Ⅰ rész Az étrendi fehérje- és rostszint hatása a növekedési teljesítményre, a köszvény előfordulására, a bélben élő mikroorganizmusok közösségeire és az immunregulációra a kislibák bélvese tengelyében

Absztrakt

A jelenlegi tanulmány értékelte az étrendi fehérje- és rostszintek hatását a kislibák növekedési teljesítményére, a köszvény előfordulására, a bélben lévő mikrobiális közösségekre és az immunregulációra a kislibák bél-vese tengelyében. Egy teljesen randomizált, 2 £ 3 faktoros elrendezést alkalmaztak 2 CP szinttel (180 [18 CP] és 220 [22 CP] g/kg) és 3 nyersrost (CF) szinttel (30 [alacsony CF], 50 [közepes CF], és 70 [magas CF] g/kg). A magas CP vagy alacsony CF étrend hajlamosította a kislibákat köszvényre. A magas fehérjetartalmú étrend rontotta a veseműködést; az UA és a Cr szérumkoncentrációja, valamint az XOD aktivitás a 9-napos kislibákban, akiket 22 százalékos CP-t tartalmazó étrenddel etettek, jelentősen megnőtt. Bár a 3-7 százalékos CF-szint nem befolyásolta közvetlenül a vese egészségét, a CF-szint növekedése felgyorsíthatja a probiotikumok növekedését a kislibák vakbélében, és visszatarthatja a rosszindulatú baktériumokat, enyhítve a magas fehérjetartalmú étrend által okozott bélrendszeri diszbiózist. A vakbél mikrobióta 16Sr RNS szekvenálással végzett elemzése azt mutatta, hogy az Enterococcus abundanciája a 22CP csoportban magasabb volt, mint a 18CP csoportban, de a CF szint növekedésével csökkent a 9. napon. A Lactobacillus abundanciája nőtt a CF szint növekedésével. Ezenkívül a magasabb szérum LPS és proinflammatorikus citokin koncentrációk, valamint a fokozott mRNS expressziós szint a vakbél-, mandula- és veseszövetekben azt jelezték, hogy a magas fehérjetartalmú étrend aktiválhatja a TLR4/MyD88/NFkB útvonalat, és bél- és vesegyulladást is indukálhat fiatal kislibákban. A 9. napon a szérum LPS-koncentrációja csökkent a CF növekedésével, bár az étrendi CF-szintek változása nem befolyásolta közvetlenül a kislibák szérum immunindexét. Összefoglalva, a magas CP-tartalmú étrend negatív hatást gyakorolt ​​a köszvény előfordulására, a mikrobiális közösségekre és az immunregulációra a kislibák bél-vese tengelyében, míg a megfelelően megemelt élelmi rostszint segített fenntartani a bélrendszer egyensúlyát és csökkentette a szérum LPS-koncentrációját. Javasoljuk a 18 százalékos CP-t és 5 százalékos CF-t, mint az optimális kombinációt a kislibák takarmányozására.

Kulcsszavak

nyersrost, fehérje, kislibák köszvénye, bélrendszeri mikrobiális közösségek, bél-vese tengely,A Cistanche előnyei.

Kattintson ide, hogy megtudjamilyen hatásai vannak a Cistanche-nak a vesére

Bevezetés

A növényevő libák az élelmi rostoktól függenek a normál tevékenységek elvégzéséhez. A mérsékelt nyersrost (CF) szintről az étrendben ismert, hogy fokozza a betegségekkel szembeni ellenállást és elősegíti a baromfi növekedését azáltal, hogy módosítja a bél mikroökológiai egyensúlyát és fokozza az immunfunkciókat (Jha és Mishra, 2021) Wils-Plotz et al. (2013). beszámoltak arról, hogy az étrendi pektin felvétele fokozta az IL- 12 expresszióját a csípőbél nyálkahártyájában, és növelte az interferon-g termelést a vakbélmandulákban. Számos tanulmány kimutatta, hogy az alacsony CF-tartalmú étrend csökkenti a mikrobiális diverzitást, valamint a hasznos mikrobiota relatív bőségét a lúd vakbélben a 70. napon, ezáltal negatívan befolyásolja e libák növekedési teljesítményét, tápanyag-felhasználását és bélnyálkahártya immunitását (Li et al., 2017; Li et al., 2018a). A diétás CF elősegítheti a bélgát működésének fenntartását a nyálkahártya szerkezetének és működésének erősítésével, valamint a gasztrointesztinális traktusban a kommenzális baktériumok populációjának és sokféleségének növelésével. Ennél is fontosabb, hogy a fiatal madarak állítólag érzékenyebbek az étrendi tápanyagok és a bélmikrobiális közösségek változásaira, mint a felnőttek (Gao et al., 2017). A táplálékkal felvett CF-szinteknek a bélmikrobiótára és a kislibák betegségekkel szembeni rezisztenciájára gyakorolt ​​hatásáról azonban kevés tanulmány született.

A madarak növekedési teljesítménye kevésbé érzékeny a fehérjeszint változásaira, mint a takarmány táplálékenergiájának változásaira, hogy kielégítse eredeti akaratlagos természetét (Shi et al., 2006). Beszámoltak arról, hogy nem figyeltek meg szignifikáns különbséget a súlygyarapodásban azoknál a libáknál, akiknél a táplálék fehérjeszintje 16-22 százalék volt, ami túlságosan általánosnak tűnik (Summers et al., 1986). Ezzel szemben az étrendi fehérje koncentrációja erős hatást gyakorol a baromfi bélflóra egyensúlyára és betegségekkel szembeni ellenálló képességére (Lee et al., 2020). A főként madarakban előforduló zsigeri köszvény egy anyagcsere-betegség, amelyet a károsodott veseműködés okoz, amit az urátkristályok felhalmozódása követ a különböző szervekben (Zhang et al., 2018). Egy korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy a magas fehérjetartalmú étrend szerepet játszik a köszvényhez kapcsolódó vesekárosodásban és a bélmikrobióta diszbiózisában kislibáknál (Xi et al., 2020a). A tanulmány eredményei azt mutatták, hogy a 16 és 18 százalékos nyersfehérje (CP) diétával etetett kislibákhoz képest a 22 százalékos CP diétával etetett kislibák bélhámsejt-sérülést és vakbél-mikrobióta diszbiózist szenvedtek, ami vesekárosodáshoz, vagy akár köszvényhez vezetett. Úgy tűnik, hogy a gasztrointesztinális traktus mikrobiotája és metabolitjai központi szerepet játszanak a baromfi bél-vese tengely immunitásának erősítésében (De Cesare és mtsai, 2019; Xi és mtsai, 2020b). Így egy megfelelő táplálkozási program meghatározása, amely az étrendi CF- és CP-szintek hatásaira összpontosít, segíthet minimalizálni a köszvény előfordulását, és fokozhatja az immunitást a bél mikroökológiai egyensúlyának fenntartása és a relatív immunszabályozás javítása révén a kislibáknál.

A bél mikrobióma mélyreható hatást fejt ki a bélrendszer immunszabályozására, ami befolyásolja a szisztémás immunitást és hozzájárul az immunrendszer egyensúlyához. Az étrend-összetétel változásai, beleértve a CP- és CF-szinteket, befolyásolják a bélkörnyezethez alkalmazkodó mikrobiota összetételét és metabolikus aktivitásait (Liu et al., 2014). Baromfi esetében a mikrobiom bármely megzavarása a szisztémás immunitás egyensúlyának felbomlását idézheti elő, ami hozzájárul a betegségekkel szembeni rezisztencia csökkenéséhez. Egy korábbi vizsgálatunkban azt találtuk, hogy a bélmikrobióta dysbiosis növelte a zsigeri köszvény kockázatát a kislibákban azáltal, hogy fokozza a gyulladást, valamint a bélből származó lipopoliszacharid (LPS) transzlokációját a bél-vese tengelyben. Ebben a komplex kaszkádban az LPS-ligálás aktiválja a nukleáris faktort, az aktivált B-sejt (NF-kB) útvonal kappa-könnyűlánc-erősítőjét, valamint a gyulladást elősegítő citokinek, például az interleukin 1b (IL1b) és a tumornekrózis faktor termelését. a (TNFa), így elősegíti az immunológiai tolerancia kialakulását a kislibák belében és veséjében (Xi et al., 2019). A jelen tanulmány a különböző szintű táplálékkal táplált CP-vel és CF-vel táplált kislibák vakbélében élő mikrobiális közösségek vizsgálatára összpontosított, és a köszvény előfordulásának változásait mérte a bél-vese tengelyben kiváltott immunregulációs és gyulladásos válaszok elemzésével.

Szabványosított Cistanche

Anyagok és metódusok

1. Etikai jóváhagyás

A vizsgálatot a Jiangsu Agrártudományi Akadémia Kutatási Bizottsága hagyta jóvá, és a kísérleti állatokkal kapcsolatos ügyek adminisztrációjának szabályzata szerint végezték el (a Jiangsu Agrártudományi Akadémia 2014. július 8-i 63. számú rendelete). Minden kísérletet az ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) irányelvei szerint végeztünk.

2. Kísérleti tervezés

Ezt a vizsgálatot november 2. és 2. 020. 17. között végezték a Jiangsu Agrártudományi Akadémia Kísérleti Állatközpontjában (Nanjing, Kína). A Tianzhijiao Breeding Geese Limited Company (Csucsou, Kína) által szállított összesen 1,620 egynapos tajcsu libát (Anser domestica, 100 százalék ,) véletlenszerűen besoroltak 6 kísérleti csoport. Mindegyik kezelés 6 ismétlésből állt, és mindegyik ismétlés 45 madarat tartalmazott. A kísérlethez teljesen randomizált, 2 £ 3-os faktoriális elrendezést használtunk. Hat diétát állítottunk elő 2 CP-szinttel és három CF-szinttel (1. táblázat). A 2 CP szint 180 (18 CP) és 220 (22 CP) g/kg volt, a három CF-szint pedig 30 (alacsony CF), 50 (közepes CF) és 70 (magas). CF) g/kg. Valamennyi kislibát termosztatikus házban neveltek fel azonos méretű rozsdamentes acél ketrecekkel (1,20 £ 1,00 £ 0,50 m3, 9 liba/ketrec, állománysűrűség: 7,5 madár/m2), amelyeket 0,50 m-rel a talaj felett helyeztek el. A kislibákat standard kezelési körülmények között etettük pellet takarmány és ad libitum vízzel. A függő etetők és mellbimbóitatók száma minden ketrecben elegendő volt a vizsgálat során. A környezeti hőmérsékletet d 0-tól 3-ig 30 fokon, d 4-től 6-ig 29 fokon, d 7-től 9-ig 28 fokon, d 10-től 26 fokon tartottuk a kísérlet végéig. A relatív páratartalom a 21-d kísérleti időszakban körülbelül 60 százalék volt. A fényforrásokat (fehér fény, 400–760 nm) 15 § 0,3 lux megvilágításra kiegyenlítettük a madárfej szintjén, 22 órás világítási ütemezéssel d 0-tól 3-ig, 18 órán át d-től. 4-től 14-ig, és 16 óra fény d 15-től 21-ig egy 24-órás ciklusban.

The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>Az 5 helyről véletlenszerűen beszerzett friss takarmány 1 százalékát összekevertük elemzés céljából. A CP-t és a CF-et a GB/T6432 (Kínai Nemzeti Szabvány: Nyersfehérje meghatározása a takarmányban) és a GB/T6434 (Kínai nemzeti szabvány: A takarmány nyersrost-tartalmának meghatározása) szerint mértük.

A kislibák ADFI-jét és BW-jét (élősúlyát) elektronikus mérleggel (YP60001, Hengji, Sanghaj, Kína) rögzítettük a teszt során az etetés előtt, és a kísérlet végén kiszámítottuk az ADG-t és a takarmánykonverziós arányt (FCR). Ezen túlmenően a kísérleti időszak után összesítettük a köszvény kumulatív morbiditását az összes ismétlésnél (minden ismétlés 45 madarat tartalmazott) a különböző kezelések között. A köszvény szelekciós standardját úgy határozták meg, hogy a kislibák súlyos veseelváltozásokat mutatnak, és a szérum húgysav (UA) koncentrációja meghaladja az urát túltelítettség határértékét (hím, 416 mmol/l és nőstény, 357 mmol/l). A vese tipikus durva elváltozásai sápadtak, foltosak és duzzadtak, a vesetubulusok és az ureterek pedig túlterheltek a felesleges uráttal (Xi et al., 2020a).

Herba Cistanche

3. Szérum metabolit mérés

Harminchat kislibát (n=6 liba/kezelés) választottunk ki véletlenszerűen azonnali vérvételre (5 ml/liba), a lefejezést követően, vérvételi csöveken keresztül, antikoaguláns nélkül, 9. és 18. napon. Az összes vérmintát 2 órán át 37 fokon inkubáltuk az összegyűjtés után, és 1,5{{10}}0 £ g-vel centrifugáltuk 15 percig. A kapott szérumokat 0,6 ml-es Eppendorf-csövekben tároltuk 80 fokon a további elemzésig. A szérum UA-szintjét foszfovolfrámsav-kolorimetriával határoztuk meg. A kreatinin (Cr) és a karbamid-nitrogén (UN) koncentrációját, valamint a xantin-oxidáz (XOD) aktivitását enzimatikus kolorimetriával határoztuk meg mikrolemezes spektrofotométerrel (Promega Corporation, Madison, WI). Ezeket a készleteket a Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kína) szállította; a kódok a következők voltak: C012 (UA), C011-2 (Cr), C013-2 (UN) és A002 (XOD). A kísérleti libák szérum IgM-, IgA- és IgG-koncentrációit a Shanghai J&I Biotechnology Co., Ltd-től (Sanghaj, Kína) vásárolt liba immunglobulin ELISA kittel mértük. A szérumban keringő immunkomplexeket (CIC), az IL-1b-t és a TNF-a-koncentrációt kereskedelmi forgalomban lévő liba ELISA készlettel (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína) határoztuk meg. A diamin-oxidáz (DAO) aktivitását enzimatikus kolorimetriával mértük egy automata biokémiai analizátor segítségével (Hitachi, Tokió, Japán). A szérum LPS-t a hagyományos Limulus assay (Limulus Assay Biotechnology Company Ltd., Xiamen, Kína) alkalmazásával mértük. Az LPS kimutatási tartománya a Limulus assay-ben 0,015 és 0,6 EU/ml között volt. A vérvételhez és az endotoxinok méréséhez használt összes anyag pirogénmentes volt. Minden vizsgálatot a gyártó utasításai szerint végeztünk. A szérummintákat három párhuzamosban vizsgáltuk. Az esszéken belüli és interassay variációs koefficiensek a következők voltak<10% and <15%, respectively.

4. Hisztomorfológiai megfigyelés

36 liba (n=6 liba/kezelés) vakbélét (hossza {{0}} cm) a 9. és 18. napon vett vérminta után gyűjtöttük szövettani elemzés céljából. A kislibákról gyűjtött mintákat 4 százalékos paraformaldehidben fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, majd metszettek (szeletvastagság: 3 mm; 4 szelet kislibánként). A vakbél kóros elváltozásait (a pylorus záróizomtól kb. 7 cm-re disztálisan) fénymikroszkóp alatt (OLYMPUS, Tokió, Japán) vizsgáltuk hematoxilin és eozin (HE) festés után. A vakbél villus magasságát és kripta mélységét ImageJ szoftverrel (1.8.0-s verzió; National Institutes of Health, Bethesda, MD) mértük. Szeletenként nyolc mérést rögzítettünk különböző ép bolyhokról (8 mérés 3 egymást követő látómezőben). A szövettani mérések statisztikai elemzését libánként átlagosan 32 mérés alapján végeztük (4 szelet libánként és 8 mérés szeletenként). A kehelysejt-sűrűséget úgy számítottuk ki, hogy a kehelysejtszámot elosztottuk a megfelelő bolyhok hosszával, amelyet azután átlagoltunk, és a kehelysejtszámként fejeztük ki a bolyhok 100 mm-ére vonatkoztatva.

Cistanche tubulosa

5. A vakbél tartalmának 16S rRNS szekvenálása

A libák vakbél tartalmát (6 kisliba/kezelés £ 6 csoport £ kétszer mintavétel=72 kislibák) a 9. és a 18. napon 2 ml-es steril, belső menetes kriogén fiolákba gyűjtöttük, és azonnal folyékony nitrogénben tároltuk a 16S rDNS elemzéshez. . A vakbél tartalmú mintákból származó DNS-t MicroElute Genomic DNA Kit (D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA) segítségével extraháltuk a gyártó utasításait követve. A fel nem használt tamponokból álló vakmintákat DNS-extrakcióval dolgoztuk fel, és ellenőriztük, hogy nem termelnek 16S amplikont. A teljes DNS-t 50 ml elúciós pufferben eluáltuk a gyártó által leírt módosított eljárással (QIAGEN, Düsseldorf, Németország), és 80 °C-on tároltuk.

A minták teljes DNS-ét templátként és 16S rDNS primereket (343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30; 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30 ) felhasználva amplifikáltuk a bakteriális V3-V4 régiót. 16S rRNS. Az összes reakciót 25 ml-es (teljes térfogatú) keverékben hajtottuk végre, amely 25 ng genomiális DNS-kivonatot, 12,5 ml PCR-premixet, 2,5 ml mindegyik primert és PCR-minőségű vizet tartalmazott a térfogat beállításához. A PCR-termékeket AxyPrep Mag PCR Normalizer (Axygen Biosciences, Union City, CA) segítségével normalizáltuk, amely lehetővé tette a kvantifikációs lépés kihagyását, függetlenül a szekvenálásra benyújtott PCR-térfogattól. Az amplikon poolokat AMPure XT gyöngyök (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA; az OebioTech Co., Ltd., Shanghai, Kína) segítségével készítettük elő a szekvenáláshoz. Az amplikon könyvtár méretét és mennyiségét LabChip GX (Perkin Elmer, Waltham, MA) és Kapa Library Quantification Kit for Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA) segítségével határoztuk meg. A PhiX Control könyvtárat (v3) (Illumina) egyesítettük az amplikon könyvtárral (várhatóan 30 százalék). A könyvtárat körülbelül 570 K/mm2 sűrűségben csoportosították. A könyvtárakat 300PE MiSeq futtatással szekvenálták, ahol az egyik könyvtárat mindkét protokollal szekvenálták szabványos Illumina szekvenáló primerek használatával, ezáltal kiküszöbölve a harmadik (vagy negyedik) indexleolvasás szükségességét. A leolvasott értékeket a mikrobiális ökológia (QIIME;) minőségi szűrők segítségével szűrtük. A CDHIT csővezetéket az operatív taxonómiai egységek (OTU) kiválasztására használták egy OTU táblázat elkészítésével. A 97 százalékos hasonlóságú szekvenciákat OTU-khoz rendeltük. Minden OTU-hoz kiválasztottuk a reprezentatív szekvenciákat, majd a Ribosomal Database Project (RDP) osztályozó segítségével minden reprezentatív szekvenciához taxonómiai adatokat rendeltünk. Ezen OTU nukleotidszekvenciák GenBank hozzáférési száma SAMN21014082. Az alfa-diverzitás becsléséhez az OTU táblázatot ritkítottuk, és a következő 4 mérőszámot számítottuk ki: a Chao1 metrika a gazdagság becslésére; a megfigyelt fajmutató a mintában talált egyedi OTU-k számaként; a Shannon-index; és a Simpson index.

6. Valós idejű PCR

a 9. és 18. napon gyűjtöttük be a valós idejű PCR (RT-PCR) elemzéshez. A teljes RNS-t TRIzol reagenssel (Life Technologies, Grand Island, NY) extraháltuk a szövetekből, és fordított transzkripciót végeztünk Reverse Transcription Levels készlettel (TaKaRa, Dalian, Kína), a gyártó protokollja szerint. b-aktint alkalmaztunk invariáns kontrollként. A primereket a Primer Premier 5.0 szoftverrel terveztük, és szekvenciáikat felsoroltuk (2. táblázat). Az RT-PCR-t SYBR Premix Ex Taq (Roche, Basel, Svájc) alkalmazásával végeztük. Minden RT-PCR-t három párhuzamosban végeztünk. A célgének relatív expressziós szintjét a 2 DDCt módszerrel határoztuk meg.

7. Adatelemzés

A kezelésenként 6 ismétlésből származó kísérleti adatokat az IBM SPSS Statistics 16 program (IBM Corporation, Somers, NY) segítségével elemeztük. Minden ismétlést kísérleti egységnek tekintettünk, és az alkalmazott statisztikai eljárás többváltozós varianciaanalízis volt, az általános lineáris modelleljárás (GLM) alkalmazásával. Amikor szignifikáns különbségeket állapítottak meg, a kezelési átlagokat elválasztottuk és összehasonlítottuk a Duncan-féle több tartományú teszttel. Egy kétirányú tesztet 5 százaléknál kisebb valószínűségi szinten tekintettek statisztikailag szignifikánsnak (P < 0,05).

Yumeng Xi *, Yuanpi Huang, y Yue Li *, Yunmao Huang #, Junshu Yan * és Zhendan Shi *.

* A Mezőgazdasági és Vidéki Minisztérium Növény- és Állattenyésztési Kulcslaboratóriuma, Állattenyésztési Intézet, Jiangsu Agrártudományi Akadémia, Nanjing 210014, Kína;

# Állattudományi Főiskola, Zhongkai Mezőgazdasági és Mérnöki Egyetem, Guangzhou 510000, Kína.