Ⅱ rész: A PKD1 túlzott expressziója policisztás vesebetegséget okoz

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté és Marie Trudel

A mögöttes patogenetikai mechanizmusokautoszomális domináns policisztás vesebetegség(ADPKD) tisztázásra vár. Bár bizonyíték van arra, hogy a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) a gén haploinsufficiencia és a heterozigótaság elvesztése cisztaképződést okozhat egerekben, paradox módon magas PKD1 (policisztás vesebetegség 1) expressziót mutattak ki ADPKD (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) betegek veséjében. Annak megállapításához, hogy a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) funkciógyarapodás lehet patogenetikai folyamat, egy PKD1 (policisztás vesebetegség 1) bakteriális mesterséges kromoszóma PKD1 (policisztás vesebetegség 1)-BAC) homológ rekombinációval módosult, hogy kizárólag egy tartós PKD1-et célozzon meg (policisztás vesebetegség 1) expressziója előnyösen a felnőtt vesében történik. Számos transzgenikus vonalat hoztak létre, amelyek specifikusan túlzottan expresszálták a PKD1-et (policisztás vesebetegség 1) transzgén a vesékben 2- a PKD1-hez képest 15-szorosára (policisztás vesebetegség1) endogén szintek. Minden transzgenikus egér reprodukálható módon tubuláris és glomeruláris cisztákat és veseelégtelenséget fejlesztett ki, és veseelégtelenségben halt meg. Ez a modell azt mutatja, hogy a vad típusú PKD1 túlzott expressziója (policisztás vesebetegség 1) önmagában elegendő a humán ADPKD-hez hasonló cisztogenezis kiváltásához (autoszomális dominánspolicisztás vesebetegség). Eredményeink feltűnően megnövekedett renális c-Myc expressziót tártak fel az összes transzgenikus vonalból származó egerekben, ami azt jelzi, hogy a c-Myc kritikus in vivo downstream effektor a PKD1-hez.policisztás vesebetegség 1) molekuláris útvonal. Ez a tanulmány nemcsak egy felbecsülhetetlen értékű és első PKD-t hozott létre.policisztás vesebetegség）modell a molekuláris patogenezis és a terápiák értékelésére, de bizonyítékot szolgáltat arra is, hogy a funkció növekedése patogenetikai mechanizmus lehet az ADPKD-ben.autoszomális domináns policisztás vesebetegség).

Cistanche vesebetegség kezelésére

A RÉSZÉHEZ KATTINTSON IDE Ⅰ

EREDMÉNYEK

PKD1 gyártása (policisztás vesebetegség 1)-Ac-BAC homológ rekombinációval. Annak megállapításához, hogy a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) funkciógyarapodás önmagában elegendő az ADPKD (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) fenotípus előállításához, először izoláltunk egy genomikus klónt, amely tartalmazza a teljes PKD1-et (policisztás vesebetegség 1) gén egy BAC vektor 129/Sv könyvtárában. Ezt a könyvtárat PCR-rel szűrtük két primer-készlettel a PKD1-re (policisztás vesebetegség 1) gén, amely az 1. exont az 5'-végen és a 39-40. exonokat a 3'-vég felé ívelte át (1. ábra). A PKD1 pozitív BAC klónja (policisztás vesebetegség 1) gént azonosítottak, amely magában foglalta a teljes szomszédos Tsc2 géntestet. A PKD1 (policisztás vesebetegség 1) inszertet részletesen jellemeztük annak érdekében, hogy a genomi szerkezet megegyezzen az endogén PKD1-éval.policisztás vesebetegség1) a 129/Sv egértörzs génje, amelyből az inszert származott, és a C57BL/6J beltenyésztett törzsből. A PKD1 genomiális térképei (policisztás vesebetegség 1) lókusz a BAC-ban és ezekben a beltenyésztett törzsekben Southern blot analízissel, négy restrikciós enzimes emésztéssel és hét szondával, amelyek lefedik a teljes PKD1-et (policisztás vesebetegség 1) gén, azonosnak tűnt, átrendeződésre utaló jel nélkül (1. ábra). Ez a BAC tartalmazott egy -121-kb inszertet, beleértve ~37 kb upstream és -39 kb egy downstream szekvenciát a PKD1-ből (policisztás vesebetegség1) elektroforézissel és szekvenálással meghatározott gén.

ÁBRA. 2.SBPkdlrAc konstrukciók és transzgenikus egerek előállítása. (a) Egymást követő homológ rekombinációs eseményeket végeztünk rágcsáló Pkdl-BAC-n, hogy két módosítást vezessenek be: az SB szabályozó elemeket közvetlenül a Pkdl iniciációs kodon előtt, és az EcoRI (RI*) csendespont mutációját, amelyet az exon(ex)-be vittünk be. 10. A BAC rekombinációs vektor tartalmaz egy R6Ky replikációs origót, egy ampicillinrezisztens gént, egy SacB gént, egy RecA gént és egy egyedi Smal klónozó helyet, amelybe az "SB" szabályozó elemeket (vagy a 10. exon némapont mutációját) klónozták. a szomszédos Pkd1 génkarokkal. A BAC rekombinációs vektort Pkdl-BAC vad típust tartalmazó E, coli (DH10B) sejtekbe elektroporáltuk, és a szelekciót követően az első homológ rekombinációs esemény a két Pkd1 kar egyikén keresztül megtörtént a BAC kointegrátumok előállításához. A rekombinációs vektort és a BAC kointegrátumok duplikált Pkdl régióit egy második szelekciós lépésben elimináltuk. A feloldott Pkdl-BAC-k vagy visszatérhetnek vad típusúvá, vagy tartalmazhatják a kívánt módosítást. Ezt követően az újonnan módosított BAC-ba homológ rekombinációt lehet bevinni.(b)(ienomc DNS ot SBPkd l-etranszgén mxce anakZed bv Sou thern blot. A linearizált fragmentumok AVicToiD1ecLonja a transzgén beépülését okozta egy fej-fejbe. -farokig és/vagy faroktól farokig orientáció. Az 5'-véget a genomiális DNS HindIII-mal történő emésztésével elemeztük, és hibridizáltuk a specifikus transzgén SB próbával (bal oldal). Mindhárom transzgénikus egérvonal a várt 10-et eredményezte .9-kb sáv a fejtől a farokig beillesztéshez; a 39. sorban megfigyelt további sáv nagy valószínűséggel az SB és az egérgenom közötti kapcsolódási fragmentumot képviseli. A transzgén belső integritását számos restrikciós enzimes emésztéssel ellenőrizték, és Az EcoRI-vel emésztett és a Pkdl-próbával hibridizált genomi DNS (7-15 exon) egy reprezentatív blotja látható (középső panel).

Ez az SBPKD1 (policisztás vesebetegség 1A )-BAC klónt két egymást követő homológ rekombinációs eseménnyel módosítottuk E. coliban. A PKD1 (policisztás vesebetegség 1) gént a 10. exonban jelöltük meg egy nukleotid helyettesítésével (G-től A-ig), hogy új EcoRI helyet hozzunk létre a cDNS-térkép 2355. pozíciójában. Ezt a néma pont mutációt azért hozták létre, hogy megkülönböztessék a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) gén és az endogén eredetű BAC transzkriptuma. Emellett lecseréltük a PKD1 5' szabályozó elemeit (policisztás vesebetegség 1)-BAC gén az SBM (c-Myc-hez kapcsolt, vagy a c-fos-hoz kapcsolt SBF) konstrukció-transzgénből származó, korábban azonosított "SB" vese epiteliális specifikus elemeinek kihasználásával, hogy korlátozza az expressziót a vesékre (36, 38) (2a. ábra).

Ezt az új SBPkdlrAG-BAC-ot NotL-lel emésztettük, amely egy egyedülálló hely, amely közvetlenül az SB elemek előtt található, és a ClaI a Tsc2 géntestben, csonkolva a Tsc2 szabályozóelemeket és a géntest 5' felét a T'sc2 hiányának biztosítása érdekében. exogén expressziót minden szövetben és a prokarióta BAC vektor szekvenciák eltávolítását (1. és 2. ábra). Ezt a 70-kb NotI-ClaI linearizált fragmentumot izoláltuk, megtisztítottuk. és számszerűsítettük az oocita mikroinjekcióra (36).

CISTANCHE ELŐNYÖK: VESEBETEGSÉGEK KEZELÉSE

SBPkdl-ac transzgenikus egerek előállítása és elemzése. Négy transzgenikus alapító, akik az SBPkdlrAc transzgén több másolatát hordozzák, következetesen fejlesztették ki a PKD-t. A négy SBPKD1 (policisztás vesebetegség 1)Southern analízissel meghatározott RAC alapító egerek, három SBPKD1 (policisztás vesebetegség 1) A TAG transzgenikus vonalakat a transzgén 2-9 kópiájával hoztuk létre (2b. ábra). A transzgén integritásának jellemzését ezekben a vonalakban 5', belső és 3' próbákkal követtük, amint azt a 2b. ábra reprezentatív példái mutatják. A transzgenikus vonalak az 5'"SB" próbával egy 10,9 kb-s sávot mutattak ki, amely megfelel az SBPkdlrAc-nek. A transzgén fej-farok irányban integrálódik, és a 3' szondával egy 7{12}} kb-os sávot mutatott ki (2b. ábra). Ezenkívül a belső szonda kimutatta a transzgén 9.{15}}kb-os endogén PKD1 (policisztás vesebetegség 1) sávját, valamint a 6.{19}}kb és 2{21}}kb méretű sávokat. a 10. exonban lévő EcoRI inszerciós hely miatt (2b. ábra). Ezek az egerek a transzgén teljes másolatát tartalmazták a genomiális átfedő szerkezet elemzése alapján.

PKD1 (policisztás vesebetegség 1) funkciónövekedés felnőtt SBPkdl-Ac transzgenikus egerekben. Az SBPkdl-AG kifejezése. transzgén és PKD1 (policisztás vesebetegség 1) gént különböző szervekben vizsgálták. A transzgénből és/vagy endogén génből származó transzkriptumszintek mennyiségi meghatározását Northern blot analízissel végeztük (3a. ábra). Ahogy az várható volt, a transzgén és az endogén gén transzkriptumai hasonló hosszúságúak voltak (14,2 kb). A kontroll GAPDH expressziója alapján az összes SBPkd 1 A egérvonal veséi következetesen megnövelték a transzkriptum expresszióját a normál PKD1-hez képest (policisztás vesebetegség 1) szintje hasonló korú felnőtt vesékben (n=3). A különböző transzgénikus vonalak vesetranszgénje és endogén expressziója 2--tól 15--szeres tartományt mutatott a kontroll renális endogén PKD1-nél.(policisztás vesebetegség 1)szintek (3a. ábra). Különösen a 39-es transzgénikus vonal (n=4) mutatott magasabb PKD1-et (policisztás vesebetegség 1) szinten, mint a 3. (n=3) és a 41. (n=4) sor. Továbbá a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) a Northern blot analízissel mért expressziós szintek korreláltak az 1. és 2. exonban lévő primerek felhasználásával valós idejű PCR-rel (3b. ábra).

3. ábra.SBPkdlrA egerek vese expressziós elemzése. (a) Pkd1 endogén (endo) és SBPkdlrA transzgén (Tg) transzkriptumainak expressziós elemzése vesében három transzgénikus vonalból Northern blottal. Mindegyik transzgenikus vonalból két mintát, a 3, 39 és 41 mintát hasonlítottuk össze azonos genetikai háttérből származó normál kontroll egerek endogén vese Pkdl-transzkriptumával (C5BI 6I × CBA/DE, a vese RNS mintákat transzgenikus egerekből vettük végstádiumú vesebetegség. Az endo- és a Tg-transzkriptumok egyaránt -14,2 kb hosszúságúak. A transzkriptumok szisztematikus túlzott expresszióját figyelték meg minden transzgenikus egér veséjében a nem transzgénikus kontrollokhoz képest. A GAPDH-t belső kontrollként használták A veseexpresszió mennyiségi meghatározása ezekben a transzgenikus egerekben 2--tól 15--szeresig terjedt a kontrollegerek Pkd1-endogén szintjéhez képest, amelyet önkényesen 1-re állítottak be. (b) Az SBPkdl-transzgén és a primerek sematikus ábrázolása A teljes Pkdl, beleértve az endogén és a transzgént (exon 1 és exon 2), és csak a Pkd1 transzgént (B. exon 2) amplifikálására használták valós idejű PCR-rel és szemikvantitatív RT-PCR-rel, az SBPkdlAc transzgén expressziójának RT-PCR analízise vesében történt és extra veseszövetek. Az SBPkdl.Ac transzgén (Tg) reprezentatív szemikvantitatív értékelése kimutatható, amely mindhárom transzgenikus vonalból (3, 39 és 41) és extrarenális szövetekből származó veseszövetmintát (K) tartalmaz. H, szív; Lu, tüdő; B. agy; Li, máj; és S. lép a 39. vonalba tartozó egérből. A transzgén expressziója minden transzgenikus egér veséjében könnyen kimutatható, míg a vesén kívüli szövetekben alacsony vagy nem mutatható ki. Az SBPkd1rAc transzgén expressziója specifikus 307-bp amplikont, míg az S16 belső kontroll egy 102-bp amplikont hozott létre. M,100-bp marker; H, O, negatív kontroll a PCR-amplifikációhoz. (c) Az SBPkdlr valós idejű PCR expressziós elemzése. A transzgént több független egérből határoztuk meg. A három transzgenikus egérvonalból származó SBPkdl.Ac transzgén 3 (n=5), 39 (n =7) és 41 (n=5) azt mutatta, hogy a 39. és 41. vonal a legmagasabb. vese expressziós szintjei. Az SBPkdlrAc transzgén expresszióját egerek extrarenális szöveteiben (n=3) a három transzgénikus vonal közül valós idejű PCR-rel értékeltük. Az egyes transzgenikus vonalak veséjével (100 százalék) összehasonlítva az extrarenális szövetek elemzése azt mutatta, hogy a transzgén expressziós szintje következetesen 10--1,000--szeresére csökkent az agyban, szívben, májban és hasnyálmirigyben. , lép és tüdő. (d) Az endogén c-mc gén expressziója az SBPkdl.Ac vesékben szemikvantitatív RT-PCR-rel. Egy sematikus illusztráció mutatja a c-Myc amplifikálására használt primereket. Ahogy az várható volt, a c-Myc expressziója minimális a felnőtt, nem transzgénikus vesékben (kontroll). Ezzel szemben a c-Mye fokozott expressziója a három vonal összes felnőtt SBPkdlrAc veséjében kimutatható, amint azt a felnőtt transzgenikus SBM vesékben is megfigyelték. pozitív kontroll. A c-Myc amplikonja 250 bp volt; az S16, egy belső kontroll amplikonja 102 bp.M,{55}}bp marker volt.

A transzgén expressziós szintjének kvantitatív meghatározását valós idejű PCR-rel és szemikvantitatív RT-PCR-rel végeztük a három transzgenikus vonalban felnőtt korban, primerek felhasználásával az 5' nem transzlált régióban (B, -globin promoter) és a PKD1 2. exonjában. (policisztás vesebetegség 1)(3b. ábra). Az SBPKD1 (policisztás vesebetegség 1) A RAC expresszióját transzgenikus egerekben az S16 riboszomális fehérje géntermékével hasonlítottuk össze belső standardként. A szemikvantitatív RT-PCR amplifikációhoz használt körülmények a lineáris tartományon belül voltak. A valós idejű PCR-rel és szemikvantitatív RT-PCR-rel végzett transzgénexpresszió következetesen és specifikusan a legmagasabb expressziót mutatta a vesében az összes transzgénikus vonal közül a többi szervhez képest (3b. és c. ábra). Az egyes minták veseexpressziós szintjei reprodukálhatók voltak bármelyik kimutatási technikával. A legmagasabb szintű PKD1 (policisztás vesebetegség 1) transzgén veseexpresszióját mértük a 39. és 41. vonalra. Annak nyomon követésére, hogy a fokozott PKD1 (policisztás vesebetegség 1) expressziója a transzgén vagy az endogén gén következménye-e, a három transzgenikus vonalból származó azonos egércsoportot hasonlítottuk össze a vese PKD1-re ( policisztás vesebetegség 1) transzgén expressziója és a vese PKD1 (policisztás vesebetegség 1) teljes (transzgén és endogén) expressziója valós idejű PCR-rel. Érdekes módon. a 39. és 41. sor a 3. sorhoz képest azt mutatta, hogy a megnövekedett PKD1 (policisztás vesebetegség 1) transzgén veseexpressziója hasonló volt vagy meghaladta a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) teljes vese expresszióját, ami arra utal, hogy a transzgén specifikusan felelős ezért az indukált expresszióért. Különféle szervekben (beleértve a szívet, a tüdőt, az agyat, a májat, a hasnyálmirigyet és a lépet) az SBPKD1 (policisztás vesebetegség 1) RAC; A transzgén nagyon gyenge expressziót mutatott alkalmanként a lépben és a tüdőben, míg más szervekben csekély vagy nem detektálható expressziót mutatott (3b. ábra). A valós idejű PCR-rel végzett kvantifikáció a veseexpresszióhoz viszonyítva 10--1,000--szer alacsonyabb transzgén expressziót mutatott az extrarenális szövetekben (3c. ábra). Az SBPkdlrAc transzgén "SB" szabályozó elemei preferált renális expressziót biztosítottak; ezt a szerveloszlást is meghatározták, amikor c-Myc-hez (SBM) és c-fos-hoz (SBF) kapcsolt transzgénekben használták (36, 38). c-Mye, a PKD1 downstream effektora (policisztás vesebetegség 1) jelátviteli útvonalak SBPkdlrAc-ben: egerek. Az SBPkdlrAc transzgenikus egerek intracelluláris patogenetikai mechanizmusába való betekintés érdekében a következő lépésben a c-Myc vese expressziós szintjének monitorozására törekedtünk korábbi megfigyeléseink alapján, amelyek a c-Myc deregulációját mutatták be humán ADPKD (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) vesékben (22). A vesék analízisét mindhárom transzgénikus vonalból (3(n=4), 39(n=7), 41-ből (n =4), valamint a kontrollokból (n {{9) végeztük. }}).Amint a 3d. ábrán látható, az SBPkdlrAa egerekben indukált endogén c-Mye jelentős mértékben kifejeződik a hasonló korú kontroll egerekhez képest. Érdekes módon a c-Myc expresszió szintje egyes SBPkdlrAG vesékben, különösen a 39. vonalban elérte a renális c-Myc expresszióval előállított PKD SBM transzgenikus egérmodellben megfigyelt szinteket.

Vese anomáliák az SBPKD1-ben (policisztás vesebetegség 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6. ábra mindegyik vonalra) több tubuláris (T) és glomeruláris ciszta (G) alakult ki (4d, f és g ábra). Cisztákat figyeltek meg a kortikális és a velős régió tubulusaiban, valamint a papilla tubulusaiban (4d. és e. ábra). A transzgenikus egerek tubuláris epiteliális hiperpláziát (nyílhegy) mutattak, amely mind cisztás, mind nem cisztás tubulusokat és gyakori hipertrófiát tartalmazott (4g és h ábra). de a súlyosság az egyes egerek között változott. Intersticiális fibrózis (F). perivaszkuláris limfoid infiltrátumok és fehérjeszerű hámszövetek (P) gyakran megfigyelhetők (4d. és e. ábra)

4. ábra

A megnövekedett PKD1 lokalizációs helyének pontosabb meghatározásához (policisztás vesebetegség 1)expresszióját a vesében, in situ hibridizációt végeztünk a korábban használt 36-45 exon próbával(16). A hibridizációs jelet specifikusan a cisztát és a hiperplasztikus tubulusokat borító hámsejtekre, valamint a glomeruláris cisztákra lokalizáltuk. Ezenkívül a nem cisztás vagy enyhén tágult tubulusok epitéliumán is látható volt némi jel, amely valószínűleg azonosította azokat a tubulusokat, amelyek jövőbeli cisztás változásokon mennek keresztül (4i. és j. ábra). Születéskor (n=8), születés utáni 10. napon (P10)(n=3), P20(n=5), P35(n{) transzgenikus egereken veseszövettani elemzést is végeztek {10}}), és P45(n{12}}) összehasonlítva az azonos korcsoport negatív alomtársaival (n =2–4). Érdekes módon minden újszülött transzgenikus egér tubuláris és glomeruláris dilatációt mutatott kontroll negatív alomtársak (4k. és 1. ábra), ami azt jelzi, hogy a vese anomáliái a méhen belül kezdődtek, ahogy azt SBM egerekben és ADPKD-ben is megfigyelték.autoszomális domináns policisztás vesebetegség) betegek. A tubuláris és glomeruláris dilatáció mérete és száma az életkor előrehaladtával nőtt. A P35-re a transzgenikus egerek súlyosabb hiperpláziát és a glomerulosclerosis bizonyítékát mutatták. Megváltozott vesefiziológiai funkciók SBPkdlrsc egerekben. Az összes transzgenikus egér veseélettani funkciói a PKD-hez hasonló tulajdonságokat mutattak, míg a nem transzgenikus alomtársaknál soha nem alakult ki a betegség. A születés után néhány hónapon belül az érintett állatok krónikus veseelégtelenségben szenvedtek. Ezeknek az állatoknak a vesefunkciós paramétereit a szérum- és vizeletszint mérésével monitoroztuk. vér karbamid-nitrogén (BUN) és kreatinin, vizelet ozmolalitása, vizeletfehérje és ionkiválasztás (1. táblázat). A három vonal összes egere a kontrollokhoz képest koncentrálási hibákat mutatott, ami gyakori megállapítás az ADPKD-ben (autoszomális domináns policisztás vesebetegség). és ennek következtében csökkent vizelet BUN-t mutatott. kreatinin, fehérje és vas koncentrációja. Transzgénikus SBPKD1 (policisztás vesebetegség 1)rAc.alapítókat és utódokat (n=6) mindegyik vonalból SDS-PAGE-val minőségileg ellenőriztük a proteinuria szempontjából a vizeletmintákon (5. ábra). A 2 hónaposnál idősebb egerek nem szelektív proteinuriát mutattak, amely az életkorral előrehaladt. Ezenkívül a szérum BUN és szérum kreatinin szintje megemelkedett, ami veseelégtelenségre utal (2. táblázat). Mivel a krónikus veseelégtelenség általában a hematológiai paraméterek megváltozásához vezet, ezeket 3-14 hónapos SBPkdlAc transzgenikus egereken vizsgáltuk (2. táblázat). Ezek a transzgenikus egerek vérszegények voltak, amit a jelentősen csökkent vörösvérsejtszám bizonyít, a hemoglobin és a hematokrit elérte a normál szintek felét. A többi vörösvértest-paraméter, például a retikulociták százalékos aránya nem változott, ahogy az várható volt, ha veseelégtelenség okozta. Ezek az állatok következetesen -5,9±2,8 hónapos korukban pusztultak el veseelégtelenségben (n {{12}). }) a 39-es transzgénikus vonalra és későbbi életkorokra: -14,6±3,1 hónap (n= 20) és -11,7 ±6,5 hónap (n=7) ,a 3. és 41. sorhoz.

A CISTANCHE HATÁSAI: VESEBETEGSÉGEK KEZELÉSE

VITA

Itt egy egér PKD1 izolálásáról és jellemzéséről számolunk be (policisztás vesebetegség 1)-BAC. Ez a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) gént megjelölték, és a szabályozó elemeket két egymást követő homológ rekombinációs eseménnyel specifikusan a vesékben történő expresszió céljára cserélték ki. Ezzel az új SBPkdlrAG génnel előállított transzgenikus egerek a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) expressziójának 2--15--szeresét mutatták, és reprodukálhatóan fejlődtek ki a PKD-re jellemző korai vesemorfológiai változások. A veseelégtelenség középkorban nyilvánul meg, és az egerek idő előtt elpusztulnak veseelégtelenségben. Eredményeink azt is jelzik, hogy a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) túlzott expressziós mechanizmusát, amely ezért a fenotípusért felelős, a c-Myc in vivo jelátviteli aktiválása közvetíti. Ez a vizsgálat azt mutatja, hogy a rágcsáló PKD1 (policisztás vesebetegség 1) funkciója a vesékben elegendő egy PKD vesefenotípus létrehozásához.

Mivel az egér PKD1 (policisztás vesebetegség 1) gén nem duplikálódik, mint az emberben (27), közvetlenül azonosítottunk és izoláltunk egy BAC-klónt, amely a teljes PKD1-et tartalmazta (27).policisztás vesebetegség 1) gén. A 129/Sv egér PKD1 teljes jellemzése (policisztás vesebetegség 1)-BAC. két másik beltenyésztett egértörzzsel való közvetett összehasonlítás megerősítette a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) lókusz integritását. A PKD1 (policisztás vesebetegség 1A )-BACinszert -37-39 kb upstream és downstream szekvenciát tartalmazott a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) génjétől. Elemzésünk kimutatta, hogy a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) gén ebben a BAC-ban egy jóhiszemű rágcsáló vad típusú lókusz volt, amely további vizsgálatokhoz szolgálhat.

Bár erős bizonyíték van arra, hogy cisztaképződés ADPKD-ben (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) a normál PKD1 szomatikus inaktivációját követő heterozigótaság elvesztésének következménye lehet.policisztás vesebetegség 1) allél(3.21.32), arra is utaló bizonyíték van, hogy a cisztás tubuláris epitéliumban tartós vagy akár megnövekedett policisztin-1 expresszió (22.29). Ez utóbbi megfigyelés felveti a kérdést, hogy a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) túlzott expressziója önmagában elég közeli oka-e a cisztogenezisnek. Humán PKD1-et hordozó transzgenikus egerekben (policisztás vesebetegség 1), TSC2. RAB26. Az NTHL1 és SLC9A3R2 gének esetében csak az egerek kisebb részében alakult ki ciszta, és egyiknél sem volt kimutatható transzgén expresszió felnőttkorban, annak ellenére, hogy a transzgén 30 kópiája volt (31). Azokban a transzgénikus egerekben. nehéz volt megállapítani a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) túlzott expressziójának egyértelmű szerepét a cisztogenezisben. Modellünk különbözik, mivel a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) 2-9 vad típusú kópiája önmagában, összefüggő gének nélkül integrálódott transzgenikus egerekbe. Mivel a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) gén alapvető funkciókat tölt be különböző szervekben vagy szövetekben, amint azt számos, a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) génjének ablációjával rendelkező egérnél leírták, a PKD1 szisztémás túlzott expressziója.policisztás vesebetegség 1) további zavaró hatásokhoz vezethet. Következésképpen foglalkoztunk a PKD1 szerepével (policisztás vesebetegség 1) funkciójavítás olyan megközelítéssel, amely a PKD1-et (policisztás vesebetegség 1) kifejezetten a vesére célozza. Homológ rekombinációval először a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) upstream szabályozó régióját helyettesítettük az "SB" vese-korlátozott szabályozó elemekkel, ezzel megakadályozva a PKD1-re általában megfigyelhető csökkent génexpressziót.policisztás vesebetegség 1)felnőttkorban, valamint az esetleges másodlagos visszacsatolási hurok szabályozása (36,38). Másodszor, megjelöltük az egér PKD1-et (policisztás vesebetegség 1) transzgén (Pkdlr), amely a 10-es exonban csendes pont mutációt tartalmaz, de nem szúrt be epitóp címkét annak biztosítására, hogy egy teljesen működőképes "vad típusú" fehérje konzervált szerkezettel és integritással jöjjön létre. Ebből a módosított BAC-ból egy SBPkdlrAG fragmentumot megtisztítottunk a Tsc2 géntől és a BAC vektortól, hogy megakadályozzuk a Tsc2 gén általi interferenciát, amely szintén cisztás fenotípust indukálhat (8.20.28). valamint a prokarióta szekvenciák gátló hatásának elkerülése (5).

Négy különböző SBPkdlrActranszgén alapító egeret és három független vonalat állítottak elő specifikus vese PKD1-gyel (policisztás vesebetegség 1)-fokozott kifejezés. Különösen feltűnő a fenotípus teljes penetranciája ezekben a transzgenikus egerekben. Az SBPKD1 (policisztás vesebetegség 1) Az rAc alapító és egérvonalak számos, az ADPKD-vel (autoszomális domináns policisztás vesebetegséggel) közös fiziopatológiai jellemzőket mutattak. Ezek közé tartozik a ciszták kialakulása a kéregben, a velőben és a glomerulusokban, valamint a hámhiperplázia, az intersticiális fibrózis és a fokális intersticiális gyulladás.

Mivel a PKD fenotípust következetesen megfigyelték minden különböző transzgenikus alapító egérben, és a transzgén integrációja az egér genomjába véletlenszerű jelenség, a fenotípus nem a kromoszómapozíció hatásából, hanem csak a megnövekedett PKD1-ből ered.policisztás vesebetegség 1)kifejezés. Valójában a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) transzgén expressziója minden vonalban vesekorlátozottnak bizonyult. mint korábban megfigyeltük más, az "SB" elemek által szabályozott transzgéneknél (36, 38). Ráadásul ezt a megnövekedett PKD1 (policisztás vesebetegség 1) expresszióját a transzgén okozta, nem pedig egy közvetett endogén PKD1.policisztás vesebetegség 1) aktiválása. Eredményeink tehát egyértelmű bizonyítékot szolgáltatnak arra vonatkozóan, hogy a vad típusú funkcionális PKD1 (policisztás vesebetegség 1) funkciója több vese cisztát is eredményezhet. Fontos, hogy ezek az SBPKD1 (policisztás vesebetegség 1) gyakorlatok alkotják az első egérmodellt, amelyet a humán PKD1 egérortológjának egyetlen túlzott expressziója hozott létre.policisztás vesebetegség 1) gén.

Az SBPkdl-Ac egerek azt mutatják, hogy a PKD1 (policisztás vesebetegség 1)a túlzott expresszió a vese cisztogenezisének elsődleges patogenetikai mechanizmusa. Fontos, hogy a vesékben a legmagasabb transzgén expressziós szintek korrelálnak a fenotípus progressziójával és súlyosságával. Azt is megállapítottuk, hogy a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) túlzott expressziója az SBPKD1 kialakulásában (policisztás vesebetegség 1A )-Ac fenotípus valószínűleg a c-Myc in vivo aktiválódását jelzi. Elképzelhető, hogy ez az aktiválás akár közvetlenül is történhet a policisztin-1 C-terminális farkán keresztül, amely proteolitikus hasításon és nukleáris transzlokáción megy keresztül (7). nagyon konzisztens lenne a c-Myc támogatására, mint a PKD1 fő downstream effektorára (policisztás vesebetegség 1) jelátviteli utak Ez az eredmény korrelált az összes elemzett humán ADPKD (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) megnövekedett c-Myc expressziójára vonatkozó korábbi megállapításainkkal is (22). Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a c-Mye a PKD1 elsődleges közvetítője. (policisztás vesebetegség 1)cisztogenezis.

Eredményeink a PKD1-ből (policisztás vesebetegség 1) funkciójavítási modell, valamint az egér PKD1 (policisztás vesebetegség 1) haploinsufficienciája és funkcióvesztése azt jelzi, hogy bármely PKD1 (policisztás vesebetegség 1) szabályozási zavara cisztogenezishez vezethet (2.19.23-26.31.40). PKD1 által kiváltott súlyos PKD1 (policisztás vesebetegség 1) egyensúlyhiány egerekben (policisztás vesebetegség 1) az abláció vagy a transzgénikus túlzott expresszió a vese ciszták korai megjelenését és gyors progresszióját okozta, és a tubulusok nagy részét érintette. Ezzel szemben egy enyhébb PKD1 (policisztás vesebetegség 1) egyensúlyhiány, mint például a haploinsufficientia, a PKD lassabb progressziójához vezetett, több fokális cisztával. Egy hasonló fenotípus látszólagos paradox fejlődése ellentétes policisztin-1 diszreguláció révén a közös eredménnyel magyarázható, nevezetesen egy relatív fehérjekoncentráció-egyensúlyzavarral, amely megváltoztathatja egy aktív policisztin multiprotein komplex kialakulását vagy működését. Összességében a mi és más kutatók eredményei azt állítják, hogy a cisztaképződés mechanizmusa ADPKD-ben (autoszomális domináns policisztás vesebetegség) valószínűleg három patogenetikai mechanizmusból ered: a funkció növekedése, a funkció elvesztése és a géndózis hatásai.

Az SBPkdlrAc című regény; Az egerek a vese cisztogenezisének erőteljes modelljét alkotják, amely jelentős betekintést nyújthat a PKD, PKD1 patofiziológiájába (policisztás vesebetegség 1) jelátviteli útvonalak és kölcsönható partnerek. Ennek a modellnek a tanulmányozása új terápiás stratégiák kidolgozásához is vezethet a PKD1-en belüli normál fehérjeegyensúly helyreállítására.policisztás vesebetegség 1) multimer komplexum.

A Cistanche kezeli a vesebetegséget és javítja a veseműködést

IRODALOM

1. Blouin, MJ, H. Beachemin, A Wright, M. E. De Paepe, M. Surrette, AM. Gavallér. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos és M. Trudel. 2000. A sarlósejtes betegség genetikai korrekciója: betekintések transzgenikus egérmodellek felhasználásával Nat. Med.{4}}.

2 Boulter, C, S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle és R. Sandford. 2001.Szív- és érrendszeri, csontváz. és vesehibák egerekben a PKD1 célzott megzavarásával (policisztás vesebetegség 1)gén. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 9812174-12179.

3. Brasier, JL és EPHenske.1997. Elvesztése apolicisztás vesebetegség(PKD1）az 1φp13 kromoszóma régiója a vese ciszta sejtjében támogatja a ciszta patogenezisének funkcióvesztési modelljét. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connars, W. R. Dackowski, LR. Petry, TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker, R. ML Hakim, G. ML Landes, KW Klinger, F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino és N. A Doggett.1995. A genomiális szekvencia elemzéseautoszomális domináns policisztás vesebetegséggén előrejelzi a leucinban gazdag ismétlődés jelenlétét. Hum Mol, Genet.{1}}.

5. Chada, K, J. Magram, K. Raphael, G. Radice, E. Lacy és F. Costantini. 1985. Idegen -globin gén specifikus expressziója transzgenikus egerek eritroid sejtjében Természet 337-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Bought, Y. Cai B. Phakdeekitacharoen, LF. Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O. Devuryst, GG Germino és M.-C. Gubler.2002. PKDI és PKD2 transzkriptumok és fehérjék expressziója emberi embrióban és normál vesefejlődés során. Am. J. Pathol. 160973-983.

7.Chaurvet,V,X Tian,H.Husson,DH Grimm,T.Wang T.Hiesberger,P.Igarashi,AMBennett,O.braghimov-Beskrovnaya,S.Somlo és MJ Caplan.2004 Mechanikai ingerek hasadást és nukleáris hatást váltanak ki a pobeystin-1 C-terminális transzlokációja.J. Cin.Investig 114:1433-1443.

8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson és DJ Kwiatkowski 2000. Molekuláris genetikai előrelépés a gumós szklerózisban. Zümmögés. Genet10797-114.

9. Konzorcium, EPKD1993. A 16.Cell75 kromoszómán található gumós szklerózis gén azonosítása és jellemzése:1305-1315.

10. Konzorcium, EPKD1994.Azpolicisztás vesebetegség 1A gén a 16. kromoszóma sejt 7781-894 sejtjének duplikált régióján belül mindent átírható.

11. Konzorcium, L PK D 1995.Policisztás vesebetegség: a PKD1 teljes szerkezete (policisztás vesebetegség1) gén és fehérje. Ce 81:289-298

12. Couillard, M., R Guilkume, N Tanj, V. DAgati és M. Trudel.2002. c-Myc-indukált apoptózis inpolicisztás vesebetegségfüggetlen a FasL/Fas interakciótól. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, M. Land, M Trudy, 1904, A humán sarlósejtes glomerulopathia modellje. Kidney Int. 46:1337-1345.

14. GengL, Y, Segal B. PekseL N. Den Y. Pei, F. Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders és J. Zhou. 1996. A poliészter azonosítása és lokalizálása, a PKD1 (policisztás vesebetegség 1) géntermék. J. Clin. Investig. 98-2674-2682