1. rész: A geraniol javítja a doxorubicin által közvetített vesekárosodást az antioxidáns állapot megváltoztatásával, a gyulladással és az apoptózissal: Az NF-kB és a Nrf2/Ho lehetséges szerepe-1

További információért. kapcsolatba lépnitina.xiang@wecistanche.com

Absztrakt: Doxorubicin által közvetítettvesekárosodáskomoly probléma a rákkezelésben. Ennek megfelelően ez a munka a geraniol azon képességét vizsgálta, hogy modulálja a doxorubicin által kiváltottvesekárosodáspatkánymodell segítségével. A patkányokat véletlenszerűen négy csoportba osztották: kontroll, doxorubicin (20 mg/kg, intraperitoneális, ip), doxorubicin plusz 100 mg/kg geraniol és doxorubicin plusz 200 mg/kg geraniol. Egyetlen doxorubicin injekció vesekárosodást váltott ki, amit a megváltozott szérum kreatinin-, vér karbamid-nitrogén- és albuminértékei igazolnak; a vese felépítésében is szövettani változásokat okozott. Ezenkívül a doxorubicin fokozta a lipidperoxidációt, miközben csökkentette a glutation, a kataláz aktivitást, valamint a glutation-peroxidáz és szuperoxid-diszmutáz expresszióját. Érdekes módon a geraniollal végzett előkezelés megmentette a doxorubicin által kiváltott változásokat a vese antioxidáns paramétereiben, az enzimaktivitásban, valamint a gyulladásos és apoptózist közvetítő gének és fehérjék expressziójában. Ezenkívül a geraniollal végzett profilaktikus kezelés dózisfüggő módon megőrizte a legtöbb veseszövettani jellemzőt. Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a geraniol védelmet nyújthat a doxorubicin által közvetített ellenveseműködési zavar. További kutatásokra van azonban szükség a geraniol doxorubicin által közvetített veseelégtelenség elleni védekező hatásának mechanizmusának tisztázásához.

Kulcsszavak: doxorubicin; gyulladás; oxidatív stressz; apoptózis; vesekárosodás; geraniol

1. Bemutatkozás

Felfedezése óta az antraciklin rákellenes gyógyszert, a doxorubicint (Dox) széles körben alkalmazzák szilárd daganatok és hematológiai rosszindulatú daganatok ellen. Leggyakoribb mellékhatásai közé tartozik a nefrotoxicitás, amelyet csökkent szűréssel, reabszorpcióval és kiválasztással járó veseműködési zavarként írnak le, amely jelentős morbiditási és mortalitási kockázattal jár. A kemoterápiában részesülő rákos betegek körülbelül 60 százalékánál nefrotoxicitás alakul ki, ami korlátozza a Dox terápiás hatékonyságát[5,6]. Míg a Dox által közvetített nefrotoxicitást okozó alapvető folyamatok ismeretlenek, a szakirodalom azt sugallja, hogy a valószínűsíthető hozzájárulók közé tartozikoxidatív stressz, gyulladás, ésapoptózis. A bizonyítékok különösen azt mutatják, hogy csökkenti a Dox-asszociáltoxidatív stressz, gyulladás, és az apoptotikus események segíthetnek csökkenteni a gyógyszer vesetoxicitását.

A nukleáris faktor (eritroid eredetű 2)-szerű 2 (Nrf2) egy redox-érzékeny transzkripciós faktor, antioxidáns, gyulladásgátló és citoprotektív képességekkel, amelyek fenntartják a sejtvédelmi rendszereket. Oxidatív stressz hatására a Nrf2 felszabadítja citoplazmatikus gátló fehérjét, amely bejut a sejtmagba, és aktivál számos, az antioxidáns védekezésben részt vevő gént, mint például a hem oxigenáz-1(Ho-1), glutation-peroxidáz (GPx), kataláz( CAT) és szuperoxid-diszmutáz (SOD) [14-19]. Kimutatták, hogy a Dox-kezelés csökkenti az Nrf2 mRNS és fehérje expresszióját, és így a downstream antioxidáns gének és fehérjék expresszióját is, ami vesetoxicitáshoz vezet.

A nukleáris faktor-kB (NF-kB) egy transzkripciós faktor, amely számos gyulladásos gén expresszióját szabályozza; mint a reaktív oxigénfajták (ROS) által aktivált NF-kB útvonal központi alakja, gyulladásos választ és ennek következtében szövetkárosodást válthat ki [8,22,23]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a Dox gyulladást okoz, és fokozza a gyulladást elősegítő citokinek, például az interleukin-6(IL-6), az interleukin-1 béta (L-1) termelődését, és tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-)[11,13]. Ezenkívül kimutatták, hogy a Dox által közvetített vesekárosodás után megnövekedett ROS-termelés kulcsszerepet játszik a belső apoptotikus útvonal aktiválásában a mitokondriális instabilitáson keresztül. Ennek az útvonalnak a kulcsfontosságú meghatározói a mitokondriális eredetű Bax és Bcl-2 fehérjék; a Bcl-2 és a Bax kiegyensúlyozott aránya megakadályozza az apoptózist, míg az egyensúlyhiány megnövekedett membránpermeabilitáshoz és a citokróm c citoszolba való szivárgásához vezet, ami aktiválja a kaszpázt-9(Casp-9) és a kaszpázt{ {21}} (Casp-3). Az ilyen aktiválás általában DNS fragmentációhoz és sejthalálhoz vezet.

Nagy érdeklődésre tart számot a kemoterápiás gyógyszerek klinikai felhasználásának maximalizálása, miközben minimálisra csökkentik negatív hatásaikat. Ennek megfelelően kutatási erőfeszítéseket tettek különböző szerek Dox-szal együtt történő alkalmazásának vizsgálatára annak káros hatásainak enyhítésére [13,30,31]. A gyógynövénykivonatokról és bioaktív összetevőikről régóta ismertek, hogy képesek csökkenteni a gyógyszerek által közvetített toxicitást. A geraniol egy aciklikus monoterpén alkohol, amely szinte minden illóolajban megtalálható, például gyömbérben, rózsában, narancsban, levendulában és citromban [32,33]. Számos tanulmány számolt be arról, hogy a geraniol különféle jótékony tulajdonságokkal rendelkezik, mint például fekély-, rákellenes [35], antidepresszáns [36], gyulladáscsökkentő [33], és emellett enyhítheti a diabéteszes nephropathiát [37]. .

Legjobb tudomásunk szerint jelenleg nincs konkrét információ a geraniol Dox által közvetített nefrotoxicitás elleni megelőző hatásairól. Ezért megvizsgáltuk a geraniol hatását és valószínűsíthető mechanizmusait a Dox által okozott sérülésekre az NF-kB és Nrf2/Ho-1 jelátviteli útvonalakon keresztül Wistar patkányok veséjében.

2. Anyag és módszer

2.1.Állatok

A hím Wistar patkányokat a szaúd-arábiai Rijádban található King Saud Egyetem (KSU) állatgondozó központjából szerezték be. Az állatokat ellenőrzött körülmények között tartották, például szobahőmérsékleten (25 ± 1 fok), 12 órás fény/sötét ciklus mellett, és korlátlan hozzáférést kaptak a vízhez és a standard étrendhez, a KSU Helyi Intézményi Tanulmányi Etikai Bizottsága által engedélyezett. (REC) a KSU-SE-19-122 engedélyezési szám alatt.

2.2. Kísérleti terv

Ez a vizsgálat összesen 32, 190-210 g súlyú hím Wistar patkányt vizsgált meg, négy csoportba osztva. A patkányok egy hetet kaptak, hogy alkalmazkodjanak a környezethez a vizsgálat előtt. A vivőanyag-csoport, más néven kontrollcsoport, patkányokból állt, akiknek szájon át normál sóoldatot adtak. A II. csoportba a 17. napon Doxot (20 mg/kg ip. egyszeri dózisban) kaptak a patkányok [11]. Az ⅢI és IV csoportba tartozó patkányok 100 és 200 mg/kg profilaktikus geraniolt (orálisan) kaptak 18 napon keresztül, és a 17. napon szintén Dox-kezelést kaptak (20 mg/kg, ip). A 18. napon a patkányokat ketamin/xilazin kombinációval, ellenőrzött környezetben elaltattuk. Vért vettünk, szérumot izoláltunk, és mindkét vesét eltávolítottuk, és azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénben. A fagyasztott szöveteken biokémiai, gén- és fehérje expressziós vizsgálatokat végeztünk. Szövettani vizsgálat céljából a veseszövetmintákat PBS-ben mostuk, majd 4 százalékos formaldehid-oldatban tartósítottuk. A vizsgálat során semmilyen jel nem utalt szorongásra vagy elhullásra egy kísérleti állatnál.

2.3. A vesefunkció markerek meghatározása

A leöléskor gyűjtött vérből a szérum izolálása érdekében a vérmintákat 10 percig centrifugáltuk 2000 x g-vel egy előhűtött centrifugában. A kapott szérumot ezután elemeztük az albumin, a vér karbamid-nitrogén (BUN) és a kreatinin mennyiségi meghatározására. ÉrtékeiveseműködésA markereket a Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM (Siemens, Washington, DC, USA) segítségével számítottuk ki.

2.4. Lipid-peroxidáció értékelése

A lipid-peroxidációt a veseszövetekben értékelték Ohkawa és munkatársai által korábban leírtak szerint, kis módosításokkal.

2.5. A redukált glutation mennyiségi meghatározása

A redukált glutation (GSH) szintjét a vese posztmitokondriális felülúszójában (PMS) a Sedlak és Lindsay által leírt módszer szerint mértük, kisebb módosításokkal.

2.6. A kataláz aktivitásának mennyiségi meghatározása

A CAT aktivitását renális PMS-ben a Claiborne által leírt módszer szerint határoztuk meg, kisebb módosításokkal.

2.7. Génexpressziós elemzés (RT-qPCR)

A TRIzolTMreagent (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) a teljes RNS kinyerésére a veseszövetekből a gyártó útmutatásai szerint történt. Az extrahált RNS minták tisztaságát és mennyiségét NanoDropTM 8000 spektrofotométerrel (Thermo Scientific, USA) határoztuk meg. Az izolált RNS-t ezután cDNS Synthesis SuperMix (Bimake, Houston, TX, USA) segítségével cDNS-vé írtuk át, és a génexpressziót SYBR Green Master Mix-szel (Bimake, Houston, TX, USA) határoztuk meg az Applied Biosystems 7500 Fast Real- készüléken. Idő PCR rendszer. Ezután az AACt megközelítést alkalmaztuk a különböző gének relatív expressziójának meghatározására a csoportok között, a GAPDH-t alkalmazva házőrző génként. Az 1. táblázat felsorolja az ebben a vizsgálatban használt primer szekvenciákat (IDT, Leuven, Belgium).

2.8. Immunblot analízis

A Western blot analízist Alasmari és mtsai. [41]. Röviden, izolált fehérjéket (30-50 ug) elektroforetizáltunk SDS-PAGE gélen, majd PVDF membránokra vittük át. 5%-os zsírmentes száraz tejjel 60 percig tartó blokkolást követően a blotokat egy éjszakán át 4 fokon vizsgáltuk szelektív primer antitestekkel (Ho-1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, hasított kaszpáz{{ ellen). 14}}, Bcl-2, Bax és GAPDH, 1:1000 hígítás). A membránokat ezt követően mostuk, majd 60 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk megfelelő HRP-vel konjugált másodlagos antitestekkel (hígítás: 1:5000). Az ECL reagenskészletet és a gél képalkotó berendezést (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) használtuk a fehérjék membránon való jelenlétének kimutatására.

2.9. Szövettani vizsgálatok

A veseszöveteket utólag fixáltuk 4 százalékos formaldehidben, majd feldolgoztuk paraffinos metszéshez és festéshez. Mikrotommal 3 μm vastagságú paraffin metszeteket vágtunk. A levágott metszeteket ezután kezeltük a viasz eltávolítására, és hematoxilin plusz eozin (H&E) festékkel megfestettük a kórszövettani vizsgálathoz. A veseszövettani képeket egy Olympus BX mikroszkóphoz csatlakoztatott DP72 kamerával készítettük.

2.10. Adatelemzés

Az adatokat a Graph Pad Prism 5 (San Diego, CA, USA) számítógépes programmal elemeztük, és az eredményeket átlagokként és szórásokként (átlag±SD) mutatjuk be. A csoportok közötti különbségeket egytényezős ANOVA-val, majd Tukey-féle összehasonlító teszttel értékeltük ki, ahol a p-érték kisebb, mint 0,05, ami statisztikai szignifikanciát jelez (p).<>