására gyakorolt ​​hatásáról és mechanizmusáról szóló korábbi tanulmányhoz [64].

Kattintson rá a termékek további információiért

Számos tanulmány leírta, hogy az UVB elősegítheti a súlyos gyulladásos válaszokat, ami bőrproblémákhoz vezet [1,2,4,27]. Az UVB olyan fontos gyulladást elősegítő enzimeket aktivál, mint a COX{5}} és a citokinek, például a TNF-. A COX-2 egy gyulladással összefüggő enzim, amelyet gyulladást elősegítő citokinek és mediátorok váltanak ki [65], amelyek serkentik a gyulladásos választ. Mivel a COX-2 a PGE-2 gyulladásos mediátort termeli, gyulladásos választ indukál [66,67], és a TNF- a fő gyulladásos citokin [68] a gyulladásos válaszokban. Ezek a gyulladásos reakciók bőrkárosodást okoznak, ami a bőr öregedéséhez vezet [69]. A COX-2 gyulladásos enzim és a gyulladást elősegítő citokinek, a TNF- mRNS expressziós szintjét a Q-3-G gátolta (2e. ábra). Egy korábban publikált eredmény szerint a kvercetin a génexpressziót és a TNF-termelést is csökkentette [70]. Ami az antioxidáns tulajdonságokat illeti, a DPPH és ABTS gyökfogó tesztek gyors, megbízható és reprodukálható módszerek az in vitro kiértékelésre.antioxidáns aktivitástiszta vegyületek és növényi kivonatok [54], és széles körben alkalmazzák a természetes vegyületek vagy kivonatok megkötő aktivitásának vizsgálatára szolgáló általános módszerekben [1,46,71,72]. Azt találták, hogy a Q-3-G koncentrációfüggő módon csökkenti a gyökök reaktivitását mind a vizsgálatokban, mind az áramlási citometriában. Ezek az eredmények összhangban vannak egy korábban közölt vizsgálattal, amelyben a Q-3-G szignifikánsan gátolta a ROS képződését pheochromocytoma PC-12 sejtekben [34]. Amellett, hogy kémiailag antioxidáns hatással rendelkezik, kimutattuk, hogy a Q-3-G növeli a Nrf2 szintjét, amely az oxidatív stressz egyik fontos szabályozója a sejtekben. Számos vegyületről vagy természetes kivonatról számoltak be arról, hogy a Nrf{12}}függő ARE jelátvitel révén antioxidáns tulajdonságokkal rendelkezik [46,73,74]. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Q-3-G antioxidáns hatással rendelkezik (2g-j ábra). A melaninszintézisből származó melanoszóma intracelluláris organellumokban fordul elő [75-77]. A melanin túltermelése befolyásolhatja a bőr megjelenését és a hiperpigmentációval összefüggő bőrbetegségeket. Azt találtuk, hogy a c-MSH-indukált B16F10 sejtekben az O-3-G-vel végzett kezelés gátolta a melanin szekréciót. A korábbi munkákhoz hasonlóan az intracelluláris melanogenezist a kvercetin metabolitok és néhány kvercetin-3-O- -D-glükopiranozid is szabályozza [24,78,79].

Az egészséges bőr fenntartásához megfelelő bőrhidratálásra van szükség, és az NMF-eknek és a HA-nak fontos szerepe van ebben a folyamatban [12]. Az FLG a bőrgát alkotóeleme, így az FLG fokozott expressziója összefüggésbe hozható a hidratálással [80]. Vizsgálatunkban azt találtuk, hogy a Q-3-G befolyásolja a bőr nedvességmegtartó képességét az FLG és a TGM-1 növelésével (3c, d ábra). Az FLG és a TGM-1 expressziós szintjét a JNK, IKK és IkBainhibitorok (SP600125 és Bay11-7082) blokkolták. A MAPK-hoz kapcsolódó enzimekre összpontosítottunk, mert vizsgálataink célja volt meghatározni azokat a molekuláris mechanizmusokat, amelyek révén a Q-3-fejti ki bőrvédő hatását. A JNK fontos szerepet játszik az oxidatív stressz által kiváltott keratinocita apoptózisban [81]. A c-Jun, TAK1, MKK4 és INK foszforilációja Q-3-G-vel nőtt. Ezenkívül a retinol nem növelte szignifikánsan a c-Jun, a TAK1, az MKK4 vagy a JNK foszforilációját, ami arra utal, hogy van némi különbség a Q-3-G és a retinol gátló tulajdonságai között az AP-1 jelátvitelben. útvonalat. A korábban publikált eredményekhez hasonlóan a JNK-c-Jun/AP-1 útvonal korrelál akvercetin[82]. Az előző vizsgálattal [83] összehasonlítva az NF-kB és AP-1 jelátviteli útvonalak szabályozásával ezek az útvonalak is részt vesznek a kvercetin mögöttes mechanizmusban. Eredményeink az anyavegyület mechanizmusával összhangban azt mutatják, hogy a Q-3-Gaby bőrvédő hatásában a p50, p65, IKK , IkB , Akt és Src aktiválása is szerepet kapott az NF-kB útvonalon. Q-3-G-vel végzett kezelés után HaCaT sejtekben. Ezenkívül a Q-3-G fokozta az AP-1-Luc és NF-B-Luc aktivitását (4. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a MAPK által közvetített AP-1 és NF-kB jelátvitel hozzájárult a Q-3-G által közvetített bőrvédő tulajdonságokhoz.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Anyagok

Q-3-A G-t a Sigma Aldrich Co.-tól szerezték be (St. Louis, MO, USA). A HaCaT, HEK293T és B16F10 sejteket az American Type Culture Collection-től (Rockville, MD, USA) vásároltuk.ABTS diammónium só, A DPPH-t, az aszkorbinsavat (AA), az ABTS-t és a retinolt a Sigma Chemical Co.-tól (St. Louis, MO, USA) vásároltuk. A magzati szarvasmarha szérumot (FBS), a Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) és a foszfáttal pufferelt sóoldatot (PBS) a Gibco-tól vásároltuk (Grand Island, NY, USA).3-(4-5-Dimetil-tiazol{{ A 7}}il)-25-difenil-tetra-nátrium-bromidot (MTT) az Amresco-tól (Brisbane, Ausztrália) vásároltuk. A TRILzolt és a PCR premixet a Bio-D Inc.-től (Szöul, Korea) vásároltuk. A cDNS szintézis készleteket a Thermo Fisher Scientific cégtől (Waltham, MA, USA) vásároltuk. A PCR-hez (polimeráz láncreakció) forward és reverse primereket a Macrogen, Inc. (Szöul, Korea) szintetizált. A célfehérje foszforilált vagy teljes formájához kapcsolódó összes antitestet a Cell Signaling Technology-tól (Beverly, MA, USA) vásároltuk.

4.2. Sejttenyészetek

A HaCaT és B16F10 sejteket DMEM-ben tenyésztettük 10% FBS-sel és 1% antibiotikumokkal (sztreptomicin és penicillin). A HEK293T sejteket DMEM-ben tenyésztettük 5% FBS-sel és 1% antibiotikummal. Ezeket a sejtvonalakat 5% CO-ban, 37 °C-on inkubáltuk.

4.3. Sejtéletképességi tesztek

A B16F10 sejteket lyukanként 2×10 fokos arányban oltottuk be 96-lyuklemezekre 24 órán keresztül, és különböző koncentrációjú Q-3-G（0-20 μM）-t adtunk hozzájuk, és majd 48 órán át inkubáltuk. A HaCaT sejteket 96-lyukú lemezekre szélesztettük, és a sejteket 6 × 10 fokos sejt/ml arányban oltottuk be. Egy éjszakán át tartó inkubálás után a sejteket különböző koncentrációjú Q-3-G (0-20 μM）) 24 órán át inkubáltuk. A HEK293T sejteket 6×10 fokos sejt/ml koncentrációban oltottuk be 96-lyuklemezekre 24 órán keresztül, majd Q-3-G (0-20 μM）)-val kezeltük. Az inkubált sejteket üregenként 10 µl MTT oldattal, majd 3 óra múlva 100 µl MTT leállító oldattal kezeltük. A sejtek életképességének mérésére szolgáló hagyományos MTT vizsgálatot [84] használva az 570 nm-en mért abszorbanciát leolvasóval (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) mértük.

4.4. mRNS-elemzés félkvantitatív RT-PCR-rel és kvantitatív valós idejű PCR-rel

A HaCaT sejteket Q-3-G（5-30 μM） vagy retinollal (10 ug/mL) kezeltük 12 órán át. Az RNS-t TRI-reagens segítségével csaptuk ki, amint azt korábban közöltük [85]. A komplementer DNS szintetizálására cDNS szintézis készletet használtunk. Az RT-PCR-t specifikus reverz és forward primerekkel végeztük. Az RT-PCR és a valós idejű PCR primerjeit az 1. táblázat sorolja fel.

4.5. DPPH vizsgálat

A Q-3-G gyökfogó képességének felmérésére DPPH-tesztet használtunk. Metanolt használtunk a DPPH feloldására 250 μM végkoncentrációig. Ezután 475 ml DPPH volt

reagált 5 ml Q-3-G（0-40 μM） vagy AA(500 mM）) 37 fokon 30 percig. A pozitív kontroll AA volt. A DPPH scavenging hatás meghatározása és számítása a korábban leírtak szerint történt [86].

4.6.ABTS vizsgálat

ABTS vizsgálatot végeztek a korábban közölt módon [72]. Röviden, egyenlő térfogatú 7,4 mM ABTS oldatot és 2,4 mM kálium-perszulfát oldatot összekevertünk, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten tartottuk, hogy ABTS gyökkationokat hozzunk létre. ABTS-oldatot adtunk a 96-lyuklemezek minden egyes lyukához, lyukonként Q-3-G（0-40 μM） vagy AA(500 mM）) hozzáadásával. A keverékeket 37 fokon 30 percig inkubáltuk, majd 730 nm-en mértük abszorbanciájukat.

4.7. Celluláris ROS vizsgálat áramlási citometriával

Az intracelluláris ROS képződésének ellenőrzésére egy oxidációra érzékeny festéket, 2',7'-diklór-dihidrofluoreszcein-diacetátot (DCFDA) használtunk. A HaCaT sejteket UV-sugárzásnak tesszük ki, majd a sejteket összegyűjtjük, és 300 ul PBS-ben 20 µM DCFDA-val 30 percig 37 fokon, sötétben újraszuszpendáljuk. A sejteket ezután PBS-sel mostuk, és a fluoreszcenciát 485/535 nm-en mértük Beckman CytoFLEX Flow Cytometer (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) segítségével.

4.8. Western-blot analízis

A HaCaT sejteket 6×10 fokos sejt/ml sűrűséggel oltottuk be. Egy éjszakán át tartó inkubálás után különböző koncentrációjú Q-3-G（0-10 μM） vagy retinol (10 ug/ml）) hozzáadása után 24 órán keresztül tovább inkubáltuk. A fehérje-előkészítést és a teljes sejt-lizátumot a korábban leírtak szerint végeztük [87]. A Jun, JNK, MKK4, TAK1, p50, p65, IKK, IkB, Src és Akt teljes formájának és foszforilált formájának kimutatására specifikus antitesteket használtunk, amelyeket kemilumineszcens reagensekkel tettek láthatóvá [88].

4.9. Melanintartalom és szekréció elemzése

A B16F10 sejteket 2×10 fokos sejt/ml sűrűségben 12-lyukú lemezekre oltottuk, és egy éjszakán át inkubáltuk. A tápközeget Q-3-G（10-20 μM）-val vagy arbutinnal (1 mM）) kiegészített friss táptalajra cseréltük. A melanintermelést a-MSH-val (100 nM) stimuláltuk 48 órán keresztül. A melanin szekréciós vizsgálathoz az optikai sűrűséget 475 nm-en mértük. Ezt követően a sejteket összegyűjtöttük, hogy meghatározzuk az intracelluláris melanin-tartalmat, lízispuffert használva a sejtek lizálására, majd centrifugálással (12, 000 fordulat/perc, 5 perc) ülepítve őket. A koncentrált sejtpelleteket 100 ml oldópufferben (1 M NaOH, 10% DMSO) oldottuk, és 55 °C-on megolvadtunk. Az abszorbanciát 405 nm-en mértük optikai sűrűség-leolvasóval [89].

4.10.UVB-besugárzás

A HaCaT sejteket 1×105 sejt/ml sűrűségben szérummentes MEM segítségével 6-lyuk lemezekre oltottuk, és 24 órás éheztetésnek vetettük alá. A HaCaT sejteket G-3-Q-val előkezeltük 30 percig, majd UVB besugárzással. Ezután a HaCaT sejteket PBS-sel mostuk, és UVB besugárzásnak tették ki (UVBLamp BLX-312, Vilber Lourmat, Franciaország). Az UVB sugárzás energiája 30 mJ/cm2²【90】 volt.

4.11.H2O2 kezelés

A HaCaT sejteket 6-lyuklemezekre oltottuk, és 24 órás éheztetésnek vetettük alá szérummentes MEM-mel. A sejteket különböző koncentrációjú Q-3-G（5-10 μM előkezeléssel kezeltük, majd 30 perc elteltével H2O2-val (500 μM) 12 órán át inkubáltuk.

4.12. Luciferáz Reporter Gene Assay

A HEK293T sejteket 3×10 fokos sejt/ml sűrűséggel 24-lyukú lemezekre oltottuk. A HEK293T sejteket 2 ug AP-1-Luc-ot vagy NF-kB-Luc-ot és b-galaktozidázt tartalmazó plazmiddal vittük át, polietilén-imint[91] alkalmazva. 24 órás inkubáció után a sejteket Q-3-G(5-10 μM）) vagy retinollal (10 ug/ml) kezeltük további 24 órán keresztül. A luciferáz vizsgálatot luminométerrel végeztük, az egyes minták abszorbanciáját 475 nm-en mértük Spectramax 250 mikrolemez-leolvasóval (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), amint azt korábban közöltük [92].

4.13. Sejtmorfológiai lövés

A HaCaT sejteket 6-lyukú lemezekre oltottuk 1×10 fokos sejt/ml sejtsűrűséggel. A HaCaT sejteket G-3-Q-val kezeltük 30 percig, majd UVB besugárzással. 24 óra elteltével 4×, 10× és 20× mikroszkópos objektív fotók készültek (Olympus, Tokió, Japán).

4.14. Statisztikai analízis

Minden adat legalább három független kísérlet átlaga ± standard deviációja. A csoportok közötti statisztikai különbségek összehasonlítására a Mann-Whitney tesztet és a Student-féle t-próbát használtuk. Egy p-érték<0.05 was="" regarded="" as="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" spss(ver.25,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

5. Következtetések

Kutatásunk kimutatta, hogy a Q{0}}Gulladt gyulladáscsökkentő és antioxidáns aktivitások védelmet nyújtanak az oxidatív stressz és a gyulladás tényezői ellen UVB-sugárzás és HO-expozíció esetén. Azt is kimutattuk, hogy a Q-3-G hidratáló-stimuláló képességgel rendelkezik a HaCaT sejtekben. A Q-3-G antimelanogenezis hatása mellett kimutatták, hogy gátolja a melanin szekréciót az -MSH-indukált B16F10-ben. Végül a Q-3-G hatását az AP-1 és az NF-kB jelátviteli útvonalak aktiválása közvetítette. A Q-3-G bőrvédő hatását HaCaT humán keratinocita sejtekben és B16F10 egér melanoma sejtekben az 5. ábra foglalja össze. Ez a tanulmány megállapította, hogy a Q-3-G hatékony lehet gyulladáscsökkentő hatása miatt, antioxidáns, hidratáló és antimelanogenezis tulajdonságokkal rendelkezik a humán keratinocitákban és melanomasejtekben az NF-kB és AP{20}} útvonalak aktiválása révén. Összefoglalva, az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy ez a konjugált metabolit képes megvédeni a bőrsejteket. További vizsgálatokra van szükség a Q-3-G hatásának igazolására különböző in vivo modellekben, különösen a bőrvédő modellekkel kapcsolatban.

Hivatkozások

1. Kim, E.; Hwang, K.; Lee, J.; Han, SY; Kim, E.-M.; Park, J.; Cho, JY Az epigallocatechin-gallát bőrvédő hatása. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 173. [CrossRef]

2. Draelos, ZD Új kezelések a károsodott epidermális barrier permeabilitás helyreállítására: bőr barrier javító krémek. Clin. Dermatol. 2012, 30, 345–348. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, AT; Zmijewski, MA; Zbytek, B.; Tobin, DJ; Theoharides, TC; Rivier, J. A CRF kulcsszerepe a bőr stresszválasz rendszerében. Endocr. Rev. 2013, 34, 827–884. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Orazio, J.; Jarrett, S.; Amaro-Ortiz, A.; Scott, T. UV-sugárzás és a bőr. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 12222–12248. [CrossRef]

5. Rittie, L.; Fisher, GJ UV-fény által kiváltott jelkaszkádok és bőröregedés. Aging Res. Rev. 2002, 1, 705–720. [CrossRef]

6. Videira, IF; Moura, DF; Magina, S. A melanogenezist szabályozó mechanizmusok. An. Melltartók. Dermatol. 2013, 88, 76–83. [CrossRef] [PubMed]

7. Che, DN; Xie, GH; Cho, BO; Shin, JY; Kang, HJ; Jang, SI A szőlőszár kivonat védő hatásai az UVB által kiváltott károsodások ellen a C57BL egerek bőrében. J. Photochem. Photobiol. B 2017, 173, 551–559. [CrossRef]

8. Jeong, D.; Lee, J.; Jeong, SG; Hong, YH; Yoo, S.; Han, SY; Kim, JH; Kim, S.; Kim, JS; Chung, YS; et al. Az Artemisia Asiatica etanolos kivonat öregedésgátló hatást mutat. J. Ethnopharmacol. 2018, 220, 57–66. [CrossRef]

9. McDaniel, D.; Farris, P.; Valacchi, G. Atmospheric skin aging-Contributors and inhibitors. J. Cosmet. Dermatol. 2018, 17, 124–137. [CrossRef]

10. Rao, önéletrajz; Pal, S.; Mohammed, A.; Farooqui, M.; Doescher képviselő; Asch, AS; Yamada, HY Az arzén expozíció biológiai hatásai és epidemiológiai következményei, valamint olyan reagensek, amelyek in vivo enyhíthetik az arzénkárosodást. Oncotarget 2017, 8, 57605–57621.

11. Sinha, K.; Das, J.; Pal, PB; Sil, PC Oxidatív stressz: Az apoptózis mitokondrium-függő és mitokondrium-független útjai. Boltív. Toxicol. 2013, 87, 1157–1180. [CrossRef]