3. rész: Egyedülálló egérmodell a korai élet gyakorlatához, amely lehetővé teszi a hippocampális memóriát és a szinaptikus plaszticitást

további információ:ali.ma@wecistanche.com

Kérem kattintson ide a 2. részhez

Anyagok és metódusok

Állatok. A vad típusú egerek a C57Bl6J anyaállatok utódai voltak, amelyeket eredetileg a Jackson Laboratories-tól szereztek be, és állattenyésztési létesítményeinkben továbbtenyésztettek. Az egerek szabadon hozzáférhettek élelemhez és vízhez, és a fényeket 12 órás világos/sötét ciklusban tartották fenn. A szülés utáni napon (P) 21 az elválasztás után az egereket vagy standard ágyneműketrecekben, vagy futókerékkel felszerelt ketrecekben helyeztük el. Minden gyakorlati és viselkedési kísérlethez hím és nőstény egereket is használtak. Az elektrofiziológiai vizsgálatokhoz csak hím egereket használtunk. Minden viselkedési tesztet a fényciklus alatt végeztek. A kísérleteket az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézetének állatgondozásra és -használatra vonatkozó iránymutatásai szerint végezték, és jóváhagyta a Kaliforniai Egyetem Irvine-i Intézményi Állatgondozási és Állathasználati Bizottsága.

Kattintson ideCistanche hatások a memória javítására

Futókerék paradigma. A P21-en való elválasztás után az egereket párban helyeztük el vagy standard ketrecekben, kerék nélkül, vagy mozgatható vagy helyhez kötött rozsdamentes acél futókerékkel (átmérő 4,5 cm, 112 gramm, Starr Life Sciences). A futókerekekkel elhelyezett állatok szabad hozzáférést kaptak előre meghatározott ideig: vagy egy hét a fiatalkori időszakban (P21–27; juv ELE), egy hét serdülőkorban (P35–41; Adol ELE), vagy három egymást követő hét (P21–). 41; juv-adol ELE). Egy további egércsoportot álló kerékkel helyeztek el a P21–41 (sta) alatt, hogy ellenőrizzék a környezet dúsítását a ketrecben lévő kerék jelenlétéből. Mindegyik kereket könnyű poliuretán hálóval látták el, hogy megakadályozzák az elválasztott egerek kis végtagjainak kicsúszását a kerekek fokain. A futási aktivitást egy adatporthoz csatlakoztatott, digitálisan felügyelt szenzorok és számítógép segítségével követték nyomon a valós idejű adatgyűjtés érdekében (Vital View Szoftver) a kerékfordulatszám mágneses érzékelésével. Mindegyik digitálisan felügyelt kerék követte a ketrec futási távolságát (ketrecenként két egér volt elhelyezve, így a ketrecenként megtett távolság a két egér között megtett teljes távolságot jelenti). A fordulatszámokat naponta percben határozták meg a futás időtartamára vonatkozóan, és átszámították ketrecenként (km) megtett távolságra.

Objektum helyememória(OLM) protokoll. Az objektum helyememóriaAz ebben a tanulmányban használt protokollt adaptálták és módosították a korábbi protokollokhoz képest44. A szülés utáni 36. napon az egereket csökkentett fényerejű vizsgálószobába vittük. Az egereket egyenként körülbelül 2 percig kezeltük, összesen 5 egymást követő napon az OLM edzés előtt (napi kétszer az első 2 napon, majd naponta egyszer a következő 3 napon). A szoktatási alkalmak 5 percesek voltak, naponta kétszer 3 napon keresztül (P38-P40), és a kamra minden falán négy egyedi térbeli jelzést (vízszintes vonalak, fekete X, függőleges csík és üres fal) tartalmazó kamrákban zajlottak. . A szoktatás átfedésben volt az elmúlt 2 nap kezelésével. A kiképzési szakaszban (P41) az egereket ugyanabba a kamrába helyeztük két azonos tárggyal, és küszöb alatti (3 perc) vagy küszöbérték (10 perc) képzési periódusnak tettük ki őket; olyan tanulmányterv, amely előzetes munkán alapul, és bizonyítja, hogy a 3 perces edzés általában nem elegendő hosszú távúmemóriaformáció45. Az edzőketrecekben lévő egereknél a futókerekeket közvetlenül az OLM edzés után reteszelték, hogy kiküszöböljék az edzés minden akut hatását.memóriakonszolidáció. A tesztelés napján (P42; 24 órával a kiképzés után) az egyik objektumot a kamrában egy új helyre vitték, majd az egereket 5 percig hagyták felfedezni a tárgyakat. Az egyes tárgyakkal eltöltött időt vakanalízissel, kézi pontozással határozták meg, és mind a képzési, mind a tesztelési napokon kapott értékeket diszkriminációs indexbe (DI) konvertálták, az objektum tesztelés közbeni új elhelyezkedése alapján: [(töltött idő) újszerű objektum feltárása – ismerős tárgy felfedezésével eltöltött idő)/(mindkét objektum felfedezésének teljes ideje) × 100 százalék ]. Ebben nem voltak jelentős különbségekmemóriaaz ülő állatok és az álló kerékkel elhelyezett állatok közötti teljesítmény, ezért ezeket a csoportokat egyesítettük, és „nincs ELE”-ként ábrázoltuk az összes OLM-elemzésben. A szoktatási kísérleteket ANY-labirintus viselkedéselemző szoftverrel (Stoelting Co) elemezték az ülések során megtett távolságra. Kizártuk az elemzésből azokat az egereket, amelyeknél a két objektum között a felderítési idő egyenetlen volt a kiképzési szakaszban (DI > 20), vagy amelyek nem mutattak csökkenést a szoktatási alkalmak során megtett teljes távolságban.

A Cistanche javíthatja a memóriát

elektrofiziológiai tanulmányok. Az elektrofiziológiai kísérleteket a korábban leírtak szerint végeztük, és ezeknek a módszereknek a forrását máshol publikálták66. Az elektrofiziológiai kísérletekhez csak hím egereket használtunk. Röviden, az összes ELE csoportból származó hím egereket P42-51 között leöltük, és a szeleteket a rostrális hippocampusból gyűjtöttük össze. A koronális szeleteket 320 um vastagságban metszettek (Leica VT1000 S), és egy interfész-rögzítő kamrába helyezték előmelegített (31 ± 1 fokos) mesterséges agy-gerincvelői folyadékkal (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 1,5 mM MgS04, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHC03 és 10 mM d-glükóz). A szeleteket folyamatosan perfundáltuk 1,75-2 ml/perc sebességgel, miközben a szeletek felületét meleg, párásított, 95 százalékos O2/5 százalék CO2-nak tették ki. A felvételek legalább 2 órás inkubáció után kezdődtek. A terepi gerjesztő posztszinaptikus potenciálokat (fEPSP-ket) a CA1b stratum radiatumból rögzítettük egyetlen üveg pipettával (2-3 MΩ), amelyet 2 M NaCl-dal töltöttünk meg. A stimulációs impulzusokat (0,05 Hz) a CA1c-ben elhelyezett bipoláris stimuláló elektróddal (sodort nikróm huzal, 65 μm) juttattuk el Schafer collateral-commissural projekciókhoz. Az áramerősséget úgy állítottuk be, hogy a maximális fEPSP válasz 50 százalékát kapjuk. A stabil alapvonal megállapítása után az LTP-t egyetlen öt théta sorozattal indukáltuk, amelyben minden egyes burst (négy impulzus 100 Hz-en) egymástól 200 ms távolságra (vagyis théta frekvencián) történt. A stimuláció intenzitása nem nőtt a TBS alatt. Az adatokat a NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Teta Burst) segítségével gyűjtöttük és digitalizáltuk. Az LTP-ábra adatait az alapvonal utolsó 10 percére normalizáltuk, és átlag ± SE-ként mutattuk be. Az I/O görbék, a páros impulzus facilitáció és az LTP alapértékeit kétutas ANOVA és lineáris regressziós analízis (Graphpad Prism 8 szoftver) segítségével elemeztük.A Cistanche javíthatja a memóriát.

Statisztikai elemzések. Egyirányú ANOVA-kat használtunk a korai életszakasz gyakorlatok időzítésének hatásának elemzésére az OLM Acquisition DI-kra (2d. ábra, g), az OLM-tesztelési DI-kra (2e. ábra, h) és az OLM-tesztelés teljes feltárási időkre (2f. ábra). , i) az egyes nemeken belül. A Dunnett-féle post-hoc többszörös összehasonlításokat használták a „nincs ELE” (ülő) csoporthoz, amikor jelentős ANOVA eredményeket figyeltek meg. Kétutas ANOVA-t alkalmaztunk az ELE periódus alatt gyarapodott egértömeg elemzésére (1b. ábra, ELE csoport és nem faktorai). Kétirányú ismételt méréseket (RM)-ANOVA-kat használtunk a napi futási távolság elemzésére (1c–e. ábra, a születés utáni nap és nem tényezői), a szoktatási alkalmak (2b. és c. ábra), valamint az OLM-szerzési DI és a tesztelési DI összehasonlítására. minden egér esetében a csoporton belüli összehasonlításhoz. Sidak post hoc tesztjeit specifikus összehasonlítások elvégzésére használták, amikor jelentős interakciókat vagy főbb hatásokat figyeltek meg egy futó csoport vagy az OLM munkamenet során. Ezenkívül háromutas ANOVA-t végeztek az OLM tesztelési DI-k esetében, hogy meghatározzák a három névleges változó (OLM képzés időtartama, ELE csoport és nem) közötti szignifikáns kölcsönhatásokat. Azon ritka esetekben, amikor egy adott nap 24 órás futási adatait nem rögzítették, az értékeket az előző három nap átlagos futási távolsága alapján számították ki a statisztikai elemzések elvégzéséhez. Páratlan Student-féle t-teszttel elemezték az egyes ELE-csoportok teljes futási távolságát (1f–h. ábra), valamint összehasonlították az OLM-teszt DI-értékeit 3-perc és 10-perc edzett ülő egerek között. Az összesített futási távolságok átlag ± SD-ben vannak kifejezve. Az összes ANOVA főbb hatásait és kölcsönhatásait a szöveg és az ábrák jelmagyarázatai írják le, valamint az egyes kísérletekben használt nemenkénti állatok meghatározott száma. Minden elemzés kétirányú volt, és 0,05 értékre volt szükség a szignifikanciához. A hibasávok minden ábrán a SEM-et jelentik. Minden kísérletnél a csoport átlagától számított ±2 szórást kiugró értékeknek tekintettük, és eltávolították az elemzésekből. Minden statisztikai adatot GraphPad Prism 8 szoftverrel végeztünk. A viselkedési kísérletekben használt egerek teljes száma=152.

A Cistanche javíthatja a memóriát

Beérkezett: 2020. január 16.; Elfogadva: 2020. május 13.;

Megjelent: xx xx xxxx

Köszönetnyilvánítás

Ezt a kutatást a National Institutes of Neurological Disorders and Stroke of the National Institutes of Neurological Disorders and Stroke, a K12NS098482 kitüntetésszám alatt (az ASI-nek ítélték oda) és az UC Irvine School of Medicine, Gyermekgyógyászati ​​Osztálya támogatta. Ezúton is szeretnénk köszönetet mondani Dr. Marcelo Woodnak tudományos vitáikért és a projekthez való kritikus hozzájárulásáért.

Szerzői hozzájárulások

Az ASI, TY, SP, FS és TV gyakorlatokat és viselkedési kísérleteket végzett, és adatokat elemzett; EK végzett minden elektrofiziológiai kísérletet, elemezte az adatokat és szerkesztette a kéziratot; Az ASI tanulmányt tervezett, elemezte az adatokat, értelmezte az eredményeket és megírta a kéziratot.

versengő érdekek

A szerzők nem nyilatkoznak egymással versengő érdekekről.

További információ

A levelezést és az anyagok iránti kérelmeket az ASI-hez kell címezni

Az újranyomtatásokkal és az engedélyekkel kapcsolatos információk a www.nature.com/reprints oldalon érhetők el.

A kiadó megjegyzése A Springer Nature semleges marad a közzétett térképekben és az intézményi kapcsolatokban szereplő joghatósági igényekkel kapcsolatban.