2. rész: Az aszkorbinsav, a 5-koffeoil-kinsav és a kvercetin-3-rutinozid kölcsönhatása vas jelenlétében és hiányában a termikus feldolgozás során, valamint az antioxidáns aktivitásra gyakorolt ​​hatása

További információért. kapcsolatba lépni:tina.xiang@wecistanche.com

Kattintson a linkre az 1. rész részleteiért:
https://www.xjcistanche.com/news/part1-interactions-of-ascorbic-acid-5-caffeo-54916714.html

3. Megbeszélés

3.1. Az aszkorbinsav, a 5-koffeoil-kinsav és a kvercetin-3-rutinozid szerkezet-aktivitás kapcsolata

Az AOA első mutatója, amelyet a szerkezet-aktivitás összefüggéstől függően különböző anyagokra mértek, a funkciós csoportok számából származott. Mindhárom elemzett anyagot összehasonlítva az aszkorbinsav volt a legalacsonyabb AOA-val, ezt követi a 5-koffeoil-kinsav, mígkvercetin-3-rutinozidelérte a legmagasabb AOA-t. Csepregi et al. [14] ugyanezt a sorrendet találta e három vegyület AOA-jának összehasonlításakor. Ez a rangsor a hidroxicsoportok teljes mennyiségével magyarázható: a kvercetin-3-rutinozidban tíz, a 5-koffeoil-kinsavban öt, ésC-vitaminnégy van. Mertflavonoidok, a hidroxilcsoportok teljes mennyiségét és az AOA mechanizmusaira gyakorolt ​​hatásukat korábban Burda és Oleszek kimutatta[15]. A hidroxicsoportok különösen értékesek az endiolszerkezetekben, mivel könnyen diketonokká oxidálódhatnak [8]. A vizsgált anyagokban az endiol szerkezete is fontos a fémionokkal való komplexképző képesség szempontjából [16-18]. Az endiol szerkezet a kvercetin-3-rutinozid és a 5- koffeoilkinsav molekulákban fordul elő a fenilgyűrűben, ami szintén befolyásolhatja ezen vegyületek erősebb AOA-ját. További vizsgálatok azt találták, hogy az AOA-t más molekulaszerkezetek is befolyásolhatják. A fenolsavakat valószínűleg a karbonsavcsoportok befolyásolják, például a hidroxi-fenil-ecetsav (R-CH=CH-COOH) gyengébb elektronvonó csoport, mint a hidroxi-fahéjsav (R-CH,-COOH). kávésavként a 5-koffeoil-kinsavban [19]. A flavonoidokban az aglikonok magasabb AOA-val rendelkeztek, mint a megfelelő glikozidok [20,21], a kvercetin-3-rutinozid esetében egy glikozid, az aglikon AOA-ja.kvercetinkövetkezésképpen magasabb [14]. Számos különböző funkciós csoport befolyásolhatja az AOA-t, ezért fontos, hogy különböző mechanizmusú tesztvizsgálatokat alkalmazzunk, mint például az egyelektrontranszfer (SET), a hidrogénatom transzfer (HAT) és a szekvenciális protonvesztéses elektron. átvitel (SPLET) az észleléshez. Mindegyik mechanizmus, sőt az alkalmazott vizsgálati reagens is képes kimutatni a bioaktív vegyületek különböző szerkezetét [22].

3.2. A termikus feldolgozás és a szerkezetileg különböző antioxidánsok kölcsönhatása az antioxidáns aktivitásra ásványi vas hiányában

A 40 perces termikus feldolgozás során tapasztalt stabil AOA azt jelzi, hogy a termikus lebomlás kisebb jelentőséggel bír, mint azt eredetileg feltételezték. Ezenkívül a HPLC-adatok azt mutatták, hogy a tiszta 5-koffeoil-kinsav és a kvercetin-3-rutinozid stabilak voltak, legfeljebb 20 százalékos lebomlás mellett a hőkezelés során. Korábbi vizsgálatok igazolták a 5-koffeoil-kinsav stabilitását a víz normál forráspontjáig [23], míg Dawidowicz és Typek[24] kilenc származékot talált a 5-koffeoil-kinsav 5 órás melegítése után. reflux. Az aszkorbinsav koncentrációja esetében 40 perces főzés után bomlást tapasztaltunk. Az aszkorbinsav vizes oldatban vas nélkül történő lebomlását eredményező befolyásoló tényezők lehetnek a pH-értékek, a fényterhelés, az oxidáció, a hőmérséklet és a különböző koncentrációk [25,26]. Ebben a vizsgálatban nagy valószínűséggel a hőmérséklet és a koncentráció tényezők játszották a főszerepet, mivel az oxidatív folyamatok a minimálisra csökkentek a mikrocsövekben lévő minimális gáztér miatt. Lehetséges, hogy a maradék gázfázis még mindig elegendő az aerob körülmények közötti lebontáshoz. Az eltérő körülmények más-más terméket eredményeznek [27,28], így ebben a vizsgálatban 40 perc főzés után mindkét feltételnek megfelelő termékeket lehetett találni. Yuan és Chen [28] arról számolt be, hogy a furfurol, a 2-furosav, a 3-hidroxi-2-pirron és egy ismeretlen anyag az aszkorbinsav fő bomlástermékei vizes oldatban a pH-értéktől függően. . Shinoda et al. [29,30] a narancslében furfurált, 2-furonsavat, 5-hidroximaltolt, 3-hidroxi-2-pirront és 5-(hidroxi-metil) bomlástermékeket talált. )furfurol. Hsu et al. [31] az aszkorbinsavat etanolos oldatokban elemezte, és 2-furonsavat és 3-hidroxi-2-pirront mutatott ki. Az aerob vagy anaerob körülményektől függően az észlelt aszkorbinsav-származékok (3. és 4. csúcs) furfurol, 2-furoinsav, 3-hidroxi-2-pirron vagy intermedierek lehetnek. Az aszkorbinsav dózis-hatás összefüggésben csökkent, a magasabb koncentrációjú aszkorbinsav pedig alacsonyabb lebomlási arányt mutatott a főzés során. Úgy tűnik, hogy az aszkorbinsav magasabb koncentrációban stabilizálja magát, feltehetően a hidrogénkötéseknek és a van de Waals-energiának köszönhetően [32].

A bináris és háromkomponensű keverékekben főként az AOA-ra gyakorolt ​​további hatásokat találtak. A bináris keverékekben, ha a magasabb AOA-t tartalmazó anyag koncentrációja nőtt, akkor kombinációjuk AOA-ja is nőtt. Más vizsgálatok additív hatást is találtak a (plusz)-katekin (200 um) és aszkorbinsav (50-200 mg/L) között[33], valamint a különböző monoterpének bináris keverékei között[34]. Csak a DPPH-tesztben találtak antagonista hatást a kvercetin-3-rutinoziddal kombinált 5-koffeoil-kinsavban és a kétszeres kvercetin-3-rutinozid-koncentrációjú terner keverékekben. Ennek oka lehet a molekulák térbeli orientációja, különösen a kvercetin-3-rutinozid, mint meglehetősen nagy molekula, valamint a DPPH gyökmolekula térbeli hozzáférhetősége [35]. A TPC vizsgálatban az aszkorbinsav és a 5-káfeoil-kinsav kombinációja erős antagonista hatást eredményezett 1:2 arányban, míg a fordított keverékek 2:1 arányban erős szinergikus hatásokat eredményeztek, meghaladva a hatások összegét. megfelelő AOA-k. A kettős koncentrációjú aszkorbinsav ilyen körülmények között további lökést adhat az AOA-nak, az önstabilizációnak köszönhetően, amelyet más molekulák stabilizálása követ, amit ebben a kísérletben a 5-koffeoil-kinsav mutat be. A gránátalma-nektarin lében a természetes fenolok és az aszkorbinsav között ugyanaz a kölcsönhatás, míg a szőlőlében az aszkorbinsav koncentrációjának növelésével fokozódó antagonista hatást figyeltek meg [36]. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az aszkorbinsav, a 5-koffeoil-kinin és a kvercetin{20}}rutinozid keverékei akkor érik el a legmagasabb AOA potenciált, amikor a leghatásosabbak.antioxidánsokbőségesen rendelkezésre állnak.

Kattintson, ha többet szeretne megtudni a termékekről

3.3. Az ásványi vas hatása

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>C-vitamin. Azonban a vas hozzáadása a keverékekhez hatással volt a TEAC és DPPH assay eredményeire, míg a TPC assay-t széles körben nem befolyásolta. Emiatt fontos, hogy a vasban gazdag mintákkal végzett munka során különböző vizsgálati módszereket alkalmazzunk, eltérő működési mechanizmusokkal.

Csak a DPPH-tesztben a tiszta kvercetin-3-rutinozid AOA-értéke, valamint aszkorbinsavval, ekvimoláris vagy nem ekvimoláris, kétszeres kvercetin-3-rutinozid-koncentrációval kombinálva volt alacsonyabb vas jelenlétében. Boligon et al. [351] kifejtette, hogy a DPPH-teszt jobban kimutatja a kisebb antioxidánsokat, mivel ezek a gyökök sztérikusan hozzáférhetők. Feltételezhető, hogy a kvercetin-3-rutinozid a két kötőoldalával meglehetősen nagy komplexeket tud felépíteni a vassal, és így hozzáférhetetlen a vizsgálathoz. Amint azt Kejic et al. [8], ez a fémionok koordinációján keresztül szupramolekuláris komplexek képződésével magyarázható. Az aszkorbinsavval kombinálva, amely 1:2 arányban képes vegyes vegyértékű komplexeket felépíteni [12], feltehetően ezek a nagyobb vegyes komplexek nem tudnak kölcsönhatásba lépni a DPPH gyökkel. A jelen tanulmány eredményeivel ellentétben más tanulmányok [18,37,38] a DPPH-teszt segítségével azt találták, hogy a kvercetin-3-rutinozid komplexek hatékonyabb antioxidánsok, mint a tiszta kvercetin-3-rutinozid. Ismeretes, hogy a flavonoidok és fémionok kelátkomplexei meggátolhatják a komplexált fémionok gyökaktivitását [39]. Az egyetlen különbség az volt, hogy ebben a tanulmányban ammónium-vas(II)-szulfátot használtak a Symonowics és Kolandek munkájában használt vas(ⅡI)-klorid vagy -szulfát helyett [39].

Vas jelenlétében 2:1 arányban szinergikus hatást, 1:2 arányban pedig antagonista hatást találtak. A 5-koffeoil-kinsav és a vas kombinációja nem javasolt in vivo [6]. Ez a tanulmány azonban kimutatta, hogy in vitro az aszkorbinsavnak a 5-koffeoil-kinsavhoz képest megkétszerezett mennyisége akár szinergikus hatást is gyakorolhat az AOA-ra. Az arányokra vonatkozó további vizsgálatok kimutathatják, hogy in vivo is elérhetők-e pozitív hatások.

A HPLC adatok szerint a vas hozzáadása minimális hatással lesz a minta katalitikus aktivitására, mivel csak az aszkorbinsav koncentrációja csökkent 0 perc főtt mintákban. A főtt aszkorbinsavmintákban, ellentétben a vas nélküli mintákkal, a magasabb aszkorbinsav-koncentráció magasabb lebomlási arányt eredményezett.5-A koffeovkinsav és a kvercetin-3-rutinozid további tényezőket igényel a hőmérséklet és az idő, valamint a kölcsönhatások keverékekben, a vas katalitikus aktivitásának működéséhez. A kvercetin-3-rutinozid vas jelenlétében csak az aszkorbinsavval alkotott bináris keverékekben csökkent hőkezelés után. Ennek oka az lehet, hogy a flavonoid elsődleges antioxidánsként működik, majd a keletkező vegyületgyök reakcióba lép az aszkorbinsavval, regenerálva az eredeti vegyületet [18]. 5-A koffeoil-kinsav különlegesnek tűnik, mert védi a kvercetin-3-rutinozidot, míg az aszkorbinsav nem képes megvédeni a kvercetin-3-rutinozidot. Ezért a 5-koffeoil-kinsav lehet a kulcsmolekula a rendszer stabilizálásában, vassal és hőkezeléssel kombinálva. Ez a 5-koffeoil-kinsav mint stabilizáló molekula hipotézise a háromkomponensű keverékekben is megerősítést nyert. Itt a kvercetin-3-rutinozidot mindig 5-koffeoil-kinsav stabilizálta, így még aszkorbinsav jelenlétében sem volt megfigyelhető a kvercetin-3-rutinozid koncentrációjának csökkenése. Egy másik tanulmányban a 5-koffeoil-kinsav védő tulajdonságokat mutatott ki az antocianinok lebomlásával szemben egy ko-pigmentációs mechanizmus révén [40]. Vas jelenlétében mindhárom anyagból új bomlástermékek jelentek meg, valószínűleg magasabb AOA-val. A kávésavat (6. csúcs) a 5-koffeoil-kinsav bomlástermékeként azonosították (az adatokat nem mutatjuk be). Ez ahhoz a feltételezéshez vezetett, hogy a másik anyag lehet kininsav vagy a Dawidowicz és Typek által leírt kilenc lehetséges származék egyike [24]: kininsav;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-dihidroxi-fenil)-2-hidroxi-propanoil]-1,4,5-trihidroxi-ciklohexán-karbonsav; (1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-dihidroxi-fenil)-3-hidroxi-propanoil]-1,4,5-trihidroxi-ciklohex-ánkarbonsav; transz 3-O-koffeoil-kinsav; transz 5-O-koffeoil-kinsav; transz 4-O-koffeoil-kinsav; kávésav; cisz-5-O-koffeoil-kinsav; 4,5-dikaffeoil-kinsav. A kvercetin{55}}rutinozid esetében egy bomlástermék jelenik meg a kromatogramon, amelyet nem lehetett azonosítani.

3.4. Képes kelátot képezni vas(Fe3 plusz) és vas(Fe2+) segítségével

Minden aszkorbinsavat tartalmazó mintában a vasvas vasvassá redukálódott. Ebben a folyamatbanC-vitaminelektront vesz a vasvasból, és redukálja azt vasvassá, és maga is gyökké válik. Az instabil gyök gyorsan átalakul dehidroaszkorbinsavvá és további bomlástermékekké [12]. A hiányzó hidroxi-peroxid miatt a Fenton-cikluson keresztül nem lehetséges a visszareakció vasvassá. 0 perc főtt bináris keverékekben a vas több mint 20 százaléka kötődött meg aszkorbinsav jelenlétében. Ismeretes, hogy az aszkorbinsav komplexeket képez vasfajokkal és más fémionokkal a 3-O és 2-O atommagokon keresztül kelátképződéssel, miután a hidrogén kiszorítja az 3-OH-ból és 2--ből. OH csoportok [16,17,41. Vegyes vegyértékű vas-aszkorbát komplexeket is képezhet [42]. Az aszkorbinsav azonban gyenge kelátképző szer, és főzés után csak nyomokban volt kimutatható megkötött vas a tiszta és vegyes mintákban, ha aszkorbinsav volt jelen. Ezenkívül a főzési folyamat következtében az aszkorbinsav bomlástermékekké bomlik, amelyek úgy tűnik, nem képesek kelátképződni a vassal.

5-A koffeoil-kinsav viszonylag gyenge redukálószer. A vasvasat a 5-koffeoil-kinsav redukálta, és a hosszan tartó főzés hatására a redukció fokozódott.5-A koffeoil-kinsav a vasassal kelátot képez ligandumként fémre való töltésátvitelben [17].5-Koffeoil-kinsav egy lehetséges kötőoldalt hordoz a kávésav 3,4-endiol szerkezetében. Ez arra utalhat, hogy a kávésav miért a 5-koffeoil-kinsav bioaktív része, míg a kinsavnak szinte nincs AOA [43]. Az endiolok gátolták az OH képződését a vaskomplex [41] képződése miatt egy az egyhez arányban [44,45]. Lamy és munkatársai[46] arra a következtetésre jutottak, hogy a 5-koffeoil-kinsav monomer komplexeket képez, míg Kiss et al. [47] oligomer fajokat talált. A korábbi tanulmányokkal [17,48] ellentétben a megkötött vasnak csak nyomait találták 5-koffeoil-kinsav jelenlétében az elő- és utótermikus feldolgozás során. Ez ebben a tanulmányban a semleges pH-viszonyokkal magyarázható, míg más vizsgálatok savas közegben dolgoztak, az emberi gyomorban mért 1-2,5 pH-érték alapján [48]. A tárolt mintákban több óra elteltével fekete csapadékot találtak, ami a 5-koffeoil-kinsav-vas-komplexek jelzője. Az analízishez a közelmúltban kevert mintákat használtam, így ezeknek a komplexeknek a semleges pH-n való kialakulása hosszabb időt igényel. A kávésavval alkotott vaskomplexek csekély tisztító aktivitást mutattak [49]. Továbbá nincs spektrofotometriai bizonyíték a kinsav és a vas közötti reakcióra [48]. A 5-koffeoil-kinsavval ellentétben a kvercetin-3-rutinozid mintában kötött vasat találtak, még hőkezelés után is.

A kvercetin-3-rutinozid a vasvasat vasvassá redukálta, minimális növekedéssel a hosszabb főzési idővel. A kvercetin-3-rutinozidnak ezt a mérsékelt redukáló aktivitását korábban Mira és munkatársai írták le. [50]. A kvercetin-3-rutinozid vas(III)-redukáló aktivitását a 3-rutinozidban, 5,7,3',4'-OH-ban mutatták ki [50]. A vasvassal való mérsékelt kölcsönhatás az -OH csoportok kisebb számával magyarázható, ami alacsonyabb negatív töltéssűrűséget eredményezett a kelátképző oldalon [50]. A flavonoidok három lehetséges koordinációs oldalon kelátképződhetnek fémionokkal: (i) 5-hidroxi- és 4-karbonilcsoportok között, (ii) 3-hidroxi- és 4-karbonilcsoportok között, és (ii) 3', A'-hidroxicsoportok között a Bringben [39]. A kvercetin-3-rutinozid az (i) és (i) kötőoldalt használja[9], a 3-hidroxicsoporthoz pedig a rutinozid kapcsolódik. A spektrális adatok azt is mutatták, hogy a fémionok csak a 3', A'-hidroxicsoporthoz kötődnek [18]. A kelátok hatékonyabbak a kétértékű vassal [50]. A bináris keverékekben a kvercetin{27}}rutinozid nem képes komplexeket képezni, ha aszkorbinsav van jelen, ellentétben a háromkomponensű keverékekben. Ha 5-koffeoil-kinsav van jelen, kis mennyiségű megkötött vas található. Ez azt jelzi, hogy a 5-koffeoilkinin megvédi a kvercetin-3-rutinozid molekulákat aszkorbinsav jelenlétében, így a kvercetin-3-rutinozid komplexeket képezhet a vassal.

4. Anyagok és módszerek

4.1.Vegyi anyagok

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 százalék), a vas-ammónium-szulfát dodekahidrátot és a vas-ammónium-szulfát-hexahidrátot a Carl Roth-tól (Karlsruhe, Németország) vásároltuk.

4.2.Minták

Az aszkorbinsav, a {{0}}koffeoil-kinsav és a kvercetin-3-rutinozid autentikus standardjainak vizes oldatai és keverékei tiszta oldatok és keverékek formájában készültek, különböző arányban. Az összes lehetséges bináris keveréket ekvimoláris arányban állítottuk elő, és a nem ekvimoláris arányokat egy vegyülettel megdupláztuk. Terner keverékeket is készítettek ekvimoláris arányban, valamint nem ekvimoláris arányban egy, illetve két vegyület kétszeresével. Az antioxidánsok végső koncentrációja minden tesztoldatnál 0,3 mM volt. Ezenkívül az összes kísérletet megismételtük, miután keverékenként összesen 0,3 mM vasat ({{10}},15 mM vas- és 0,15 mM vas-vas) adtunk hozzá. Az antioxidánsok és a vas megválasztott mennyisége nem fiziológiai vagy élelmiszerszinten alapul, hanem moláris tömegen alapul, hogy a molekuláris kölcsönhatás hatását vizsgálja. Következésképpen ekvimoláris arányt állapítottak meg az összes antioxidáns és a vas között. Minden keveréket 0, 10, 20 és 40 percig főztünk forrásban lévő vízben, majd jégen lehűtöttük, hogy leállítsuk a melegítési folyamatot. Ezt három független ismétlésnél végezték el.

4.3.Fotometriai mérések

Antioxidánsok(tisztán vagy vegyesen) vas hiányában és jelenlétében mértük teljes redukáló és antioxidáns aktivitásukat három független technikai ismétlésben, nagy áteresztőképességű módszerrel 96-lyuklemezeken (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). A különböző reakciómechanizmusok miatt különböző tesztvizsgálatokat alkalmaztunk: egyelektron transzfer (SET) és hidrogénatom transzfer (HAT). Míg a TEAC- és TPC-teszt SET-en alapul [17,18], addig a DPPH-teszt esetében a szakirodalom nem egészen világos, hogy SET-en, HAT-on vagy akár e két mechanizmus kombinációján alapul-e [{{6} }]. Foti nemrégiben végzett tanulmánya[51] felfedezte, hogy a fenolok szekvenciális protonvesztéses elektrontranszfer (SPLET) révén reagálhatnak a DPPH-val, amely a két mechanizmus kombinációja. Olyan tényezők, mint a közepes polaritás és az ionizációs potenciál, befolyásolják az uralkodó mechanizmust.

4.3.1. Összes fenoltartalom (TPC)

A teljes fenoltartalmat (TPC) a Folin-Ciocalteu módszerrel határozták meg egy 96-lyukú lemezen, amelyet korábban Bobo-Garcia és munkatársai ismertettek.[52] némi módosítással.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). A teszt általános elnevezése félrevezető, mert a Folin-Ciocalteu reagens nem fenolos anyagokra is reagál, például vitaminokra és ásványi anyagokra [22]. Jobban leírja a bioaktív vegyületek "teljes redukáló aktivitását".

4.3.2. Trolox egyenértékű antioxidáns kapacitás (TEAC)

Az antioxidáns aktivitást a TEAC-teszt segítségével határoztuk meg egy 96-lyukú lemezen, némi módosítással. 9,6 mg ABTS-t és 1,66 mg kálium-perszulfátot tartalmazó törzsoldatot 25 ml-re vízzel töltöttünk, és sötétben, szobahőmérsékleten inkubáltuk 12-16 órán át. Ebből a törzsoldatból TEAC munkaoldatot készítettek, amely 5 ml törzsoldatot tartalmazott, amely 25 ml-ig 100%-os MeOH-val volt megtöltve.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*gyökfogás

Azantioxidánsactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Szinergizmus és antagonizmus

Az antioxidáns aktivitás szinergikus és antagonista hatásának elemzéséhez a kísérleti eredményeket összehasonlítottuk az egyes komponensek megfelelő koncentrációjú hatásainak összegével számított elméleti értékekkel [53]. A szinergizmus két vagy több anyag kölcsönhatását írja le úgy, hogy az együttes hatás nagyobb, mint a külön-külön ható anyagok összege. Ezzel szemben az antagonizmus olyan jelenség, amikor két vagy több anyag kölcsönhatásának együttes hatása kisebb, mint az egyedi hatások összege.

4.5. Az ionos vas meghatározása

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Az összes vas és az ionos vas, a vas és a vas összege közötti különbség a kötött vas.

4.6.HPLC-DAD

Az aszkorbinsav, a 5-koffeoil-kinsav és a kvercetin-3-rutinozid antioxidánsok mennyiségi meghatározása, valamint ezek bomlástermékei ugyanazokban a kivonatokban, amelyeket a fotometriás vizsgálathoz használtak.

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99) készültek. A származtatott vegyületeket feltételesen a tiszta standardok elemzésével azonosították vas elő- és utófeldolgozása jelenlétében és hiányában. Ezért az új csúcsnak a betétszabványból kell származnia. Ezenkívül a kiválasztott keverékeket HPLC-MS segítségével mértük a javasolt szerkezet igazolására.

4.7. Statisztikai analízis

A Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, USA) és az R Statistics (3.6.3-as verzió, Hold-ing the Windsock, 2020) alkalmazást használtuk a biostatisztikai tesztekhez, valamint az adatok bemutatásához és rajzolásához. A kezelések értékelésére és összekapcsolására szolgáló következtetési statisztikákat háromutas varianciaanalízis (ANOVA), post hoc Tukey-féle HSD-teszt és Pearson-korreláció segítségével végeztük. A használt R csomagok a ggplot2 [55], a mean [56] és a multcomp [57] voltak.

5. Következtetések

A fent ismertetett eredmények alapján az aszkorbinsav, a 5-koffeoil-kinsav és a kvercetin-3-rutinozid AOA-értékét molekulaszerkezetük, koncentrációjuk, arányuk, valamint más antioxidánsokkal és vassal való kölcsönhatásuk befolyásolta. A kölcsönhatás különösen úgy tűnik, hogy szerepet játszik az AOA-ban az aszkorbinsav és a 5-koffeoil-kinsav kombinálásakor. Itt szinergikus és antagonista hatásokat észleltek. A hőmérséklet minimális hatással volt az AOA-ra, ugyanakkor a hőmérséklet befolyásolta az összes antioxidáns stabilitását bizonyos keverékekben, különösen vas jelenlétében. Csak az aszkorbinsav koncentrációja csökkent vas hiányában a hosszabb főzési idővel, és a 5-koffeoilkinsav koncentrációja csak vas jelenlétében, míg a kvercetin-3-rutinozid koncentrációja csak aszkorbinsavval kombinálva csökkent. vas jelenléte. A vassal kombinálva a 5-koffeoil-kinsav képes volt megvédeni más molekulákat attól, hogy a termikus feldolgozás hatására csökkenjen koncentrációjuk.

A növényekben az aszkorbinsav, a 5-koffeoil-kinsav és a kvercetin-3-rutinozid kombinációja nemcsak lehetséges, hanem gyakori is. Így ezek az eredmények alapvető ismereteket adnak a zöldségfőzés során lezajló folyamatokról. Az élelmiszer-mátrixok összetettebbek, és számtalan bioaktív vegyületet tartalmaznak, köztük enzimeket, egyéb ásványi anyagokat vagy savakat, amelyek megváltoztatják a reakciókörülményeket, vagy maguk is reagensek. Ezek az összetett kölcsönhatások messze túlmutatnak e tanulmány keretein, és jótékony koncentrációi és kölcsönhatásaiantioxidánsoka főtt zöldségeknél a jövőben foglalkozni kell.

Hivatkozások

1. Mellor, DD; Naumovski, N. A kakaó hatása a cukorbetegségben: A hasnyálmirigy és a máj, mint kulcsfontosságú célszerv lehetősége, több mint antioxidáns hatás? Int. J. Food Sci. Technol. 2016, 51, 829–841. [CrossRef]

2. Crozier, A.; Jaganath, IB; Clifford, MN Fenolok, polifenolok és tanninok: áttekintés. Növényi másodlagos metabolitok: előfordulása, szerkezete és szerepe az emberi táplálkozásban; Crozier, A., Clifford, MN, Ashihara, H., szerk.; Blackwell Publishing: Hoboken, NJ, USA, 2006; 1–24. ISBN 1-4051-2509-8.

3. Miller, D. Átmeneti fémek, mint „autooxidációs” reakciók katalizátorai. Free Radic. Biol. Med. 1990, 8, 95–108. [CrossRef]

4. Buchner, N.; Krumbein, A.; Rohn, S.; Kroh, LW A termikus feldolgozás hatása a rutin és kvercetin flavonolokra. Rapid Commun. Tömegspektrum. 2006, 20, 3229–3235. [CrossRef]

5. Layrisse, M.; García-Casal, MN; Solano, L.; Barón, MA; Arguello, F.; Llovera, D.; Ramírez, J.; Leets, I.; Tropper, E. Vas biohasznosulása emberekben vas-bisz-glicin keláttal, fitátokkal és polifenolokkal dúsított reggelikből. J. Nutr. 2000, 130, 2195–2199. [CrossRef] [PubMed]

6. Hurrell, RF; Reddy, M.; Cook, JD A nem hem vas felszívódásának gátlása emberben polifenol tartalmú italokkal. Br. J. Nutr. 1999, 81, 289–295. [CrossRef] [PubMed]

7. Kostyuk, VA; Potapovich, AI Radikális és kelátképző hatások a flavonoid védelemben a szilícium-dioxid által kiváltott sejtsérülés ellen. Boltív. Biochem. Biophys. 1998, 355, 43–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Kejík, Z.; Kaplánek, R.; Masaˇrík, M.; Babula, P.; Matkowski, A.; Filipenský, P.; Veselá, K.; Gburek, J.; Sýkora, D.; Martásek, P.; et al. Flavonoidok vaskomplexei – antioxidáns kapacitás és azon túl. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 646. [CrossRef]

9. Latos-Brozio, M.; Masek, A. Különféle polimerizációs módszerekkel nyert monomer és polimer polifenolok (kvercetin, rutin és katechin) szerkezet-aktivitás összefüggéseinek elemzése. Chem. Biológiai búvárok. 2019, 16, e1900426. [CrossRef] [PubMed]

10. Gullón, B.; Lú-Chau, TA; Moreira, MT; Lema, JM; Eibes, G. Rutin: Áttekintés az extrakciós, azonosítási és tisztítási módszerekről, biológiai tevékenységekről és a biológiai hozzáférhetőség fokozását célzó megközelítésekről. Trends Food Sci. Technol. 2017, 67, 220–235. [CrossRef]