2. rész: Az Euphorbiae Ebracteolatae Radix összes diterpenoidjainak rosszindulatú ascitesz elleni hatása az aquaporinok megváltozásának tulajdonítható, mivel gátolja a PKC aktivitást a vesében

További információért. kapcsolatba lépnitina.xiang@wecistanche.com

Mindannyian tudjuk, hogy a vese a legfontosabb szerv az emberi szervezetben. Ha a vese nem jó, táplálnia kell a vesét. Számos módja van a vese táplálásának. Vannak, akik enni fognakCistanchea vesék táplálására. A Cistanche alkaloidokban gazdag,echinacoside, Verbascum glikozidokkristályos semleges anyagok, aminosavak, nyomelemek, vitaminok és egyéb összetevők. A Cistanche a keringési rendszert is szabályozhatja, a következő hatásokkal: védi az ischaemiás szívizomzatot; csökkenti a vér lipidszintjét, ellenáll az érelmeszesedésnek és a trombózisnak; csökkenti a perifériás vaszkuláris ellenállást, tágítja a perifériás ereket és csökkenti a vérnyomást; védi a májat és ellenáll a zsírmájnak.

3. Vita

Az EER-t hagyományosan TCM-ben használták hasi distenszió és ödéma kezelésére [1]. Ebben a vizsgálatban az EER ascites elleni hatását H22 tumorsejtet hordozó ascitis egereken vizsgáltuk. A rosszindulatú ascitis egereket széles körben alkalmazzák a daganatok és az ascites kezelésének tanulmányozására [21,22]. Eredményeink azt mutatták, hogy mind az EER, mind a TDEE jelentősen csökkentheti az ascites mennyiségét, míg az NTDEE nem volt hatással. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a TDEE az EER ascites elleni aktív frakciója. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az EER-ből származó diterpenoidok gátló hatással rendelkeznektumorsejtekin vitro [5,23]. Ez a tanulmány azonban azt találta, hogy nincs hatással a tumorsejtek életképességére, sejtciklusára vagy a tumorsejtek apoptózisára. Ennek az eltérésnek a lehetséges okai lehetnek a dózisok különbségei, valamint az in vivo és in vitro aktivitások közötti rossz korreláció. A TCM azon a véleményen van, hogy az EER hatékony az ödéma kezelésében, főként a vizelet és a széklet kiválasztásának gyors szabályozása révén [6]. Ezért elemeztük a TDEE hatását a vizelet tömegére és a széklet víztartalmára aszcitikus egerekben. Meg kell jegyezni, hogy a vizelet tömegét és az asciticus folyadék tömegét egyaránt befolyásolta a TDEE 3 és 0,6 g nyers gyógynövény/kg dózisban, míg a széklet víztartalma csak 3 g nyers gyógynövény/kg-nál nőtt, így a TDEE főként csökkenti az ascites térfogatát, mivel csökkenti a víz visszaszívását a vesékben. A vese vízvisszaszívása központi szerepet játszik a test vízháztartásának fenntartásában [16]. Az AQP-k biztosítják a fő csatornákat a vesék számára a víz visszaszívásához és a vizelet koncentrálásához [24]. Következésképpen az AQP expressziójának vizsgálata mechanizmust biztosíthat az ascites csökkentésére.

Különféle AQP-k fejeződnek ki a különböző területekenvese.AOP1, AOP2, AOP3, and AQP4 are localized in renal epithelial cells and are closely related to water reabsorption in the kidney [25]. AQP1 is highly expressed in both apical and basolateral membranes of the proximal tubules and control>A vízfelvétel 70 százaléka a glomeruláris szűrletben [16]. Az AQP2, AOP3 és AOP4 kizárólag a gyűjtőcsatornákban expresszálódik, amelyek létfontosságú szegmensek a vízháztartás és a vizeletkoncentráció szabályozásában [16]. A jelen vizsgálatban a TDEE csökkentette az AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4 fehérjeexpresszióját egérvesékben. Ezeket az eredményeket in vitro sejtkísérletek eredményei is megerősítették. A TDEE fő diterpenoidjainak AQP-gátló aktivitását a proximális tubulus és a gyűjtőcsatorna sejtvonalaiban értékeltük. Eredményeink azt mutatták, hogy a TDEE-ben lévő diterpenoidok csökkentik az AQPs fehérje és mRNS expressziós szintjét a HK-2 és mIMCD3 sejtekben.

Kattintson a cistanche tubulosa vásárlás szállítójával való kapcsolatfelvételhez

Az egyes diterpenoidok AQPs fehérje és mRNS relatív expressziós szintjét összehasonlítottuk a kontroll csoporttal.VeseA tubulusok a vízvisszaszívás fontos összetevői. A négy diterpenoid közül az ent-abietán-diterpenoid, a jolkinolid B (a TDEE 1269 százaléka) volt a legerősebb hatással az AQP1 szabályozására a HK-2 sejtekben. A 2. vegyület szerkezetével összehasonlítva a jolkinolid B (3. vegyület) két epoxigyűrűt tartalmaz a C-11 és a 14. pozíciókban. Amikor a C-11 és a 14. epoxigyűrű átalakult. A 2. vegyület hidroxil- és kettőskötéséhez az AQP1 gátló aktivitása eltűnt. A vizelet koncentrációja elsősorban a vesegyűjtő tubulusokban fordul elő. Az mIMCD3 sejtekből származó eredmények azt mutatták, hogy a 4-es rozán-diterpenoid vegyület és az 5-ös norditerpenoid laktonvegyület (amelyek a TDEE 9,16 százalékát, illetve 39,26 százalékát teszik ki) rendelkeznek a legerősebb gátló hatással az AQP2, AQP3 és AQP4 expressziójára. Az ent-abietán-diterpenoidok gátló hatása gyenge volt e két diterpenoidtípushoz képest. A különböző típusú diterpenoidok gátló hatása a különböző AOP-kra a vesében nem volt azonos, ami a diterpenoidok kémiai szerkezetének és az egyes vegyületekre adott AQP-k válaszidejének eltéréseiből adódhat. Összességében ezek a diterpenoidok az AQP-k szinergikus gátló hatását fejthetik ki. Mivel ezeknek a diterpenoidoknak az aktivitását in vitro becsülték meg, ezeknek a vegyületeknek az aktivitása az in vivo metabolizmus után nem tisztázott, ezért további vizsgálatokat igényel.

Számos tanulmány utal arra, hogy a PKC és a PKA szerepet játszik az AQP-k szabályozásában [17-20]. A PKC a szerin/treonin kinázok családja, amelyek különböző sejtes jelátvitelekben vesznek részt [26]. A PKC család számos izoformát tartalmaz [26]. Az aktiválás után a PKC-k a citoszolból a plazmamembránba transzlokálódnak, diacilglicerinhez (DAG) kötődnek, és ezt követően egy sor fiziológiai változást indukálnak [27]. A PKC transzlokációja a citoszolból a plazmamembránba a PKC aktiváció indikátora [28]. A DAG-t a membrán foszfatidil-inozitol-4, 5-biszfoszfát (PIP2) [27] PLC katalizált hidrolízise hozza létre. Állatkísérletekben a PKCo és PKC expressziós szintjét mértük a membránfrakcióban. Ugyanakkor a PKC upstream fehérjéiben is kimutattuk a változásokat. Az eredmények arra utalnak, hogy a TDEE csökkentette a PKC expresszióját a sejtmembránon és gátolta a PKC aktivitását. A TDEE-nek azonban nem volt hatása a PLC foszforilációs szintjére. A TDEE közvetlenül kötődhet a PKC-hez, és gátolja a PKC aktiválódását. A PKA enzimatikus aktivitását elsősorban a szabályozó alegységek szabályozzák, amelyek holoenzim komplexet alkotnak a katalitikus alegységekkel [29] A katalitikus alegységek felszabadulása a PKA aktiválásának egyik jellemzője [29]. Azt találtuk, hogy a TDEE kezelésnek nincs hatása a PKA aktiválására. Annak felderítésére, hogy az AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4 gátlása a vesékben a PKC jelek aktiválásának gátlásán keresztül történik-e, PMA-t használtunk PKC agonistaként, hogy megzavarjuk az AOP1, AOP2, AQP3 és AQP4 expresszióját HK{ban. {19}} és mIMCD3 sejtek. Eredményeink azt mutatták, hogy az eufebrakteolatin A (a TDEE diterpenoidja) csökkentette az AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4 expressziós szintjétvesesejtek. Az AOP1, AOP2, AOP3 és AQP4 expresszió eufebrakteolatin A által kiváltott gátlását a PMA blokkolta. Ebből arra következtetünk, hogy a TDEE szabályozta az AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4 expresszióját a PKC aktiválásának gátlásával. A PKC izoformák számosak; A TDEE az AQP expresszióját is szabályozhatja más izoformák gátlásával, amelyek további kutatásra várnak. A mai napig a PKC-től lefelé található molekulák, amelyek az AQP-k expresszióját szabályozzák, továbbra is rosszul ismertek. A következő lépésben a PKC downstream szabályozási mechanizmusaira koncentrálunk.

Összefoglalva, a TDEE az EER aktív frakciója az ascites ellen. A TDEE olyan diterpenoidokból áll, mint az ent-abietan, Rosane és norditerpén laktonok. A TDEE és diterpenoidjai gátolhatják a víz reabszorpcióját és koncentrációját a vesékben az AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4 expressziós szintjének csökkentésével, ezáltal oldva az asciteszt. Az AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4 expressziójának TDEE általi gátlása a vesékben a PKC aktiváció gátlásával függ össze. Ez a tanulmány alapját képezheti az EER klinikai alkalmazásának és a vizelethajtó és ascites elleni hatást kiváltó gyógyszerjelöltek azonosításának.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Vegyszerek és reagensek

Egy albumin vizsgálati készletet a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-tól (Nanjing, Kína) vásároltunk. A HPLC-minőségű acetonitrilt a Media Co.-tól (Anqing, Kína) vásároltuk. A Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajt (DMEM) a HyClone-tól (Logan, UT, USA) szereztük be. A nem esszenciális aminosavakat (MEM NEAA) és magzati szarvasmarha szérumot (FBS) tartalmazó minimális esszenciális tápközeget a Procell Life Science & Technology Co., Ltd.-től (Wuhan, Kína) szereztük be. A nyúl anti-AQP1 és AQP3 antitesteket a következő cégtől szereztük be. EnoGene Co., Ltd. (Nanjing, Kína). A nyúl-anti-AQP2, AQP4 és egér-anti- -aktin antitesteket a Zen BioScience Co., Ltd.-től (Chengdu, Kína) vásároltuk. A nyúl-anti-PKC, PKC, PLC és foszfo-PLC(Tyr783) antitesteket az Affinity Biosciences Co., Ltd.-től (Changzhou, Kína) vásároltuk. A radioimmunprecipitációs vizsgálati puffert (RIPA puffer), a sejtciklust és a sejt apoptózis kimutatására szolgáló kiteket a Yifeixue Biotechnology (Nanjing, Kína) biztosította. A BCA készletet a Beyotime Biotechnology-tól (Sanghaj, Kína) vásároltuk. A TRIzol reagens puffert a Thermo Fisher Scientific cégtől (Carlsbad, CA, USA) vásároltuk. A PVDF membránokat a Millipore-tól (Bedford, MA, USA) vásároltuk. A cDNS szintézis készletet a YEASEN Biotech Co., Ltd.-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk.

4.2.Növényi anyag

Az EER-t, az Euphorbia ebracteolate Hayata gyökerét a Baohetang Pharmaceutical Co., Ltd.-től (Bozhou, Kína) vásárolták 2017. szeptember 15-én, és a hitelesítést Harbin Hu professzor, a Jiangsu Institute for Food and Drug Control munkatársa hitelesítette. Az utalványmintát (WH20170915) a Nanjingi Kínai Orvostudományi Egyetem Gyógyszerészeti Karának Hagyományos Kínai Orvoslás Herbáriumában helyezték el.

4.3. A TDEE extrakciója és izolálása, valamint a diterpenoidok tisztítása

Az EER-t mechanikus darálóval porítottuk. A port (100 g) egymás után Soxhlet extrakcióval 6 órán át diklór-metánnal extraháltuk. Ezután az extraktumot csökkentett nyomáson bepároljuk, így diklór-metános extraktumot kapunk. A diklór-metános extraktumot oszlopkromatográfiának (CC) vetettük alá ODS-en, eluálószerként 40% és 90% metanolt egymás után. A 90%-os metanolt tartalmazó eluenst összegyűjtjük, bepároljuk és szárítjuk, így 2,4 g TDEE-t kapunk. Az extrahált maradékokat összeöntöttük, és háromszor extraháltuk 95%-os etanollal. Az extraktumot egyesítjük és szárazra pároljuk, így NTDEE-t (15,6 g) kapunk. Az EER-porból (100 g) 95%-os etanollal extraháltuk a 19,8 g TEER-t. Ezeket a kivonatokat állatkísérletekben használták fel.

A TDEE fő vegyületeit a következő eljárással izoláltuk. Az EER gyökerét (20 kg) porrá törjük, és 72 órán keresztül szobahőmérsékleten háromszori macerálással diklór-metánnal extraháljuk. A diklór-metános kivonatot kapjuk, és rotációs bepárlóban bepároljuk. A maradékot szilikagélen CC-nek vetettük alá növekvő polaritású CH, Cl és MeOH gradiens rendszerrel (100:0-0:100), így 8 frakciót kaptunk (Fr. 1-Fr.8). . Az Fr.4-et szilikagél oszlopnak vetjük alá, petroléter-EtOAc (50:1-1:1 arányú) eluálással, majd fordított fázisú ODS CCeluálás MeOH-H, O 60%-ról 80%-ra, így az 5. vegyületet kapjuk. és 6. Az Fr.5-öt szilikagél oszlopon kromatografáltuk petroléter-EtOAc (35:1-től 0:1-ig) eluálással, így 7 szubfrakciót kaptunk (Fr.5.{28}}Fr.5.7). Az Fr.5.3-at ODS CC-vel választottuk el MeOH-H2O-val eluálva (75%-ról 100%-ra), majd

félpreparatív HPLC-vel (MeOH-H2O, 75 százalékról 1{29}}0 százalékra), így kaptuk a 4. vegyületet. Az Fr.5.4-et szilikagél oszlopon kromatografáltuk, petroléter-EtOAc (30:1-től 30:1-ig) eluálással. 5:1), majd Sephadex LH-20(MeOH:CH2Cl, 1:1) és félpreparatív HPLC (MeOH-H, O, 60-95%) a 3.Fr. Az 5.6 vegyületet ODS CC-vel tisztítottuk, eluálva MeOH-H2O gradienssel 40:60-tól 100:0-ig, majd Sephadex LH-20 CC-vel (CHCl-MeOH, 1:1), így az 1. és 2. vegyületet kaptuk.

4.4. In vivo kísérletek

4.4.1.Állatok és kísérleti tervezés

Az ICR hím egereket (súly: 18-22 g) a Qing Long Shan Animal Breeding Farm-tól (Nanjing, Kína) szereztük be. Az egereket standard laboratóriumi ketrecekben tartottuk mérsékelt páratartalom mellett (50% ±5%), állandó hőmérsékleten (22±1 fok) egy 12 órás világos-sötét ciklusú szobában. A kísérleti időszak alatt minden állat szabadon hozzáférhetett élelemhez és vízhez. A kísérleti protokollt a Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem Állat-etikai Bizottsága (Nanjing, Kína) hagyta jóvá.

Összesen 90 hím egeret véletlenszerűen 9 csoportra osztottak (n= 10). A kontrollcsoportot intraperitoneálisan fecskendezték be 0,2 ml sóoldattal. A többi csoport egereit intraperitoneálisan beoltottuk 1 × 1{{10}} fokos H22 sejtekkel 0,2 ml térfogatban. Az összes gyógyszert vízben szuszpendáltuk 0,5% (w/o)nátrium-karboxil-metil-cellulózzal (0,5% Na-CMC). 24 óra elteltével az egereket minden nap szondán keresztül kezeltük a következő séma szerint 8 napon keresztül: a normál és a modellcsoportok 0,5 százalékos Na-CMC-t kaptak. Pozitív kontrollként a furoszemidet (6 mg/kg) választották, mert a diurézis hatása miatt széles körben használják ödémás betegségek, például ascites kezelésére. A TEER, TDEE és NTDEE csoportok megfelelő EER kivonatokat kaptak (3,0 és 0,6 g nyers gyógynövény/kg).

4.4.2. Aszcitikus folyadéktömeg, vizelettömeg és székletvíztartalom-vizsgálatok

A modellből és a kezelt csoportból származó egereket leöltük, és a hasüregből a hasüregből gyűjtöttük az asciticus folyadékot. A folyadékot ezután elektronikus mérlegen lemértük.

Az egereket külön ketrecekben helyeztük el. A székletet kimért és lezárt fiolákba gyűjtöttük. 5 óra elteltével a nedves ürüléket tartalmazó fiolákat lemértük. Ezután a fiolákat tömegállandóságig szárítjuk 105 fokon. A széklet víztartalma ( százalék )=((nedves ürüléket tartalmazó injekciós üvegek tömege – szárított ürüléket tartalmazó fiolák tömege)/(nedves ürüléket tartalmazó injekciós üvegek tömege – fiolák tömege)) × 100.

A vizeletkiválasztás tömegét egy korábbi módszer módosításával mérték [30]. Az egereket egyedi főzőpohárban helyeztük el. A főzőpoharakat a szájakon fémhálóval borították, majd a szuperabszorbens polimert (SAP) tartalmazó műanyag edényekre fordították. Ebben a tesztben a székletet megtisztították. 5 óra elteltével lemértük az SAP-t és vizeletet tartalmazó műanyag edényeket. A vizelet tömegének meghatározásához a következő egyenletet használtuk: a vizelet tömege (g)=az SAP-t tartalmazó műanyag edények tömege és az SAP-t tartalmazó műanyag edények vizelettömege.

4.4.3. Szérum albumin elemzés

Minden csoportból orbitális punkcióval vettük a vért, és 5000 × g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 fokon. A szérum albumint albumin vizsgálati készlettel mértük.

4.4.4. Tumorsejtek életképességi, ciklus- és apoptózisvizsgálatai

Az egerek leölése után a daganatsejteket tartalmazó ascitic folyadékot a peritoneális üregből összegyűjtöttük, és azonnal 2-szeresére hígítottuk sóoldattal. A tumorsejtek életképességét 0,4 százalékos tripánkék festéssel értékeltük, és egy automata sejtszámlálóban (ALIT Life Science Co., Ltd., Shanghai, Kína) megszámoltuk.

A hígított sejtszuszpenziót (0,5 ml) centrifugáltuk 1000 g-vel 5 percig 4 °C-on. A sejteket összegyűjtöttük, és hideg 70%-os etanolban 4 °C-on egy éjszakán át fixáltuk. Rögzítés után a tumorsejteket kétszer mostuk PBS-ben, centrifugáltuk, majd RNáz A oldattal (100 µl) 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. Végül a sejteket 400 µl propidium-jodiddal inkubáltuk

(PI) 30 percig 4 fokon, sötétben, majd átszűrjük egy 300-hálós nylon membránon. A különböző fázisokban lévő sejtek százalékos arányát Accuri C6 Flow Cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) segítségével elemeztük.

A tumorsejtek apoptózisát Annexin V-FITC/PI Apoptosis kit segítségével mutattuk ki. A hígított sejtszuszpenziót (0,5 ml) kétszer mostuk PBS-ben, és 1000 g-vel centrifugáltuk 5 percig 4 °C-on. A sejteket összegyűjtöttük, és 100 µl kötőpufferben újraszuszpendáltuk, majd inkubáltuk 5 µl Annexin V-FITC-vel és 10 µl PI-festő oldattal 15 percig szobahőmérsékleten, sötétben. Az inkubálást követően 400 μl kötőpuffert adtunk minden csőhöz. A sejt apoptózisát Accuri C6 Flow Cytometer segítségével detektáltuk.

4.4.5. Az AQP, PKC, PKA és PLC Western blot analízise a vesékben

Az egerek leölése után a veséket izoláltuk és gyorsfagyasztottuk, majd -80 fokon tároltuk a fehérjeexpresszió elemzéséhez. A szövetmintákat RIPA lízispufferben homogenizáltuk. Egy éjszakán át -20 fokon történő tárolás után a szöveti lizátumokat 10 perces, 12,000×g-vel végzett centrifugálás után összegyűjtöttük. Centrifugálás után a felülúszót összegyűjtöttük az összes és a foszforilált fehérjék meghatározásához. A membránfehérjéket Membrane Protein Extraction Kit segítségével extraháltuk a vesékből a gyártó protokollja szerint. A fehérjekoncentrációkat BCA kit segítségével határoztuk meg. A fehérjeoldatokat forrásban lévő vízben 5 percig denaturáltuk, és ötszörös töltőpufferrel kevertük össze. Egyenlő mennyiségű fehérjét választottunk el 10 százalékos SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra vittük át, majd 2 órán keresztül szarvasmarhaszérumból (BSA) származó 5 százalékos albuminnal blokkoltuk. A blokkolás után a membránokat AOP1 (1:2000), AOP2 (1:1000), AQP3 (1:2000), AQP4 (1:1000), PKC (1:2000), PKC (1:) elleni primer antitestekkel inkubáltuk. 2000), PKA(1:2000), PLC(1:2000), p-PLC(1:800) és -aktin (1:5000) 4 fokon egy éjszakán át. Ezután a membránokat 0,1% Tween-20-t (TBST) tartalmazó Tris-pufferolt sóoldattal mostuk, és az elsődleges antitesteket torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel (1:5000) mutattuk ki. A fehérjéket kemilumineszcens reagenssel és Tanon 5200 kemilumineszcens képalkotó rendszerrel (Tanon, Shanghai, Kína) tettük láthatóvá. A blot sávokat denzitometriával, ImageJ használatával határoztuk meg.

4.5. Hat fő diterpenoid meghatározása TDEE-ben

Euphoria G, ent{{0}}l -hidroxiabicta-8(14),13(15)-dien-16, 12-olid, jolkinolid B, EU-febrakteolatin Az A-t, a Fischer A-t és a jolkinolid E-t acetonitrilben oldjuk a megfelelő koncentrációban. A TDEE-t acetonitrilben is feloldottuk, hogy HPLC-vel meghatározzuk az összetevő tartalmát. A HPLC analízist Waters 2695 elválasztó rendszeren végeztük, amely fotodiódasoros detektorral (Waters, Milford, CT, USA) és Agilent Eclipse XDB-C18 oszloppal (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) volt felszerelve. A mozgó fázis 0,1% hangyasav-vízből (A) és acetonitrilből (B) állt. Az oldószert 1 ml/perc áramlási sebességgel fejlesztettük ki a következő gradiens programmal: 0-25 min, 65% B;25-40 min, 65% -85% B;{{25} }} min, 85 százalék -100 százalék B. Az injekció térfogata 10 μL volt. Az oszlop hőmérséklete 30 °C volt, és 265 mm-es hullámhosszt alkalmaztunk.

4.6. In vitro kísérletek

4.6.1. Sejtkultúra

A HK-2 és mIMCD3 sejteket a Procell Life Science & Technology Co., Ltd.-től (Wuhan, Kína) vásároltuk. Minden sejtet inkubátorban tenyésztettünk 5 százalékos CO2-atmoszférában 37 fokon 90 százalékos összefolyásig, majd különböző vegyületekkel kezeltük és kezeltük a kísérleteket. A HK-2 sejteket 10% FBS-sel és 1% antibiotikummal kiegészített MEM NEAA-ban, míg az mIMCD3 sejteket 10% FBS-t és 1% antibiotikumot tartalmazó DMEM tápközegben növesztettük.

4.6.2. Az AQP-k Western-blot és kvantitatív reverz transzkripciós-PCR (qRT-PCR) elemzése

HK{{0}} és mIMCD3 sejteket oltottunk (5×105/lyuk) 6-lyukú lemezekre 24 és 12 órával a kezelés előtt. A sejteket különböző vegyületekkel kezeltük 8 órán át 5 százalékos CO-ban, inkubátorban 37 fokon. 0,1%-os dimetil-szulfoxiddal kezelt sejteket használtunk vivőanyag-kontrollként. Az utókezelést követően a sejteket kétszer mostuk hideg PBS-ben, RIPA lízispufferben kaparással gyűjtöttük össze, majd lizáltuk. Egy éjszakán át -20 fokon történő tárolás után a lizátumokat 12,000×g-vel 10 percig végzett centrifugálással tisztítottuk, majd a felülúszókat összegyűjtöttük és Western blot analízisben használtuk fel. A Western-blotot a cikkben az állatkísérletekben korábban leírtak szerint végeztük.

A teljes RNS izolálására. Különböző vegyületekkel végzett 8 órás inkubálás után a sejteket PBS-sel mostuk és TRIzol reagens pufferben oldottuk, majd az RNS-t izoláltuk a gyártó útmutatásai szerint. A cDNS-t azonos mennyiségű RNS-ből szintetizáltuk cDNS-szintézis kit segítségével. A gRT-PCR reakcióelegyét cDNS, az 1. táblázatban említett forward és reverse primerek, DEPC víz és SYBR zöld mesterkeverék hozzáadásával állítottuk elő. A génexpressziós elemzéshez Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR készüléket használtunk. A PCR-körülmények a következők voltak: kezdeti denaturálás 95 fokon 5 percig, majd 40 ciklus 95 fokos 10 másodpercig és 60 fokos ciklus 34 másodpercig. Végül a PCR-adatokat kettős delta CT módszerekkel elemeztük Microsoft Excel táblázatban.

4.6.3. A PKC agonista PMA hatása az AQPs fehérje expressziójára a vesesejtekben

A HK-2 és mIMCD3 sejteket 6-lyuklemezekre szélesztettük 5×10 fokos sejt/lyuk sűrűséggel. A sejttapadás után a sejteket előinkubáltuk 200 nM PKC agonistával (PMA) vagy anélkül 1,5 órán át, majd 8 órán át euphebracteolatin A-val (2,5 μM) kezeltük. A teljes és membránfehérjék extrakcióját és a Western-blot analízist a korábban részletesen leírtak szerint végeztük.

4.7. Statisztikai elemzés

A statisztikai elemzéshez az SPSS 19.{1}} elemző szoftvert használtuk. Az adatokat egyutas ANOVA-val vagy rang-összeg teszttel elemeztük. A numerikus adatokat átlag ± standard deviáció (SD) formájában fejeztük ki. Különbségek a p<0.05 were="" considered="" statistically="">