Ⅱ rész A Smad3 hiány javítja a cukorbetegség és a diabéteszes vesekárosodás szigetalapú terápiáját azáltal, hogy elősegíti a sejtszaporodást az E2F3-függő mechanizmuson keresztül

Mód

1. Állatok

A Smad{0}}null (Smad3KO) egereket Chuxia Deng professzor kedves ajándékaként kezelték heterozigótákban (Smad3 plusz /- ) C57BL/6 háttérben [20]. A Smad3KO egereket Smad3 plus /- egerek keresztezésével hoztuk létre. A Lepr (Leptin receptor) C57BLKS háttérben mutációjával rendelkező db/db egereket a Hongkongi Kínai Egyetem (CUHK) Állatkísérleti Központjától vásároltuk. Minden állatot specifikus patogénmentes (SPF) létesítményben tartottak, ahol szabad hozzáférés biztosított az élelemhez és a vízhez 12/12 órás nappali/éjszakai ciklusban. Ebben a vizsgálatban az összes állati manipulációt a CUHK Állatkísérletek Etikai Bizottságának előírásait követve és az általa jóváhagyott Ref. No. 18-177-MIS.

2. Streptozocin (STZ) által indukált diabéteszes egérmodell

Hím C57BL/6 egereket 8-10 hetes korukban intraperitoneálisan 50 mg/kg/nap STZ-vel injektáltunk naponta 5 folyamatos napon keresztül. Az utolsó STZ injekció beadása után 5 nappal az egereket, amelyeknek stabil véletlenszerű vércukorszintje több mint 16 mM volt 2 egymást követő napon, úgy tekintettük, mint a diabétesz sikeres létrejöttét, és recipiens egerekként használták őket a szigettranszplantációhoz.

3. Sziget izolálása, transzplantáció és a diabéteszes fenotípus felmérése

A szigetecskéket hím vagy nőstény Smad3 knockout (KO) vagy vad típusú (WT) egerekből izoláltuk 8-10 hetes korukban a korábban leírtak szerint [21]. A szigettranszplantáció végrehajtásához több szigetet ültettek át hím db/db egerek vesekapszula alá a 4. hetes korban, vagy STZ-indukált cukorbeteg egerek vesekapszula alá az utolsó STZ injekciót követő 7. napon, a Szot és munkatársai által leírt protokoll szerint. 22]. Röviden, a recipiens egeret érzéstelenítéssel Combo (1,5% ketamin és 0,15% xilazin, 6 μl/g testsúly) érzéstelenítettük. Eszméletvesztés után a bal vesét borító bőrön 1 cm-es bemetszést végeztünk. Óvatosan húzza ki a vesét, és tartsa nedvesen steril sóoldattal a műtét alatt. Egy 25 G-os tűvel karcoljon meg egy kis karcolást a kapszulán, hogy bemetszést hozzon létre. A jelzett számú szigetecskét PE50 cső segítségével juttattuk be a vesekapszulába. Végtére is, a szigeteket átültették, zárja le a bemetszést alacsony hőfokon történő kauterizálással. Cserélje ki a vesét, és zárja le a peritoneumot varratokkal. Zárja le a bőrt kapcsokkal. 100 µl penicillin-sztreptomicin oldatot (Gibco, katalógusszám 15140122, USA) fecskendeztünk be intraperitoneálisan a fertőzés megelőzésére. 100 μl Tegmic-et adtak intramuszkulárisan a fájdalom enyhítésére. Az állatot meleg környezetbe helyezték a teljes gyógyulásig. Ugyanezt a műveleti eljárást álkontroll egereken is elvégeztük, de szigetinfúzió nélkül. A farokvég vérének véletlenszerű és 6 órás éhgyomri vércukorszintjét (RBG és FBG) is hetente ellenőriztük hordozható glükózmérővel (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Az inzulinrezisztencia tesztet (IPITT), a glükóz tolerancia tesztet (IPGTT), a HbA1c szintjét és a szérum inzulinszintet a korábban leírtak szerint mérték [9].

Kattintson ide a letöltésheza Cistanche előnyei

4. Összes vizeletfehérje és szérum kreatinin

24 órás vizeletet gyűjtöttünk egy metabolikus ketrecben. A 24 órás teljes vizeletfehérjét úgy számítottuk ki, hogy megszoroztuk a vizelet térfogatát és a vizelet fehérjekoncentrációját, amelyet a Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, cat# 5000201, USA) segítségével határoztunk meg. A szérum kreatinint a kreatinin mennyiségi meghatározó készlettel határoztuk meg (Stanbio Laboratory, cat# 0430-120, USA).

5. Szövetszövettan

A vese kórszövettani elváltozásait paraformaldehiddel fixált, paraffinba ágyazott metszeteken (4 µm) vizsgáltuk Periodic Acid-Schiff (PAS) reagenssel a korábban leírtak szerint [23]. A mesangiális mátrix kiterjesztését a kvantitatív képprogram (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics) segítségével pontoztuk a korábban leírtak szerint [23].

6. Immunhisztokémia

A szigeteket hordozó vesét vagy hasnyálmirigyet 4 százalékos paraformaldehidben rögzítettük, paraffinba ágyaztuk, és 4 μm-es metszeteket vágtunk. A rehidratálást követően a metszeteket mikrohullámú közvetített antigén-visszanyeréssel kezeltük 0.01 M citrátban (pH 6.0) 10 percig, majd 5 százalékos BSA-ban blokkolva 1 órán át. . Az elsődleges antitest-inkubálást egy éjszakán át 4 °C-on végeztük. A fluoreszcens festéshez fluoreszcens másodlagos antitestet alkalmaztunk szobahőmérsékleten (RT) 1 órán át. A DAB által közvetített termogenezis esetében az antigén visszanyerése előtt további 3 százalékos H2O2-blokkolást végeztünk 15 percig. Az elsődleges antitest-inkubálás után HRP-konjugált polimert (Envision plus System, Dako, USA) adtunk hozzá. Az E2F3 festéséhez EDTA-Tris oldatban (pH 9,0) végeztünk antigén-visszakeresést. Az immunhisztokémiában használt antitesteket az S2 táblázat részletezi. A festődés-pozitív terület mennyiségét Image J szoftverrel (v1.47, NIH, USA) határoztuk meg.

Cistanche kivonat

7. Átültetett sejttömeg mérése a szigeteket hordozó vesében

A metszetenkénti átlagos sejtterület indexét alkalmaztuk a szigetgraft sejttömegének félig kvantitatív meghatározására. Röviden, a szigetecskéket hordozó vesét (paraffinba ágyazott) egymást követően 4 μm-es metszettel vágtuk a szagittális tengely mentén. A folyamatos metszeteket 160 μm-es intervallumokban fluoreszcens immunfestéssel festettük inzulinra. Minden egérben legalább 6 inzulin-pozitív festéssel rendelkező metszetet használtunk a metszetenkénti sejtterület kiszámításához. Az egyes szakaszokban az inzulin-pozitív sejtterületet Image J szoftverrel (v1.47, NIH, USA) számszerűsítettük. Az egyes egerek metszetenkénti átlagos sejtterületének indexét úgy számítottuk ki, hogy a teljes inzulin-pozitív területet elosztottuk az összes szakaszra az inzulin-pozitív szakaszok számával.

8. Szigetsejtek elsődleges tenyésztése

Az izolált szigetecskéket különálló sejtekké disszociáltuk, és a 96-lyuklemezre oltottuk 200 μl RPMI 1640-ben (Gibco, USA) plusz 10% FBS-ben (Gibco, USA) plusz 1% penicillin-sztreptomicinben (Gibco, USA). 20 mM glükózzal kiegészítve. A szigetsejteket a jelzett ideig tenyésztettük 37 °C-on, 5% CO2-on és 100% páratartalom mellett beállított inkubátorban. Az E2F3 adenovírus által közvetített leállításához a disszociált szigetsejteket olyan tápközegben tenyésztjük, amely rövid hajtű RNS-t (shRNS) túlexpresszáló adenovírust tartalmazott, amely egér E2F3-at (shE2F3) vagy kontroll nem specifikus shRNS-t (lásd) sejtenként 10 pfu titerrel 2 percig. nap, majd közepes csere. A shE2F3 duplex törzsszekvenciája 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3' volt. 50 szigetecske diszpergált sejtjeit lyukanként oltottuk be immunfestéshez és RT-PCR-hez, és lyukanként 100 szigetecskét Western-blothoz, amelyeket a korábban leírtak szerint végeztünk [9].

9. In vivo és in vitro BrdU jelölés

Az in vivo BrdU jelölés végrehajtásához az egereket intraperitoneálisan 50 mg/kg/nap BrdU-val (PBS-ben) injektáltuk a szigettranszplantációt követő 2. naptól számítva 7 napig, majd az utolsó injekció után 2 órával leöltük. Az in vitro BrdU jelöléshez a diszpergált szigetsejteket 48 órán át tenyésztettük, majd 10 μM BrdU-t tartalmazó friss tápközeggel helyettesítettük, és további 24 órán át tenyésztettük. A BrdU elleni fluoreszcens immunfestést a szövetekben és a tenyésztett sejtekben a korábban leírtak szerint végeztük [9].

Cistanche por

10. RNS-Seq

A szigeteket Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m és Smad3KO-db/m egerekből izoláltuk. Minden genotípus esetében több mint 5 egér szigetecskéit egyesítettük az RNS izolálása céljából. Az RNS-t a miRNeasy Mini Kittel (Qiagen, Németország) állítottuk elő. Az RNS-seq-et és a downstream adatelemzést korábban leírták [9]. Egy adott gén expressziós szintjét a transzkriptum egy kilobázisonkénti fragmentumaként mutattuk be millió leképezett leolvasásra (FPKM). A differenciálisan expresszált gént (DEG) úgy határoztuk meg, hogy az FPKM két csoport közötti varianciája nagyobb vagy egyenlő, mint 2-szeres. A fel- és leszabályozott DEG-eket egyesítettük, és a Gene Ontology (GO) és a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) útvonalgazdagítási elemzéséhez használták az online DAVID bioinformatikai erőforrásokkal (v6.8) alapértelmezett beállításokkal. A GOTERM_BP_DIRECT alkategóriát használták a GO elemzéshez.

11. Immunprecipitáció

Az egérszigeteken történő immunprecipitáció végrehajtásához körülbelül 500 frissen izolált szigetet lizáltunk 500 ml RIPA pufferben. Hozzáadtunk egy nyúl anti-Smad3 antitestet (2 ug) vagy nyúl IgG izotípust, és 4 °C-on inkubáltuk egy éjszakán át enyhe forgatással. Ezután 20 μl protein A agarózgyöngyöt (Beyotime, kat. P2051, Kína) adtunk hozzá, és 2 órán át 4 fokon inkubáltuk. Friss RIPA pufferrel való erőteljes mosás után a kötött fehérjét 1xSDS töltőpufferben történő denaturálással szabadították fel, és Western blot analízisnek vetettük alá. Az IgG nehéz lánc befolyásának elkerülése érdekében egy könnyű láncra specifikus egér anti-nyúl IgG-t (HRP konjugált, Abmart, cat# M21006, Kína) használtunk a kicsapódott Smad3 fehérje felismerésére.

12. Kromatin immunprecipitáció-ChIP

A ChIP egérszigeteken történő végrehajtásához körülbelül 2000 szigetecskét gyűjtöttünk össze 8-10 hetes C57BL/6 egerekből, és egy ChIP-készítményként használták fel. A frissen izolált szigetecskéket 10 ng/ml TGF- 1-val (Gibco, USA) stimuláltuk 15 percig RPMI 1640-ben, plusz 1% FBS plusz 1% Penicillin-sztreptomicin. A ChIP-t a SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit-tel (CST, USA) végeztük az ajánlott utasításokat követve. A ChIP vizsgálatban használt antitesteket és primereket az S1 és S2 táblázat részletezi.

Szabványosított Cistanche

13. Kettős luciferáz riporter vizsgálat

Az egér E2F3 promóterét (-1000 - plusz 451 bp) a pGL3-alapvektorba (pGL3-E2F3.Pro) klónoztuk. Ezzel párhuzamosan a Smad3 kötőhely pontmutációját is végrehajtották a pGL3- E2F3.Pro előállításához. Mut. A kettős luciferáz riporter vizsgálat elvégzéséhez HEK293T sejteket oltottunk a 24-lyuklemezre 5 x 104 sejt/lyuk sűrűséggel. Másnap a sejteket 500 ng pGL3-Basic vagy pGL3-E2F3.pro vagy pGL3-E2F3.pro.mut és pcDNA3 kombinációval transzfektáltuk.1-Smad3, amely túlzottan expresszálja az egér Smad3-at, vagy sem (a 10F. ábrán látható módon) foszfát-kalcium módszerrel. A pEGFP-C1 vektort kiegészítettük, hogy kiegyensúlyozzuk a transzfekciós dózist az egyes kezeléseknél. 10 ng renilla luciferázt expresszáló pGL4.73.huc/SV40 vektort adtunk minden kezeléshez a transzfekció hatékonyságának normalizálása érdekében. 6 órával a transzfekció után a tápközeget kicseréltük, majd további 48 órán át inkubáltuk. A sejteket lizáltuk, és a luciferáz aktivitást a Dual-Luciferase® Reporter Assay System rendszerrel (Promega, USA) határoztuk meg, és egy luminométerrel (VICTORTM X{40}} Multilabel Reader, PerkinElmer, USA) határoztuk meg. A klónozott E2F3 promoter transzkripciós aktivitását a szentjánosbogár-luciferáz és a renilla-luciferáz értékarányaként mutattuk be. Minden kezelést háromszor végeztünk.

14. Statisztika

Az adatokat átlag ± SD formában mutattuk be, és SPSS szoftverrel elemeztük (16.0). Az adatok normálisságát az Egymintás Kolmogorov-Smirnov teszttel ellenőriztük. A csoportok közötti varianciák homogenitását a Levene statisztika tesztelte. A két csoport összehasonlítására a Student-féle t-próbát alkalmaztuk. A több csoport közötti összehasonlításhoz egyutas ANOVA-t alkalmaztunk LSD-teszttel, ha egyenlő szórást feltételeztünk. A nem feltételezett egyenlő szóráshoz egy alternatív Welch-teszt statisztikát alkalmaztunk, majd többszörös összehasonlítást végeztünk Tamhane T2 tesztjével. P < 0,05 statisztikailag szignifikánsnak számított.

Cistanche kiegészítők

Következtetések

A Smad3 hiány nagymértékben javítja a szigetpótló terápiát mind a T1DM, mind a T2DM esetében, és véd a diabéteszes vesekárosodás ellen. A fokozott E2F3-dependens sejtproliferáció a Smad3KO szigetterápia kulcsmechanizmusa lehet mind T1DM, mind T2DM esetén. Így a Smad3KO sejtpótló terápia klinikailag jobb terápiás stratégia lehet a cukorbetegség kezelésére.

Hivatkozások

1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Clinical pancreas szigettransplantation. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.

2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Humán pluripotens őssejtek differenciálódása funkcionális hasnyálmirigysejtekké a cukorbetegség kezelésében: innovációk, kihívások és jövőbeli irányok. J Biol Eng. 2017; 11:21.

3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S és mások. Szövettani graft értékelés klinikai szigettranszplantáció után. Átültetés. 2009; 88: 1286-93.

4. Lan HY. A TGF-béta/Smads különböző szerepei a vesefibrózisban és gyulladásban. Int. J. Biol. Sci. 2011; 7: 1056-67.

5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-béta/Smad jelátvitel vesefibrózisban. Front Physiol. 2015; 6:82.

6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K et al. Smad jelátviteli hálózat szabályozza a szigetsejt-proliferációt. Cukorbetegség. 2014; 63: 224-36.

7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. A TGF-béta Signaling gátlása elősegíti az emberi hasnyálmirigy béta-sejt replikációját. Cukorbetegség. 2016; 65: 1208-18.

8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V és mások. A DYRK1A, SMAD és Trithorax útvonalak kombinált gátlása szinergiázik, és robusztus replikációt indukál felnőtt emberi béta-sejtekben. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH és mások. A Smad3-hiány elősegíti a béta-sejtek proliferációját és működését db/db egerekben a Pax6 expresszió helyreállítása révén. Theranostics. 2021; 11: 2845-59.

10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Egy módszer rágcsálószigetek izolálására és szubkapszuláris veseátültetésre. J Vis Exp. 2011.

11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH és társai. A szigetizotranszplantáció javítja az inzulinérzékenységet a 2-es típusú cukorbetegség egérmodelljében. Endokrin. 2021; 72: 660-71.

12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. A p16ink4a és p19ARF indukciója TGFbeta1 által hozzájárul a növekedés leállásához és az öregedési reakcióhoz egér keratinocitákban. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.

13. Dyer MA, Cepko CL. A proliferáció szabályozása a retina fejlődése során. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.

14. Dyson N. Az E2F szabályozása a pRB-család fehérjéi által. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.

15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J et al. A TGFbéta-receptor jelátvitelének átmeneti elnyomása megkönnyíti az emberi szigetek transzplantációját. Endokrinológia. 2016; 157: 1348-56.

16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Az SMAD2 zavar az egér hasnyálmirigy béta sejtjeiben szigethiperpláziához és az inzulinszekréció károsodásához vezet az ATP-érzékeny K plusz csatorna aktivitás gyengülése miatt. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.

17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P és mások. Az E2F3 túlzott expressziója elősegíti a funkcionális humán béta-sejtek proliferációját anélkül, hogy apoptózist indukálna. Sejtciklus. 2013; 12: 2691-702.

18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. TGF-béta család jelzés a sejtszaporodás és a túlélés szabályozásában. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.

19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. A diabetes mellitus--előrehaladása és kihívásai az emberi béta-sejtek proliferációjában. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.

20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H és társai. Az SMAD3 célzott megszakítása csökkent nyálkahártya immunitást és csökkent T-sejtek TGF-béta-reakciót eredményez. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.

21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokoll a szigetek izolálására az egér hasnyálmirigyéből. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.

22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Hasnyálmirigy-szigetek transzplantációja cukorbeteg egerek vesekapszulájába. J Vis Exp. 2007: 404.

23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q és társai. A Smad3 törlése megakadályozza a vesefibrózist és a gyulladást a 2-es típusú diabéteszes nephropathiában. Anyagcsere. 2020; 103: 154013.

Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 és Hui-Yao Lan2,7

1 Integrált Orvostudományi Kutatóközpont és Nefrológiai Osztály, Hagyományos Kínai Orvostudományi Kórház, a Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kína.

2. Orvosi és Terápiás Osztály és Li Ka Shing Egészségtudományi Intézet, Hongkongi Kínai Egyetem, Hong Kong, 999077, Kína.

3. Guangdong-Hongkongi Immunológiai és Genetikai Vesebetegségek Közös Laboratóriuma, Guangdong Tartományi Népi Kórház, Guangdong Orvostudományi Akadémia, Guangzhou, Guangdong, 510080, Kína.

4. Állami Kulcsfontosságú Bioelektronikai Laboratórium, Jiangsu Bioanyagok és Eszközök Kulcslaboratóriuma, Biológiai Tudományok és Orvostechnikai Iskola, Southeast University, Nanjing, Kína.

5. Zhanjiang város krónikus vesebetegségének megelőzésével és kezelésével foglalkozó kulcslaboratórium, Nephrológiai Intézet, Guangdong Orvosi Egyetem társult kórháza, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kína.

6. Nemzeti Hagyományos Kínai Orvoslás Klinikai Kutatóbázis, Hagyományos Kínai Orvostudományi Kórház, a Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kína.

7. CUHK-Guangdong Tartományi Népi Kórház Immunológiai és Genetikai Vesebetegségekkel foglalkozó Közös Kutatólaboratóriuma, Hongkongi Kínai Egyetem, Hongkong, 999077, Kína.