2. rész: Az Ephedra Fragilis bioaktív vegyületei: Kivonás optimalizálása, kémiai jellemzés, antioxidáns és glikációt gátló tevékenységek
Mar 26, 2022
További információért. kapcsolatba lépnitina.xiang@wecistanche.com
2.7.Antiglikációs tevékenység
2.7.1. UV-látható elemzés
Az UV-vis spektrum egy gyors, konzisztens és egyszerű technika, amelyet gyakran használnak a fehérje konformációs változások és a komplexképződés kimutatására. A natív és glikált BSA abszorpciós spektruma 15 napig inkubált CEE/frakciók jelenlétében vagy hiányában, valamintkvercetin(pozitív kontroll) a 3A. ábrán láthatók.
Egyértelműen kimutatták, hogy a natív BSA jellegzetes csúcsot mutat 入2s0 nm-nél, ami leginkább az aromás aminosavaknak, köztük a tirozinnak, a triptofánnak és a fenilalaninnak köszönhető [47].
Glükózzal történő módosítás után a λ28{4}} nm-en mért abszorbancia 60,57 százalékkal hiperkrómabb volt, mint a natív BSA. A megnövekedett abszorpciós intenzitás 入2s0 nm-nél a fehérje hélix glikáció által kiváltott kibontakozásának tudható be, ami befolyásolhatja normál élettani működését.
Treatment with CEE/fractions reduced significantly the absorbance at入2so nm compared to glycated BSA, and this reduction varied markedly between fractions according to the solvent polarity. Overall, descending antiglycation activity was portrayed as EAF>WBF>DMF>CCE>WF>HE, amelyek 1,82, 1,71, 1,57, 1,35, 1,28 és 1{11}}szer alacsonyabbak voltak, mint a glikált BSA. Ennek ellenére ez az aktivitás jelentősen alacsonyabb volt, mint akvercetinpozitív kontrollként használták (2.{1}}szer alacsonyabb, mint a glikált BSA). Tehát az abszorpciós vizsgálatokból egyértelműen megállapítható, hogy az E. fragilis-ből származó EAF védő hatást fejt ki a fehérje glikáció által kiváltott BSA kifejlődése ellen.
2.7.2. A fehérje glikáció gátlása a BSA-Glu modellben
Az AGE-k a vegyületek heterogén csoportját alkotják, amelyek λ440 nm-en fluoreszcens jellemzőkkel rendelkeznek, amikor 370 nm-en gerjesztik. A CEE és különböző E. fragilis-ből származó frakcióinak az AGE-k képződését gátló képességét a BSA-glükóz vizsgálattal értékeltük, és az eredményeket a 3B. ábra mutatja be.
Amint a 3B. ábra mutatja, az AGE-gátlás mértéke az összes vizsgált mintában a koncentrációk növekedésével párhuzamosan emelkedő tendenciát mutatott. 1 mg/ml koncentrációnál a CCE, a HE, a DME EAE, a WBF, a WF és a kvercetin 53,26, 39,83, 54,82, 76,68, 69%-kal gátolta az AGE-k képződését.{19}}9, 48,83 és 97,84 százalékkal, inkubálás után 15 napig. Az EAF(ICs =0.375±0.034 mg/ml) volt a leghatékonyabb AGE-gátló az összes frakció közül, ezt követte a WBF, DMF, CCE és WF IC5-tel. 0 értékei: 0,595 ± {{30}}.047, 0,857 ± 0,018, 0,951 ± 0,099 és 1,044 ± 0,099 0,032 mg/ml. A HF mutatta a leggyengébb aktivitást 1,212±0,063 mg/ml ICso értékkel.
A magasságantiglikációAz EAF potenciálja a nagy mennyiségű fenol- és flavonoidtartalomnak köszönhető, amelyeket az AGE-képződés nagyon jó gátlójaként írtak le [48]. A Liquidambar formosana Hance levélkivonat EAF-jének magasabb antiglikációjáról számoltak be Zhang és munkatársai is. [31]a diklór-metán, n-butanol és víz frakcióihoz képest.
Amint az 5. táblázatban látható, az AGE-gátlás erősen pozitívan korrelált mindkét TF(r=0.950;p)<0.01)and tp(r=""><0.01)contents, which="" were="" in="" line="" with="" previously="" reported="" studies="" [2,29].="" the="" ages="" inhibition="" was="" also="" correlated="" in="" a="" positive="" way="" to="" dpph",abts,h2o2,reducing="" power,="" tac,andβ-carotene="" assays="" withr="">
r=0.914,r=0.983, r=0.975,r=0.923 és r=0.963 (p<0.01),respectively. these="" reflected="" that="" ages="" inhibition="" is="" linked="" to="" the="" efficiency="" of="" primary="" antioxidants="" [6].="" kaewseejan="" and="" siriamornpun="" [29]="" also="" reported="" that="" phenolic="" compounds="" prevented="" the="" formation="" of="" ages="" through="" its="">szabad gyökök megkötéseésantioxidánskapacitások.
2.7.3. Hatások a glikáció által kiváltott fehérjeoxidációra
A fehérjék glikációja (Maillard-reakció) a redukáló cukornak a fehérjék aminocsoportjához (főleg lizin- és arginincsoportokhoz) való kovalens kapcsolódásával indul be, ami instabil és reverzibilis termék, azaz Schiff-bázis képződéséhez vezet, amely tovább Amadori átrendeződésen megy keresztül. stabilabb ketamin nevű Amadori termékek előállítására. Ezt követően az Amadori termékek enediol reakción mennek keresztül karbonilezett fehérjék előállítására [48]. Ennek a ketaminnak a lebomlása generálhatszabad radikálisokilyenek például a szuperoxid gyökök, amelyek a Fenton-reakció révén tovább alakulnak HO·-vé, oxidatív és sejtkárosodást okozva [49].
Protein oxidation is accompanied by carbonyl protein formation and loss of protein thiols, which are often employed as protein oxidation indicators[50]. As given in Figure 3C, the level of carbonyl content in native BSA was 1.16±0.04 nmol/mg protein, which was increased to more than 3.62-fold (4.21 ± 0.10 nmol/mg protein) upon glycation. The treatment with CEE and its various fractions reduced the level of carbonyl content with the increase of samples concentrations ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Furthermore, the inhibition effect of quercetin on the formation of carbonyl proteins was stronger than that of all fractions at every concentration point. When the concentration was 1 mg/mL, CEE, HF, DMF, EAF, WBF, WF, and quercetin decreased the level of carbonyl content by 42.29, 17.37,58.68,73.44,69.17,28.84,and 98.68%, respectively, compared to native BSA. Overall descending, the inhibition of carbonyl content formation was portrayed as Q>EAF>WBF >DMF > CCE> WF >HF.
A CEE/frakciók glikáció által kiváltott fehérje-tiol-oxidációra gyakorolt hatásait a 3D. ábra mutatja be. A natív BSA-ban a tiol fehérje szintje 1.06± 0.086 nmol/mg fehérje volt, ami több mint háromszorosára csökkent (0 .34± 0,021 nmol/mg fehérje) glikált fehérjében. CEE/frakciók jelenlétében a tiolcsoport szintje szignifikánsan megemelkedett dózisfüggő módon, 0,1 és 1 mg/ml között. Ezenkívül a fehérje-tiol szintje a következő sorrendben nőtt: HF<><><><>
Hasonló eredményeket figyeltek meg a Teucrium polium növényben, mivel az EAF hatékonyabb volt a többi frakciónál (dietil-éter és víz frakciók) a glikáció által közvetített fehérjeoxidáció ellen[51]. Golshahi és Bahramikia [52] is hasonló eredményekről számolt be tanulmányukban, amikor több, növekvő polaritású oldószert (dietil-étert és vizet) használtak egy Trachyspermum copticum gyógynövény hasításánál. A szerzők szerint az EAF rendelkezik a legerősebb védőhatással a glikáció által közvetített fehérjeoxidáció ellen, amelyet távolról a dietil-éter és a víz követ. Ez olyan vegyületek jelenlétét mutatja az EAF-ben, amelyek megelőző hatást fejthetnek ki a hiperglikémia által kiváltott fehérje oxidatív károsodásaival szemben, amelyekről feltételezhető, hogy a glioxidációs folyamatok során a fehérje karbonilképződésének csökkentésével és a fehérje-tiolok oxidációtól való védelmével, amint azt az adatok sugallják.
2.8.Azonosított fenolvegyületek az EAF-ben
Az egyéb frakciók közül a legnagyobb biológiai aktivitást mutató EAF-et választottuk ki főbb bioaktív vegyületeinek azonosítására RP-HPLC-vel. Összesen hat vegyületet azonosítottunk a retenciós idejük összehasonlításával a referencia standardokéval. Az azonosított fenolos vegyületeket a 4. ábra mutatja be. A gallusz-, vanillin-, kávé- és ferulasavakat fenolsavként azonosították, míg csak két vegyületet, nevezetesen a rutint és a kvercetint azonosították flavonoidként. Soumaya és munkatársai tanulmánya szerint. [53], a ferulasav, a luteolin-7-O-glükozid, a miricetin és a kaempferol 3-O-rutinozid a tunéziai E.fragilis légi részei EAF-jében, míg a rutin jelenléte kimutatható. , kvercetin, galluszsav és koffeinsav csak a mi vizsgálatunkban volt kimutatható először. Az azonos növényfajokból nyert EAF kémiai összetételének eltérése a növény különböző részein, a növény fejlődési szakaszában, a növekedési feltételekben (pl. talaj, fény, hőmérséklet, víz, páratartalom és műtrágyák) eltérő lehet, a betakarítási idő, a szárítási rendszer és az extrakciós eljárás [54]. A fitokémiai ujjlenyomat-profilból kapott eredmények azt mutatták, hogy az E. fragilis számos fenolos vegyülettel rendelkezik, amelyek a szabad gyökfogó és az antioxidáns aktivitás fő tényezőinek tekinthetők [55]. Ezenkívül ezek a vegyületek erős antiglikációs képességükről ismertek [48]. Számos tanulmány feltárta a közvetlen kapcsolatot a fenolos vegyületek antioxidáns hatása és antiglikációs képessége között.
2.9. Azonosított vegyületek molekuláris dokkolási vizsgálata
Molekuláris dokkolási vizsgálatot végeztünk, hogy egyértelműen láthatóvá tegyük azt a részletes mechanizmust, amellyel az E. fragilis EAF-jában azonosított vegyületek BSA-hoz és RAGE-hoz kötődnek. A dokkolási eredményeket a 6. táblázat mutatja be, míg a legaktívabb vegyület és a célpontok közötti kölcsönhatásokat az 5. ábra mutatja. Az eredmények azt mutatták, hogy a kvercetin szorosan illeszkedik a kötőhelyhez, amely a BSA IB aldoménjének hidrofób üregében található, és a legalacsonyabb kötési energiával rendelkezik: {2}},7 kcal/mol (5A. ábra). Ezzel szemben a ferulsav, a vanillinsav, a kávésav, a galluszsav és a rutin kevesebb kötési energiát ért el (-6,35,{{7} },05, -5,84,-5,25 és -4,41 kcal/mol). Általában a kötési energia nagyfokú negativitása hatékonyabb, és a vegyületet a glikációs folyamatok szabályozására használják. Az 5B ábrán jól látható, hogy a kvercetin nyolc hidrogénkötést képez a SER109, ASP111, LEU112, LEU115, ARG144, ARG185 és ARG458 BSA-val, és négy hidrofób kölcsönhatást közvetítenek az alifás aminosavak (PRO110, L44, PRO144, PRO1113). . Ezenkívül a kvercetint körülvevő négy aminosav (ASP108, HIS145, LEU189 és LEU462) kölcsönhatásba léptek van der Waal erői révén. Beszámoltak arról, hogy a lizin és az arginin a glikációs folyamatban részt vevő fő aminosavak [56]. Ezért a kvercetin lizin- és argininmaradékokká való elfedése lehet az E. fragilis egyik lehetséges mechanizmusa a fehérje glikáció gátlására a kezdeti szakaszban.
![. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively](/Content/uploads/2022842169/202203241046127d567c69ab264671b6814abd1b4544c7.png ". The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively")
Az AGE-termékek RAGE-val való összekapcsolódásáról ismert, hogy a NADPH-oxidázon és a mitokondriumokon keresztül létrejövő ROS-képződéssel [57] több intracelluláris jelátviteli útvonal aktiválódását váltja ki (beleértve a JAK/STAT, foszfoinozitol{1}} kinázt, rho GTPázokat, SAPK/INK-t MAP kinázok, p38 és erk1/2 (p44/p42) MAP kinázok), és az NF-kB transzkripciós faktorok aktiválódásában csúcsosodik ki [58], ami a cukorbetegség és az öregedéssel összefüggő rendellenességek patogeneziséhez vezet [5]. Ezért az AGEs-RAGE kölcsönhatások blokkolása elnyomhatja a stresszt kiváltó jelátvitelt, amelyet a glikáció későbbi gátlásának terápiás stratégiájának tekintenek. A 6. táblázatban látható RAGE dokkolási eredmények bebizonyították, hogy a galluszsav rendelkezik a legmagasabb dokkolási pontszámmal (G=-6,8 kcal/mol) a vanillinsav, ferulinsav, kávésav, kvercetin és rutin (-6.68,-5.94,-5.89,-5.58 és -4.89 kcal/mol). Ezenkívül a galluszsav és a RAGE 2D modellezése azt mutatta, hogy a galluszsav öt hagyományos hidrogénkötést hozott létre a RAGE CYS38, GLY40, ALA41, LYS43 és SER83 sejtjeivel (5C, D ábra). Ezenkívül a LYS37 és a LYS43 felelősek a galluszsav és a RAGE közötti hidrofób kölcsönhatásokért. A gallussavat körülvevő öt aminosavat (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81 és GLY82) van der Waal erői kapcsolták össze, ezáltal stabilizálva a gallusz-RAGE komplexet erős kohéziós környezetet biztosítva. Összefoglalva, a jelenlegi tanulmány kimutatta, hogy az E. fragilis EAF-jában található bizonyos bioaktív vegyületek hatékony kölcsönhatásba lépnek a BSA és a RAGE célfehérjéivel. kötődik a BSA-hoz és a RAGE-hoz, és ezáltal csökkenti az oxidatív stressz és a gyulladás későbbi kialakulását (6. ábra).
3. Anyagok és módszerek
3.1. Vegyszerek és reagensek
22-azinobisz-(3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav)(ABTS), butilezett hidroxi-toluol (BHT), nátrium-azid, guanidin-hidroklorid, tween-40,1,{ {7}}difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), Folin Ciocalteau reagens, -karotin, linolsav, glükóz, 2,4-dinitrofenilhidrazin(DNPH),5,5'-Dithiobis-({{16 }}A nitrobenzoesav (DTNB), ammónium-molibdát és polifenolok standardjait a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) cégtől vásároltuk. A hidrogén-peroxidot (H2O2) a Flukától (Basel, Svájc) vásároltuk. Az alumínium-kloridot (AICl3), a nátrium-karbonátot (NazCO3), a vas-kloridot (FeCl3), a kálium-perszulfátot (K2S2Os), a kálium-ferricianidot (K3Fe(CN)6), a kénsavat és az összes oldószert a Merck Life Science-től (Darmstadt, Németország) szereztük be. ). Az aszkorbinsavat és a triklórecetsavat (TCA) Scharlauból (Barcelona, Spanyolország) szereztük be.
3.2.Növényi anyagok
Az E. fragilis-t (légi részek) Dour Lagfifatból (Oulad Teima, Taroudant, Marokkó) gyűjtötték (szélesség, 30 fok é. sz. 24'0"; hosszúság, 9. sz. 12'36") 2019 májusában. intézetünk botanikusa, Najat ELKHIATI professzor azonosította, ahol utalványminta-gyűjteményt helyeztek el. A növényt desztillált vízzel leöblítettük, levegőn megszárítottuk, turmixgépben porítottuk, és felhasználásig 49 C-on tároltuk.
3.3. Kísérleti tervezés
3.3.1. Változók kiválasztása
Számos paraméterről ismert, hogy jelentős hatással van a fenolos vegyületek extrakciójára, mint például az oldószer típusa, az oldószer koncentrációja, az extrakciós idő és az extrakciós hőmérséklet [59]. Különböző oldószerek, mint az aceton, metanol és etanol alkalmasak különböző fenolos vegyületek extrakciójára [16], de ebben a vizsgálatban az etanolt választottuk oldószerként ehető biztonságossága és zöld gyártása miatt [60]. Ezért minden tényezőt, beleértve az etanol-koncentrációt (X), az extrakciós hőmérsékletet (X2) és az extrakciós időt (X3) választottuk változóként.
3.3.2. BBD az extrakció optimalizálásához
Az extrakciós faktorok hatásának meghatározására és az E. fragilis fenolos vegyület optimális kísérleti extrakciós körülményeinek kiválasztására RSM segítségével optimalizáló eljárást dolgoztunk ki. Háromszintű, háromfaktoros BBD-t végeztek, hogy megvizsgálják három független tényező, köztük az X1 (etanol-koncentráció, százalék), X (extrakciós hőmérséklet, fok) és X3 (extrakciós idő, h) hatását a TP- és TF-tartalomra. E, fragilis kivonatok [17]. Optimalizálás céljából összesen 15 kísérletet végeztek véletlenszerűen, köztük három középponttal (1. táblázat). Az előzetes egytényezős kísérletünk alapján (az adatok nincsenek feltüntetve) az összes változót három szinten (-1, 0 és plusz 1) állítottuk be, X, (40, 60 és 80 százalék), X ,(25,42,5 és 60 fok), és X3(6, 15 és 24 h)(1. táblázat). A következő másodrendű polinomi egyenletet ((1) egyenlet) használtuk a válaszváltozók illesztésére:
ahol Y a várható válasz; o, ; én és ; a regressziós együtthatók a metszés, a lineáris, a másodfokú és az interakciós tagokhoz; és X; és X; a független változók (i ≠ j).
3.3.3. Kivonási eljárás
A porított mintát (10 g) macerációs módszerrel extraháltuk a tervezett etanol koncentrációban (40-80 százalék ;1:10, w/v), változó hőmérsékleteken (25-60 fok) különböző időszakokon keresztül ({ {5}} h) orbitális rázóinkubátoron (160 ford./perc). Gézet és Whatman 1. sz. szűrőpapírt használtunk az oldhatatlan tömeg eltávolítására. A szűrletet ezután 40 °C-on alacsony nyomáson szárítjuk R-3 Rotavapor (Büchi) alkalmazásával, így nyers etanolos kivonatot (CEE) kapunk.
3.4. A CEE frakcionálása Optimális körülmények között
Az optimális körülmények között kapott CEE-t desztillált vízben (100 ml) szolubilizáltuk, és folyadék-folyadék extrakciót végeztünk különböző növekvő polaritású oldószerekkel, így hexán frakciót (HF, 3×100 ml), diklór-metán frakciót (DMF, 3×100) kaptunk. ml), etil-acetát-frakció (EAF.3×100 ml), vízzel telített n-butanol-frakció (WBF, 3×100 ml),
és a maradék vízfrakció (WF). Ezeket a frakciókat azután szűrtük és szárítottuk a fent leírtak szerint, és az extrakciós hozamot a (2) egyenlet szerint rögzítettük:
Were Wo és W a szárított CEE/frakciók tömege és az E. fragilis por kezdeti tömege; illetőleg.
3.5. Fitokémiai elemzés
Az E. fragilis kivonatok fitokémiai tartalmának értékelésére használt spektrofotometriás technikákat a Kiegészítő anyagok részletezik [61,62].
3.6. Biológiai tevékenységek
Az in vitro antioxidáns [43,63-67] és antiglikációs aktivitás [68-70] tesztek részleteit a Kiegészítő anyagok tartalmazzák.
3.7. Az EAF RP-HPLC elemzése
Az EAF-ben lévő fenolos vegyületek elemzését Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) készülékkel végeztük, amely 100×4 mm-es és 3,5 um-es ZORBAX Eclipse SB-C18 fordított fázisú analitikai oszloppal volt felszerelve. részecskeméret [71]. Az oszlop hőmérsékletét állandóan 48 fokon tartottuk. Izokratikus elúció acetonitrillel, 0,1% ecetsav vízben (12:88, v/v) mint mozgófázis és 1 ml/perc áramlási sebesség biztosította a polifenolok jó elválasztását az E. fragilis EAF-jában. Az injektált térfogat 10 µl volt, és a kromatogramokat 330 nm-en mértük. A fenolos vegyületek retenciós idejét az EAF-ben összehasonlították a tisztán elérhető standardokéval, hogy azonosítsák őket.
3.8. Molekuláris dokkolás
Az AutoDock Tools (ADT) 1.5.6-os verzióját használták a molekuláris dokkolás vizsgálatához. Az összes vegyület SDF formátumát a PubChem adatbázisból szereztük be, majd az Open Babel GUI (2.4.1-es verzió) segítségével 3Dpdb fájllá konvertálták. A BSA (PDB ID: 4ORO) és a RAGE (PDB ID: 4LP5) kristályszerkezetét az RCSB Protein Data Bank (PDB) gyűjtötte be. Röviden, a fehérjéket először dokkoláshoz készítették elő (i) az összes heteroatom és vízmolekula eltávolításával, (i) poláris hidrogénatomok hozzáadásával és (ii) Kollman-töltések hozzárendelésével. A rácsmező mérete x{{10},y=126,z=126 és x=80,y=80.Z{{ 15}} ×=8.415,y=21.626,z=106.57 és x=37.98,y=-43.581 rácsközéppel ,z=9.371 0,375A rácstávolsággal, amelyet a BSA és a RAGE kötőhelye körül hoztak létre. A dokkolószoftvert 100-szor futtatták le a Lamarcki Genetic Algorithm (LGA) segítségével, hogy megtalálják a legjobb kötési pozíciót. A legalacsonyabb kötési energia pontszámmal rendelkező ligandumot választottuk a további vizsgálatokhoz. A Discovery Studio szoftver 2020-as verzióját (BIOVIA, San Diego, CA, USA) használták a dokkolási eredmények megjelenítésére.
3.9. Statisztikai analízis
A Design-Expert szoftver 119-es verzióját (Stat-Ease Inc. és Minneapolis, MN, USA) használták az RSM végrehajtásához. Az adatok elemzése egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) történt, amelyet Duncan post-hoc tesztje követett SPSS 26 segítségével.0(IBM Co., USA);p<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" pearson="" correlation="" analysis="" was="" conducted="" to="" investigate="" correlations="" between="" variables="" and="" their="" significance.="" all="" graphics="" were="" constructed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0="" software="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" all="" experiments="" were="" conducted="" in="" triplicate="" and="" presented="" as="" mean="" values="" ±standard="" deviation="">
4. Konklúziók
A marokkói E. fragilis gyógynövényből származó bioaktív vegyületek extrakciójának optimalizált paramétereinek beállításához BBD-vel ellátott RSM-et alkalmaztunk. Az optimális etanolkoncentrációt, az extrakciós hőmérsékletet és az extrakciós időt maximumra jósolták
A fenolos vegyületek extrakciós hozama 61,93%, 44,43 °C és 15,84 óra. Az optimális extrakciós körülmények között kapott CEE-t és annak különböző frakcióit elemeztük TP- és TF-tartalmuk, valamintantioxidánsés antiglikációs aktivitások. Az EAF frakció a legmagasabb TP és TF tartalmat és a legerősebb antioxidáns aktivitást mutatja a többi frakcióhoz képest. Emellett számos biomarker értékelése, mint például az UV-látható abszorpciós spektrum, a specifikus AGE-k fluoreszcenciája, a karbonil-tartalom és a szabad tiolok csoportja, azt mutatta, hogy az EAF a glükóz által közvetített glikációval szemben a legnagyobb védőhatással rendelkezik. Továbbá szignifikáns pozitív összefüggést figyeltek meg a fenolos vegyületek antioxidáns kapacitása és antiglikációs aktivitása között. Ez azt jelzi, hogy a fenolos vegyületek lehetnek az antioxidáns és antiglikációs hatásokért felelős fő komponensek. Az EAF-ben található bioaktív vegyületeket RP-HPLC analízissel jellemezték, és összesen hat vegyületet azonosítottak. Az in silico molekuláris dokkolás analízis hatékony kölcsönhatást mutatott ki a kvercetin és a galluszsav között, célfehérjékként BSA-val és RAGE-val. Összességében ez a tanulmány azt sugallja, hogy az E. fragilis potenciális forrása lehet a természetes bioaktív vegyületeknek, amelyek erőteljes antioxidáns és antiglikációs hatással rendelkeznek, és alkalmazni kell az öregedés és a glikációval kapcsolatos szövődmények kezelésére és megelőzésére. További tanulmányokat kell végezni a bioaktív vegyületek izolálására és farmakológiai szűrésére (azaz citotoxicitási vizsgálatra) az E. fragilis fitokémiájának és farmakológiai tulajdonságainak hatásmechanizmusának feltárása érdekében.
Hivatkozások
1. Martins, N.; Barros, L.; Santos-Buelga, C.; Silva, S.; Henriques, M.; Ferreira, ICFR főzet, infúzió és termesztett kakukkfű hidroalkoholos kivonata: antioxidáns és antibakteriális hatások, valamint fenolos jellemzés. Food Chem. 2015, 167, 131–137. [CrossRef]
2. Deetae, P.; Parichanon, P.; Trakunleewatthana, P.; Chanseetis, C.; Lertsiri, S. A thai gyógyteák antioxidáns és glikációt gátló tulajdonságai a hagyományos teákkal összehasonlítva. Food Chem. 2012, 133, 953–959. [CrossRef]
3. Yao, Q.; Liang, Y.; Shao, Y.; Bian, W.; Fu, H.; Xu, J.; Sui, L.; Yao, B.; Li, M. Advanced Glycation End Product Concentrations in Follicular Fluid of Women Undergoing IVF/ICSI with a GnRH Agonist Protocol. Reprod. Biomed. Online 2018, 36, 20–25. [CrossRef] [PubMed]
4. Grimm, S.; Ott, C.; Hörlacher, M.; Weber, D.; Höhn, A.; Grune, T. Advanced-Glycation-End-Product-Induced Formation of Immunoproteasomes: Involvement of RAGE and Jak2/STAT1. Biochem. J. 2012, 448, 127–139. [CrossRef]
5. Meenatchi, P.; Purushothaman, A.; Maneemegalai, S. A Coccinia Grandis (L.) antioxidáns, antiglikációs és inzulinotróf tulajdonságai in vitro: Lehetséges szerep a cukorbetegség szövődményeinek megelőzésében. J. Tradit. Kiegészítés. Med. 2017, 7, 54–64. [CrossRef] [PubMed]
6. Nakagawa, T.; Yokozawa, T.; Terasawa, K.; Shu, S.; Juneja, LR A zöld tea védő hatása a szabad gyökök és a glükóz által közvetített fehérjekárosodás ellen. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 2418–2422. [CrossRef] [PubMed]
