Egy új kvercetin-acetilezett származék szerkezeti kialakítása, szintézise és antioxidáns, antileishmania, gyulladás- és rákellenes hatásai

További információért. kapcsolatba lépni:tina.xiang@wecistanche.com

Absztrakt: A kvercetin(Q) egy biológiai potenciállal rendelkező bioflavonoid; azonban a vízben való rossz oldhatóság, a kiterjedt enzimatikus anyagcsere és a csökkent biológiai hozzáférhetőség korlátozza biofarmakológiai felhasználását. A tanulmány célja az volt, hogy Q-ban acetilezéssel szerkezeti módosítást hajtsunk végre, így a kvercetin-pentaacetát(Q5) analógot kapjuk, hogy megvizsgáljuk a biológiai potenciálokat (antioxidáns, antileishmania, gyulladásgátló és citotoxicitás) sejttenyészetekben. A Q5-öt FTIR, 'H és 13C NMR spektrumokkal jellemeztük. AzantioxidánsA potenciált az ABTS· plus radikálissal szemben értékelték. A gyulladásgátló potenciált a pro-inflammatorikus citokin tumornekrózis faktor (TNF) és a nitrogén-monoxid (NO) termelésének mérésével értékelték BALB/c egerekből származó peritoneális makrofágokban. A citotoxicitási teszteket AlamarBlue módszerrel végezték rákos sejtekben HepG2 (humán hepatocarcinoma), HL-60 (promyelocytás leukémia) és MCR-5 (egészséges humán tüdő fibroblasztok), valamint MTT módszerrel C6 sejteknél. kultúrák (patkány glióma). Q és Q5 29, illetve 18 százalékos antioxidáns aktivitást mutatott, amit a hidroxilcsoportok acetilcsoportokkal való helyettesítése indokol. A Q és Q5 koncentrációfüggő csökkenést mutatott az NO és a TNF termelésben (p<0.05); q="" and="" q5="" showed="" higher="" activity="" at="" concentrations="">40μM when compared to dexamethasone （20 μM）. For the HL-60 lineage, Q5 demonstrated selectivity, inducing death in cancer cells, when compared to the healthy cell line MRC-5（IC50>80 μM). Végül a Q5 citotoxikus felsőbbrendűségét igazolták (IC50=11 μM）), amely 50 μM mellett 24 órán keresztül változásokat indukált a kerek testformával jellemezhető C6 gliómasejtek morfológiájában (az irodalomban még nem számoltak be). ). A Q5 analóg potenciális biológiai hatással bír, és ígéretes lehet más sejttenyészetekkel, különösen idegi sejtkultúrákkal szembeni további vizsgálatokhoz.

Kulcsszavak: kvercetin;szintézis; kvercetin-pentaacetát; antioxidáns; antileishmania; gyulladáscsökkentő;citotoxicitás

Kattintson, ha többet szeretne megtudni a termékekről

1. Bemutatkozás

kvercetinegy bioflavonoid, amely bizonyítottan hatással van az egészségre és jól dokumentált biokémiai aktivitással. Ezt a vegyületet tartják az egyik legerősebb antioxidánsnak a polifenolok között [1-3]. Tulajdonságai miatt a kvercetint különféle terápiás alkalmazásokra tesztelték, mint plantioxidáns, parazitaellenes,gyulladáscsökkentőés rákellenes tevékenységek [4,5]. A parazita betegségekben a flavonoidok nagy érdeklődésre számot tartó csoportot jelentenek. Ez annak köszönhető, hogy a gazdaszervezetekben alacsony toxicitást mutatnak, és számos olyan mechanizmusnak köszönhető, amellyel a fertőzések során a kórosan megváltozott folyamatokat módosítani tudják [6].FlavonoidokA leishmaniasis kezelésében több célpont is van, és olyan célpontok is vannak, mint az argináz, ribonukleotid-reduktáz és topoizomeráz II [7,8].

kvercetintöbbféle rákellenes hatással rendelkezik a szolid daganatok többféle típusában. Ezenkívül bebizonyosodott, hogy a HL-60 sejtekben (amelyek az akut mieloid leukémiából (AML) származnak) jelentősen csökkenti a tumor növekedését az intratumorális oxidatív stressz csökkentésével, az extracellulárisan szabályozott kináz (ERK) jel aktiválásával, és ezt követő apoptózis [9]. A kvercetin javította a pro-inflammatorikus választ az IL-6 és a TNF expresszió csökkentésével, pozitív gyulladásgátló aktivitással humán THP1 makrofág populációkban [10].

A különböző ráktípusok közül a glióma az egyik legagresszívebb és rossz prognózisú. Sajnos a fő terápiák (sebészeti eltávolítás, sugárterápia és kemoterápia) nem hatékonyak. A betegek átlagos teljes túlélése körülbelül 14 hónap [11]. Mindazonáltal új vegyületek, mint például a temozolomid [12], a retinoidok [13] és a flavonoidok [14] gliómaellenes aktivitást mutattak. A kvercetin daganatellenes hatását a glioblasztóma sejtjeivel szemben írták le, amely a gliomák közül a legagresszívebb [15].

Az abnormális immunválaszok számos betegség kialakulásában és kialakulásában vesznek részt, beleértve az autoimmun betegségeket, allergiákat, rákot és neurodegeneratív betegségeket.Flavonoidokpotenciális immunmoduláló hatásúak, és klinikai alkalmazás alternatívájaként tanulmányozzák. A kvercetin jelentős immunmoduláló hatást fejthet ki a Th{0}} és Th-2 profilból származó citokinek sejttermelésében és a limfocita proliferációban, szabályozva a sejtes immunitást[16]. Ezenkívül a kvercetin eltérően módosíthatja az interleukin gének expresszióját a perifériás vér mononukleáris sejtjeiben (PBMC), így előnyben részesíti a Th-1 profilt, amely elősegíti a sejtes immunitást az interferon-gamma (IFN-y) révén, a Th{ {6}} profil részt vesz a humorális immunitásban és a makrofágok IL általi aktiválásában-4 [17].

Az alacsony vízoldhatóság, a kiterjedt anyagcsere és az enzimes lebomlás korlátozza a kvercetin biológiai hozzáférhetőségét, és csökkenti a kvercetin terápiás szerként való biofarmakológiai felhasználását[13]. A polifenolok alacsony biológiai hozzáférhetőségének leküzdésére, in vivo aktivitásuk tesztelésére és feltárására egy érdekes megközelítés a természetes vegyület kémiai módosítása, az oldhatóság növelése és az anyagcsere lassítása. Így számos szintetikus utat tanulmányoznak, mint például az acetilezést, aminok hozzáadását és brómozását, oximokká való módosítást és hidrazinokkal való komplexképzést [18-20].

Ebben a tanulmányban szerkezeti módosítást hajtunk végre a kvercetinben, amelynek célja az analóg kvercetin-pentaacetát (Q5) kinyerése az antioxidáns potenciál, a gyulladáscsökkentő aktivitás és a rákos sejtek növekedésének gátlása érdekében, hepatocarcinoma (HepG2), promyelocyta leukémia. (HL-60) és patkány glióma (C6) sejtek.

2. Eredmények és megbeszélés

2.1. Szintézis és jellemzés

Az analóg kvercetin (3,3', A',5,7-pentaacetát) szintéziséhez a teljes acetilezési megközelítést alkalmaztuk, amelyet az irodalomban található kísérleti körülményekhez igazítottak [21]. Ily módon az ecetsavanhidridet acilezőszerként, a piridint pedig katalizátorként konzerválják.

A kapott termék (Q5), sárga szilárd anyag, az olvadáspontja 178-186 fok tartományban volt, ami kompatibilis az irodalmi adatokkal[18]. Ezenkívül a kvercetin és a termék közötti FTIR összehasonlító elemzése kimutatta, hogy a kvercetin-hidroxilcsoportokra jellemző 3400 cm-1-ben nincsenek abszorpciós sávok, valamint a karbonil-észterre utaló 1600-1650 cm-' körüli sávok megjelenése. , amely bemutatja a hidroxilcsoportok acetilcsoportokkal való helyettesítését: IR (KBr)v(cm-1):1761,1652,1615, 1505, 1442,1377,1208,1176,1121,1085,1012,892,83 és 6,0692,83 (1.ábra). A spektrumokat a szakirodalomban leírtakkal hasonlították össze [21].

A kvercetin (Q) és a kapott termék (Q5) mágneses magrezonancia (NMR) analízise teljes acetilációt mutatott, a hidroxilcsoportokra jellemző szingulettek eltűnésével a 9 ppm felett a H-NMR-spektrumban (S1, S2 és S{ kiegészítő ábra {4}}S6) és a metil nagy és jellegzetes jeleinek megjelenése a spektrum alifás régióiban, 2 és 3 ppm között. A 13C-NMR-spektrum (kiegészítő S3 és S7-S9 ábrák) esetében a kapott termék az észter-karbonil-csoportok reprezentatív jeleinek 170 ppm-hez közeli növekedését, valamint a vegyi anyagnak megfelelő 20 és 21 ppm közötti jelek kialakulását mutatta. a metilek öt alifás szénatomjának eltolódásai, a jelek integrálásával igazolva. A spektrumokat a szakirodalomban leírtakkal hasonlították össze [22].

Biasutto et al. [23] úttörők voltak az észtereken alapuló prekurzorok vizsgálatában, a kvercetin biológiai hozzáférhetőségének növelése érdekében. Tanulmányaik alapján Mattarei et al. [21] elősegítette a kvercetin teljes acetilezését, és nagy hozammal (79-97 százalék) kapta a Q5 származékot. Újabban Mohajeri et al. [24] 85 százalékos hozamot ért el a Q5 analóg előállítása során, melegítés mellett (180 fok 6 órán keresztül). Jelen vizsgálatunkban a Q5 szintézise hatékony volt, és egy, az irodalomban leírt adatok szerint megfelelően jellemezhető vegyületet kaptunk.

2.2. Antioxidáns ABTS· plusz Radical Activity

A Q és Q5 antioxidáns aktivitásának összehasonlító elemzése azt mutatta, hogy a kvercetin (Q) aktívabb volt az ABTS* plusz gyökök megkötésében, mint az O5 (29 százalék, illetve 18 százalék), IC50 értékkel (μM-ban) 188,850±0,003 és 379,560± 0,004 Q5 esetén.

A flavonoidok antioxidáns hatása közvetlenül összefügg molekulaszerkezetükkel. A fenolos vegyületek két mechanizmuson keresztül fejtik ki antioxidáns funkciójukat: hidrogénatom transzfer és elektrondonáció [25]. A kvercetin kiváló antioxidáns aktivitása a hidroxilcsoportok és hidrogénjeik jelentős hozzájárulásának tudható be, amelyeket a Q5 analógban acetilekkel helyettesítenek, így csökkentve a hidrogén-donor képességet vagy a szintetikus molekulák szabad gyökfogó képességét.

A tudományos irodalomban nem találtak adatokat a Q5 vegyület antioxidáns hatásáról. Ó, és társai. [26] értékelte a kvercetin-észter készítményeket és azok antioxidáns hatását, kimutatva, hogy a kvercetinnek volt a legmagasabb gyökfogó aktivitása a vizsgált minták közül. Ezért elengedhetetlen a hidroxilcsoportok nagymértékű hozzájárulása a kvercetin antioxidáns aktivitásához [27].

2.3.Antileishmania Actioity

In order to evaluate the activity of the compound(O and O5)against the promastigote forms of the two Leishmania species, the 50% inhibitory concentration(IC50)was calculated from the cell viability assay in axenic culture. For Leishmania braziliensis, Q and Q5 had ICs0 values>100 μM az amfotericin B-vel összehasonlítva (IC501,1 μM±0,1). Ezenkívül értékelték a Q5 hatását a L. amazonenses promastigóta formáira, és ez a vegyület alacsonyabb IC50-értéket mutatott (75,1). ± 4,7 μM） ennél a fajnál az L. braziliensishez képest.

Tasdemir et al. [8] összehasonlították a flavonoidok és analógjaik (kvercetinből származó) antitripanoszomális és antileishmaniális aktivitását, és azt találták, hogy ezek hatékony és hatékony antiprotozoális szerek az L donovani amasztigóta formáival szemben (IC50=1.0ug mL). -l). A L.amazonensis promastigóta formáira Fonseca és Silva et al.[27] kvercetinnel kezelt tenyészetekben 48 órán belül IC50=31.4 uM-ot találtak. Továbbá teljes sejtnövekedés-leállásról számoltak be 96 μM kvercetinnel 96 óra alatt, ami kielégítő antileishmanial-dal aktivitást mutat. Cataneo et al. [28]értékelték a kvercetin promastigóta ellenes hatását (192 μM-ig) L. brasiliensis ellen makrofágok peritoneális sejtjeiben. L. major promastigóta tenyészeteiben a kvercetin és analógja kvercetin-pentaacetát koncentrációfüggő hatást mutatott (IC). 50 =2.5±0.92 és 2.85±0.99 μM 【24】.

Egyes szerzők kimutatták, hogy a kvercetin halált okoz L amazonensis promastigotákban a mitokondriális membrán diszfunkción keresztül, amely reaktív oxigénfajták [27, 28] és más célpontok, például argináz [7], ribonukleotid reduktáz [8, 29] és topoizomeráz termeléséből ered. II[30]. Az ebben a tanulmányban kapott eredmények azt mutatják, hogy a vizsgált vegyületekre (Q és Q5) más teszteket is meg kell fontolni, figyelembe véve az in silico teszteket a megfigyelt halálozási mechanizmusokban szerepet játszó célpontok vizsgálatára.

2.4. Gyulladáscsökkentő és citotoxicitási tevékenységek

Ezután az új származék biológiai aktivitásának értékelésére összpontosítottunk. Először a Q és Q5 nem toxikus koncentrációit határoztuk meg BALB/c egerekből nyert peritoneális makrofágokban. A CCs0 értékek nem mutattak citotoxicitást 80 μM vagy annál kisebb koncentrációknál (2A, D ábra). A dexametazon nem volt citotoxikus a vizsgált koncentrációban (20 μM). Ennek alapján a következő vizsgálatokat 80 μM-ot meg nem haladó koncentrációban végeztük.

A Q és Q5 immunmodulátor aktivitását vizsgáltuk, hogy meghatározzuk a vegyületek hatását a proinflammatorikus mediátor szekrécióra. A vegyületek (Q és Q5) immunmoduláló hatását kezdetben peritoneális makrofágok tenyészeteiben értékelték nitrogén-monoxid termelésével. Ahogy az várható volt, az LPS PLUS IFNy-val végzett makrofágaktiválás növelte a nitrittermelés mennyiségét (2B, E ábra). A kvercetinnel végzett kezelés koncentrációfüggő módon gátolta a nitrit termelődését (p<>

A pentadaktilvegyület (Q5) nem mutatott hasonló aktivitást 20 μM koncentrációban. Érdekes módon az aktivitás mindkét vegyület esetében szignifikáns volt a legmagasabb tesztelt koncentrációknál (40 és 80 μM). A vizsgált legmagasabb koncentrációban (80 uM) a vegyületek hatása hasonló volt az aktivált makrofágok tenyészeteiben és 20 μM dexametazonnal kezeltekhez. A vegyületek nem voltak citotoxikusak a peritoneális makrofágokra a vizsgált koncentrációkban (20, 40 és 80 μM).

A jobb jellemzés érdekében agyulladáscsökkentőA vegyületek (O és O5) hatását, a gyulladásos citokin TNF mennyiségét az Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) módszerrel határoztuk meg. Az LPS plusz INF-y alkalmazásával végzett makrofág-stimuláció a TNF-termelés jelentős növekedését indukálta. A Q-val és Q5-tel történő kezelés jelentősen csökkentette a TNF-termelést<0.05) in="" a="" concentration-dependent="" manner="" (figure="" 2c,="">

A gyulladásos faktorok kvercetin általi csökkentését sokrétűen leírják, beleértve a Th-2 gyulladásos profilok modulálását, ami az idegrendszeri betegségek elleni védekezéshez kapcsolódik [31,32]. A kvercetin gyulladáscsökkentő hatását az irodalom jól leírja [33,34]. Azonban kevés olyan tanulmány létezik, amely bizonyítja az O5 analóg gyulladáscsökkentő potenciálját. Ez a tanulmány megerősíti Chen és mtsai. [35], akik bizonyították a Q és az O5 szerepét az LPS által kiváltott NO termelés gátlásában, koncentrációfüggő módon, káros citotoxikus hatások nélkül a RAW 264.7 makrofág vonalra. Ezenkívül ez a tanulmány kimutatta a Q5 példátlan hatását a gyulladást elősegítő citokin TNF gátlásában.

A kapott adatok a félszintetikus molekulára (O5) gyakorolt ​​hatások fennmaradását jelzik; azonban más tényezők, például az IL-10 citokin adagolása perspektíva lehet e profilok értékelésében. Ezért a Q5 potenciális molekulának tekinthető a jövőbeni in vitro és in vivo tesztekben, amelyek egy további gyulladáscsökkentő hatású terápiás alternatívát céloznak meg.

A vizsgált vegyületek (Q és Q5) citotoxicitását 20, 40 és 80 uM-on értékelték ki AlamarBlue kolorimetriás módszerrel egészséges sejtvonalon (MRC-5, humán tüdőfibroblasztok) és két különböző rákos sejtvonalon. , HepG2 (humán hepatocelluláris karcinóma) és HL-60 (humán promielocitás leukémia), amint azt a 3. ábra mutatja. A doxorubicin volt a pozitív kontrollként használt standard gyógyszer.

A 3. ábrán látható módon a HepG2 sejtek esetében a kvercetin (Q) nem mutatott szignifikáns citotoxikus aktivitást a legmagasabb vizsgált koncentrációnál (80 μM), pentaacetát analógja (Q5) pedig csökkent aktivitást (IC{{4) mutatott. }}.9μM). A HL-60 rákos sejtvonal esetében a kvercetin nem volt túl aktív (IC50=51,3 uM); érdekes módon azonban a Q5 szignifikánsan aktívabb volt, mint a kvercetin, IC50 értéke 33,6 uM. A standard doxorubicin gyógyszer IC50 értéke 0,1 és 0,2 uM között volt azoknál a rákos sejtvonalaknál, amelyek jelentős citotoxikus hatást mutattak az egészséges MRC-5 sejtvonallal szemben (1. táblázat), ami nem volt megfigyelhető a vegyületeknél (Q és Q5). .

For the HL-60 cell line, the Land O5presented values of 51.3 and 33.6 μM, respectively, in agreement with Massi et al.[17]. Regarding cytotoxicity in non-tumor cells, O and Q5 presented IC50 values >80 μM, amely szelektív profilt mutat a rákos sejtvonal ellen. Kevés tanulmány igazolta a kvercetin O5 analóg aktivitását rákos sejtvonalakban. Azonban a Q5 aktivitást egy HeLa tumorsejtvonalban Danihelovået al. [22], amely kimutatta, hogy a kvercetin acetilezett észterei a leghatékonyabb citotoxikus származékok. Nem találtunk adatokat a Q5 citotoxikus szerepére vonatkozóan a HepG2 sejtvonalban. Az irodalomban egyetlen tanulmányt találtak, amely kimutatta, hogy a kvercetin tetraacetilezett analógja a kaszpáz-3 aktivációján keresztül szignifikáns hatással volt a HL-60 vonalú sejtek gátlására, elősegítve az apoptózist [36].

Kolorimetriás módszerrel MTT vizsgálatot alkalmaztunk a citotoxicitás eléréséhez C6 sejttenyészetben. A kvercetin és a Q5 csökkentette az 57{{10}} nm-es MTT abszorbanciáját, ami a mitokondriális dehidrogenáz aktivitást jelzi, és a sejt életképességének csökkenésére utal C6 sejtekben. Amint a 4. ábrán látható, a kvercetin által kiváltott citotoxicitás a C6 sejtekben 25 uM-nál magasabb koncentrációban 72 órán keresztül (4A ábra), míg 0,78 μM Q5 72 órán keresztül képes volt csökkenteni a sejtek életképességét (4B. ábra). ). Megfigyelték, hogy 50 uM kvercetin(O) és O5 41,3%-ra ± 2,9%-ra, illetve 47,5%-ra ±1,2%-ra csökkentette a sejtek életképességét, összehasonlítva a kontrollcsoporttal (100,0% ±6,4%) (4A, B ábra). . A DMSO-val (0,05% ) kezelt C6 tenyészetekben nem észleltek szignifikáns változást a sejtek életképességében, összehasonlítva a kezeletlen sejtekkel.

A kapott eredmények alapján optikai mikroszkóppal vizsgáltuk a Q és Q5 (50 μM) morfológiai hatását a C6 sejtekre a kezelés 24., 48. és 72. órájában. A kvercetin-pentaacetát (Q5) 50 μM koncentrációban változásokat indukált a C6 gliómasejtek morfológiájában az első 24 órában, a citoplazma-megnyúlás látható csökkenésével a kontrollcsoporthoz képest (5. ábra). 48 órás Q5-kezelés után a sejtek lekerekített morfológiát vettek fel, amelyet a sejttest visszahúzódása és az alaktalan membrán jellemez (amiről a tudományos irodalomban nem számoltak be), ellentétben a kvercetinnel, amely a kezelés ezen időtartama alatt morfológiai vonatkozást mutatott. hasonló a fibroblasztokhoz [37]. Bármilyen más morfológiai változást más kezelési körülmények között tettünk láthatóvá a sejtekben.

Az acetilcsoportokkal történő hidroxil-szubsztitúció elősegítheti a kvercetin analógok jobb sejtfelszívódását, kedvezve a különféle biológiai teszteknek, különösen rákos sejtekben [38,39]. Bispo da Silva et al. [40] kimutatta, hogy a C6 sejtek rutin és kvercetin flavonoidokkal való kezelése jelentősen csökkenti a vékonyabb és bipoláris morfológiai fenotípusú adherens C6 sejtek arányát a kontrolltenyészetekhez képest. A C6 sejtek flavonoidokkal történő kezelése 24 órás kezelés után gátolta az életképes C6 sejtek migrációs tulajdonságait. Kontroll körülmények között a mikroglia kerekebb fenotípust mutatott; rutinkezelés után a sejtek több mint 50 százaléka elágazó, multipoláris fenotípust, a többiek pedig az amőboid fenotípust, mindkettő aktivációt jelez.

A tanulmányok azt mutatják, hogy a kvercetin beavatkozik az apoptózis általi sejthalálhoz kapcsolódó sejtjelátviteli utak szabályozásába és a sejtciklus progressziójának szakaszaiba [41,42]. Santos et al. [14] a GL-15 humán glioblasztóma sejtek növekedésének potenciális csökkenését jelezte. Bi et al. [43] az U87 és U251 humán glioblasztóma sejtek autofágia indukcióját vizualizálta dózisfüggő módon.

A kapott eredmények megerősítik Danihelova et al. [22], amelyben a kvercetin molekulába inszertált acetilcsoportok elősegítették a rákellenes aktivitás javulását. Ezenkívül nagyobb tropizmust jeleztek a rákos sejtek esetében, különösen az idegi vonalak sejtjeinél. Ez a tanulmány példa nélküli az O5 analóggal kapcsolatban a C6 gliómasejtek kezelésében. Dell'Albani et al. [44] a kvercetin acilszármazékainak jobb hatását mutatták ki az U373-MG humán gliómatörzsek és a 9L rágcsáló glióma törzsek tenyészetében, jelezve az apoptózis általi halálozási útvonalakat. A sejtmorfológia lekerekített profilú módosulása olyan halálozási mechanizmusokra utalhat, mint például az apoptózis, amelyet széles körben a kvercetinnek tulajdonítanak [45-47]. A jövőben az egészséges idegsejtekkel végzett tesztek segíthetnek tisztázni ezt a hipotézist.

3. Anyagok és módszerek

3.1. Reagensek és anyagok

Minden reagens (kvercetin, piridin, ecetsavanhidrid, trikoloroizocianursav, diklór-metán, 2,4-dinitro-fenil-hidrazin, hidroxil-amin-hidroklorid, nátrium-acetát, petroléter, kénsav, kálium-perszulfát) és kereskedelmi forgalomban kapható (Ouimex, Merck, Brazília és Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Valamennyi standard oldat és minta elkészítéséhez a Milli-Q Plus víztisztító rendszerből (Millipore, Molsheim, Franciaország) nyert ultratiszta vizet (18 MOcm-I ellenállású) használtunk. Minden laboratóriumi üvegedényt 10 százalékos vízben mostak ki. o/ø） HNO3-oldat 24 órán át, nagy tisztaságú vízzel öblítjük, és szobahőmérsékleten szárítjuk.

3.2. Szintézis és jellemzés

A szerkezeti analógot ezután kaptukkvercetinmolekuláris módosítás a könnyebben elérhető és reprodukálható szintetikus úton (Penta-acetiláció). A zöld kémia alapelveit alkalmaztuk a szerhasználat minimalizálásával. A pentadaktil analóg (Q5) a kvercetin molekuláris módosítása után, szintetikus úton került előállításra, amely során ecetsavanhidridet használnak acilezőszerként és piridint katalizátorként.

A kvercetint (300 mg, 1 pl.), ecetsavanhidridet (0,80 ml, 20 eg.) és piridint (7,5 ml) tartalmazó elegyet mágneses keverés közben szobahőmérsékleten tartjuk. 24 órás keverés után 250 ml diklór-metánt adunk a reakcióelegyhez. Ezután a reakcióelegyet 10%-os HCl-lel (3×100 ml), hígított NaOH-dal (3×50 ml) és vízzel (3×100 ml) mostuk; vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk; szűrt; és bepároljuk a rotációs bepárlóban (Fisatom, Minas Gerais, Brazília)[21]. A kapott O5 mennyisége 280 mg, illetve 54 százalék volt.

A kvercetin molekula szerkezeti módosulási reakcióját vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) követtük, oldószerként hexán és etil-acetát (1:1) elegyét használva. A fizikai-kémiai jellemzéshez az olvadáspontot használtam. Az Attenuated Total Reflection (ATR) módszerrel végzett Fourier Transform Infrared (FTIR) teszteket egy FTIR Spectrum 100S modellel (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) végeztük, a pásztázó spektrumok közép-infravörös (4000-től) felvételével. 600 cm-1).

A mintát (tömeg ~ 50 mg) az ATR kristályra helyeztük, és körülbelül 20 N nyomásnak vetettük alá kézi mechanikus prés segítségével. Az FTIR spektrumokat az OriginPro8 szoftver, az OriginLAB4 (www.originlab.com, elérve 2021. szeptember 10-én) követte nyomon. A mágneses magrezonancia (NMR) spektrumokat Bruker Avance IⅢI500 MHz (Uster, Svájc) spektrométerrel vettük fel -500 MHz1H-NMR-hez és 125 MHz-es 13C-NMR-hez, oldószerként DMSO-t használva. A kémiai eltolódásokat ppm skálán fejeztük ki (ug/mL), belső referenciaként pedig kloroformot (CHCla) használtunk.

Az NMR-spektrumokat TopSpin⑤4.{1}} szoftverrel (Bruker Biospin, Coventry, UK) dolgoztuk fel, és hasonlítottuk össze az irodalmi adatokkal [38]. Az NMR adatok a következők voltak: 'H NMR (5{34}}{44}} MHz, CDC13) 2,34 (6H, s, -OCOCH3); 2,35 (3H, s, -OCOCH3); 2,35 (3H, s, -OCOCH3); 2,44 (3H, s, -OCOCH3); 6,88 (1H, d, J=2,5 Hz); 7,34 (1H, d, J=2.{51}} Hz);7,36(1H,d,J=8.5);7,70 (1Hd, J=2.0Hz); 7,73(1H,dd,J1=8,5 Hz,J 2=2. ;113,89; 108,96; 21,16; 21,02; 20,65; és 20.49.

3.3. Antioxidáns ABTS* plusz Radical Activity

Az ABTS* plusz szekvesztráló aktivitást Dorman és Hiltunen [48] által leírt módszerből adaptáltuk. A kálium-perszulfátot és az ABTS-t (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) feloldottuk desztillált vízben, így 2,45 mM, illetve 7 mM végkoncentrációt kaptunk. Az ABTS-oldatot úgy állítottuk elő, hogy mindkét oldatot 1:1 arányban adtuk hozzá, majd az oldatot szobahőmérsékleten 16 órán át sötétben inkubáltuk.

A kapott, intenzív színű oldatot felhasználás előtt etanollal a spektrofotométerben {{0}},7±0,05 nm abszorbanciára állítottuk be 734 nm-en. A mintákból 30 μl-t, vagy Troloxot (Sigma Aldrich⑧, St. Louis, MO) használtunk referencia standardként, különböző koncentrációkban (5, 10, 25, 50, 75 és 100 μM) adtunk 3 ml-hez. ABTS* plusz oldatot, és 6 percig vártuk a reakciót. Az abszorbanciát 734 nm-en mértük vakpróbával (etanol) szemben. Az ABTS· plusz öblítési kapacitást a következőképpen számítottuk ki:

ABTS* plusz tisztító hatás ( százalék ){{0}} (1- A0/A1)×100;

ahol A0 a kontroll abszorbanciája, A1 pedig a minta vagy standard abszorbanciája. Minden meghatározást három párhuzamosban végeztünk. Az IC5so értékeket kiszámítottuk és átlag ± SD-ként fejeztük ki μM-ban.

3.4.Antileishmania Actioity

A Lamazonensis (MHOM/BR88/BA-125Leila törzs) és az Lbraziliensis (MHOM/BR88/BA-3456) promasztigótákat (1 × 10 fok lyukanként) tenyésztettük egy 96-lyukú lemezen Schneider táptalaj (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA), 10% magzati szarvasmarha-szérummal (FBS; GIBCO) és 50 ug mL-gentamicinnel (Life, Carlsbad, CA, USA) kiegészítve, és különböző koncentrációjú kezelésnek vetették alá. 100 µM; a Q5 hat 1–2) hígítása. A parazitákat 72 órán át 26 fokon inkubáltuk. Ezután lyukanként 20 μl AlamarBlue-t (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) adtunk hozzá 2 óra alatt. A leolvasást spektrofotométerben végeztük 570 és 600 nm hullámhosszon. Az axenikus tenyészetgátlás számítását a kezeletlen kontroll alapján határoztuk meg [49].

3.5. Gyulladáscsökkentő és citotoxicitási tevékenységek

3.5.1.Drogok

A dexametazont (Sigma-Aldrich⑧, St. Louis, MO, USA), egy szintetikus glükokortikoidot alkalmaztunk pozitív kontrollként immunmoduláló vizsgálatokban. A doxorubicint (doxorubicin-hidroklorid, Laboratory IMA SAIC, Buenos Aires, Argentína) használták referencia rákellenes gyógyszerként. Az összes vegyületet feloldottuk dimetil-szulfoxidban (DMSO; PanReac, Barcelona, ​​Spanyolország), és sejttenyésztő tápközegben hígítottuk a vizsgálatokhoz. A DMSO végső koncentrációja minden kísérletben kevesebb, mint 1 százalék volt.

3.5.2.Állatok

A 4-10 hetes BALB/c egereket a Goncalo Moniz Institute/FIOCRUZ-BA (IGM, Salvador, Bahia, Brazília) viváriumában tartották, ahol legfeljebb öt egeret tartalmazó ketrecekben tartották őket. Valamennyi ketrecet akklimatizált helyiségben tartottuk 21 fok ±1 fokon, 12-h világos/sötét ciklusban, a kísérleti időszak alatt ad libitum vízzel és táplálékkal. Az állatokkal végzett kísérleteket a Goncalo Moniz/FIOCRUZ-BA Intézet etikai és állathasználati bizottsága (IGM{6}}/15) hagyta jóvá.

3.5.3. Sejtek

A HL-60 (humán akut promyelocyta leukémia) és a HepG2 (humán hepatocelluláris karcinóma) az American Type Culture Collection-tól (ATCC) (Rockville, ML.USA) származott. A kvercetin(O) és az O5-származék nem rákos sejtek proliferációjára gyakorolt ​​szelektivitásának felmérésére az MRC-5 vonalat (humán tüdőfibroblaszt) használtuk, amelyet szintén az ATCC-től szereztünk be. A sejtvonalakat sejtben növesztettük. 10% magzati borjúszérummal (GibcoM) és 50 ug/ml gentamicinnel (GibcoTM) kiegészített RPMI 1640 táptalajt (GibcoTM) használó tenyészpalackok (75 cm3,250 ml térfogat). A sejteket 5 százalékos légkörű inkubátorokban tartottuk. CO, 37 fokon és naponta ellenőrzik. Minden sejtvonalat mikoplazmára teszteltünk Hoechst festő mikoplazma-detektáló készlettel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). A C6 sejtvonal n-nitrozometil-karbamid által indukált patkány gliatumorokból származik [50]. Ezeket a gliómasejteket de Oliveira és munkatársai által leírtak szerint tenyésztettük. [51]. A sejteket 37 °C-on, párásított inkubátorban inkubáltuk 5% CO2 mellett. A C6 sejteket sejttenyésztő edényeken (100-mm Ø, TPP) növesztettük DMEM táptalajban, amelyet 100 UI/ml penicillin G-vel, 100 ug/ml sztreptomicinnel, 7 mM glükózzal, 2 mM L-glutaminnal, 1 mM piruváttal egészítettünk ki, és 10 százalék magzati borjúszérum. A táptalajt 2 naponta cseréltük. Huszonnégy órával a kezelések előtt a C6 sejteket 35 mm átmérőjű Petri-csészékbe vagy 96-lyukú lemezekbe oltottuk 3,5 × 10* sejt/lyuk sűrűséggel.

Minden sejtvonalat teszteltünk mikoplazmára a Mycoplasma Stain Kit (Sigma-Aldrich) segítségével, hogy ellenőrizzük a szennyeződéstől mentes sejtek használatát. A sejtvonalakkal kapcsolatos információkat a "Rio de Janeiro sejtbankja (BCRJ)" adatbázis tartalmazza: HepG2 sejt (kód: 0291), HL-60 sejt (kód: 0104) és C6 sejt (kód: 0057) .

3.5.4. Citotoxikus aktivitási vizsgálat

A vizsgált vegyületek (Q és Q5) citotoxicitásának értékelésére a HL-60 (humán akut promyelocyta leukémia) és a HepG2 sejteken az Alamar Blue (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kolorimetriás módszerét alkalmaztuk. Az Alamar Blue (resazurin) egy olyan indikátor, amely kolorimetriás változást és fluoreszcens jelet produkál az anyagcsere-aktivitás hatására. A resazurint a metabolikusan aktív sejtek rezorufinná redukálják. Az oxidált forma kék (nem fluoreszcens/nem életképes sejt), a redukált forma pedig rózsaszín (fluoreszcens/életképes sejt). A resazurin resorufinné redukálása a sejtek életképességét tükrözi [52].

A vizsgálat során a sejteket {{0}}lyukú lemezeken osztottuk el előre meghatározott sűrűségben: 0,3×1{{10}} fokos sejt/ml a HL-60 sejtvonal és 0,7×10 sejt/ml a HepG2-vonal sejtjei esetében. A vegyületeket nyolc koncentrációs sorozatban (80-0,62 uM) adták hozzá, kivéve a doxorubicint, amelyet 0,003 és 5 μM közötti koncentrációban használtak. A negatív kontroll ugyanannyi (0,025 százalék) DMSO-t kapott. A lemezeket 72 órán át inkubáltuk kemencében 37 fokon és 5 százalékos CO2-on. Ezen időszak után 20 μl/lyuk Alamar Blue-t adtunk hozzá, és a lemezeket további 4 órán át inkubáltuk. A lemezeket spektrofotométerrel (Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) olvastuk le 570 és 600 nm hullámhosszon.

A C6 sejtek életképességét a Hansen és munkatársai által leírt kolorimetriás módszerrel határoztuk meg. [53]. Az MTT-t (3-4,5-dimetil-tiazol-2-il,25-difenil-tetrazólium-bromid) 5 mg/ml koncentrációban steril foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) oldottuk fel a szobában. hőmérsékleten, majd az oldatot tovább sterilizáltuk egy 0.2- mm-es szűrőn keresztül, és 4 fokon, sötétben tároltuk. A vizsgálat során a sejteket 96-lyuklemezeken osztottuk el 3,5×10* sejt/ml előre meghatározott sűrűséggel a C6 sejtvonalhoz. A vegyületeket nyolc koncentrációs sorozatban (80-0,39 uM) adtuk hozzá.

Mindegyik lyukba MTT-t adtunk 2 mg/ml végső koncentrációban, és a sejteket 2 órán át inkubáltuk. Ezt követően a sejteket 20%-os (w/ø) nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) és 50%-os (o/ø) dimetil-formamid (DMF) oldattal (pH 4,7) lizáltuk egy éjszakán át szobahőmérsékleten [54,55]. . Az abszorbanciát spektrofotométeres mikrolemez-leolvasóval (570 nm), Thermo ScientificFlash Varioskan (3001-es verzió, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finnország) mértük. Minden koncentrációhoz nyolc ismétlést használtunk. A sejtek életképességét az abszorbancia százalékában fejeztük ki 570 nm-en, és a kontrollt 100 százalékban adtuk meg. A kezelések után a sejtmorfológiát fénymikroszkóppal értékeltük optikai mikroszkóppal (Eclipse TS100 fordított mikroszkóp, Nikon Instruments, Tokió, Japán), és digitális fényképezőgéppel (Coolpix S4300, Nikon Instruments, Tokió, Japán) fényképeztük.

3.5.5. Makrofág kultúra

Peritoneális váladék makrofágokat (2×105 sejt/lyuk) inkubáltunk 96-lyukú lemezeken 10% PBS-sel és 50 ug/ml gentamicinnel kiegészített DMEM táptalajban, három párhuzamosban, LPS-sel (500 ng/ml) stimulálva vagy anélkül, és IFN-y (5 ng/mL), és különböző koncentrációjú vegyületekkel (20, 40 és 80 uM) kezelve vagy nem. A sejteket inkubátorban tartottuk 37 fokos hőmérsékleten és 5 százalékos CO2-tartalom mellett 4 24 órán keresztül. Ezen időszak után a tenyészet felülúszóit összegyűjtöttük a citokinek és a nitrogén-monoxid adagolásához. Egyes vizsgálatokban a citotoxicitás értékelésére a felülúszót tápközeg plusz 10 százalékos Alamar Blue-ra (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) cserélték ki, és a lemezeket további 4 órán át inkubáltuk. A spektrofotométer leolvasása 570 és 600 nm-en történt.

3.5.6. TNF adagolás

A TNF mérést sejttenyészet felülúszójából, szendvics ELISA technikával, Development System kitsDuoset ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MI, USA) segítségével, a gyártó ajánlásai szerint végeztük. Az ELISA lemezeket (NUNC-IMMUNO PLATE Maxisorp Surface) üregenként 50 μl befogó antitesttel érzékenyítettük, 2 ug/ml koncentrációban, PBS-ben 1x hígítottuk, és 16 órán át 4 fokon inkubáltuk. A lemezeket háromszor mostuk 1 × PBS/0.05% tween 20 oldattal, és mérőhelyenként 100 μl 1 × PBS-sel és 0,05% Tween 20 és 0,1% szarvasmarha albuminnal blokkoltuk 2 órán keresztül. .

Ezután 50 μL/lyuk minta, a rekombinánsok vak és standard görbéje, trisz-sóoldat pufferrel (20 mM Trix az alapban és 150 mM NaCl) hígítva. 0,1% szarvasmarha-albumint és 0,05% Tween 20-at adtunk hozzá 2 órán át szobahőmérsékleten. A standardot sorozathígítottuk (1:2), a kezdeti 2000 pg/ml koncentrációról 11 párhuzamos hígítással. A lemezt háromszor mostuk PBS/0,05% Tween oldattal, és 50 µl detektáló antitesttel (biotinilált) 400 ng/ml koncentrációban 2 órán keresztül inkubáltuk.

A lemezt háromszor mostuk PBS/{0}},05% tweennel, és 20 percig inkubáltuk 1:200 arányban hígított avidin-peroxidázzal. A kifejlesztést TMB szubsztrát (Thermo Fisher) hozzáadásával és 0,05 M foszforsavval megszakítva végeztük. A reakció leolvasását spektrofotométerrel (Spectramax) (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) 450 nm-es szűrővel határoztuk meg. Az elemzéseket a Softmax 4.3.1 szoftverrel (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) végeztük.

3.5.7.Nitrogén-monoxid adagolás

A makrofág felülúszókban a nitrittermelést oxidatív termékének, a nitritnek a Griess-módszerrel történő mennyiségi meghatározásával becsülték meg [50]. Az abszorbanciát spektrofotométerrel (Spectramax) határoztuk meg (Molecular Devices, San Jose, CA, USA), 570 nm-es szűrővel. Az elemzéseket a Softmax Software 4.3.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) segítségével végeztük, és az eredményeket μM nitritben fejeztük ki, a nátrium-nitrit standard görbéje alapján, 400 uM kezdeti koncentrációval.

3.6. Statisztikai analízis

Az egytényezős ANOVA tesztet, majd a Bonferroni többszörös összehasonlítás utáni tesztet használtuk a vizsgálatokban a csoportok közötti összehasonlítások statisztikai szignifikanciájának meghatározására. Az eredményeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha p<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" graphpad="" prism="" version="" 5.01="" program="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

4. Konklúziók

A kvercetin analógok szintézisének körülményei és reakciói eredményesnek bizonyultak egy, az irodalomban leírt adatok szerint megfelelően jellemzett vegyület előállításában. A Q és Q5 antioxidáns aktivitásának összehasonlító elemzése azt mutatta, hogy a kvercetin (O) aktívabb volt az ABTS* plusz gyökök megkötésében, mint az O5 (29%, illetve 18%). A csökkent antioxidáns potenciál nem mutatott interferenciát az immunmoduláló és daganatellenes aktivitásokban. A tanulmányban javasolt kémiai módosítások fokozták az antiproliferatív hatást és fenntartották a gyulladásgátló aktivitást, de nem a citotoxicitást egészséges vizsgált sejtekben.

A jelenlévő acetilezett származék (Q5) javította a citotoxicitást a rákos hepatocelluláris sejtekben (HepG2), a promyelocyta leukémia (LH-60) sejtekben, és különösen a glióma (C6) sejtekben. A forgalmazott patkány glióma C6 sejtek a sejthalál morfológiailag példátlan mintázatát mutatták. A 24 órás 50 μM-os Q5 változásokat indukált a C6glioma sejt morfológiájában, amelyet kerek testforma jellemez (amiről a tudományos irodalomban nem számoltak be), ellentétben a kvercetinnel, amely fibroblasztszerű morfológiát mutatott.

További vizsgálatokat kell végezni a kvercetin acetilezett származékainak hatásainak jobb megértése érdekében, különösen az idegsejtekben. Ez a tanulmány első alkalommal tette lehetővé szerkezetileg módosított kvercetin alkalmazását idegsejtekben a lehetséges neuroprotektív hatások érdekében.

Hivatkozások

1. Formica, JV; Regelson, W. A kvercetin és a rokon bioflavonoidok biológiájának áttekintése. Food Chem. Toxicol. 1995, 33, 1061–1080. [CrossRef]

2. Materska, M. Kvercetin és származékai: Kémiai szerkezet és bioaktivitás – Áttekintés. Pol. J. Food Nutr. Sci. 2008, 58, 407–413.

3. Wang, TY; Li, Q.; Bi, KS Bioaktív flavonoidok gyógynövényekben: szerkezet, aktivitás és biológiai sors. Asian J. Pharm. Sci. 2018, 13, 12–23. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Andrea, G. Quercetin: A flflavonol sokoldalú terápiás alkalmazásokkal? Fitoterápia 2015, 106, 256–271. [CrossRef]

5. Araújo, MV; Queiroz, AC; Silva, JFM; Silva, AE; Silva, JKS; Silva, GR; Silva, ECO; Souza, ST; Fonseca, EJS; Camara, CA; et al. A flavonoidok sejthalált indukálnak Leishmania amazonensisben: In vitro jellemzés áramlási citometriával és Raman spektroszkópiával. Elemző 2019, 144, 5232–5244. [CrossRef] [PubMed]

6. Faixová, D.; Hrˇcková, G.; Kubašková, TM; Mudro ˇnová, D. Válogatott izoflavonok parazitaellenes hatásai flflatworms-on. Helmintológia 2021, 58, 1–16. [CrossRef]

7. Manjolin, LC; Reis, MBG; Maquiaveli, CC; Santos-Filho, OA; Silva, ER Az étrendi flavonoidok, a fisetin, a luteolin és származékaik gátolják az arginázt, a Leishmania (Leishmania) amazonensis fertőzés központi enzimét. Food Chem. 2013, 141, 2253–2262. [CrossRef]

8. Tasdemir, D.; Kaiser, M.; Brun, R.; Yardley, V.; Schmidt, TJ; Tosun, F.; Rüedi1, P. A flflavonoidok és analógjaik antitripanoszomális és antileishmaniális hatásai: In vitro, in vivo, szerkezet-aktivitás kapcsolat és kvantitatív szerkezet-aktivitás kapcsolati vizsgálatok. Antimikrobiális. Agents Chemother. 2006, 50, 1352–1364. [CrossRef] 9. Lee, WJ; Hsiao, M.; Chang, JL; Yang, SF; Tseng, TH; Chang, CW; Chow, JM; Lin, KH; Lin, YW; Liu, CC; et al. A kvercetin mitokondriális eredetű apoptózist indukál a reaktív oxigénfajok által közvetített ERK aktiváció révén HL-60 leukémia sejtekben és xenograftban. Boltív. Toxicol. 2015, 89, 1103–1117. [CrossRef]

10. Drummond, EM; Harbourne, N.; Marete, E.; Martyn, D.; Jacquier, J.; O'Riordan, D.; Gibney, ER A gyulladást elősegítő biomarkerek gátlása a THP1 makrofágokban kamilla-, rétifű- és fűzfakéregből származó polifenolokkal. Phytother Res. 2013, 27, 588–594. [CrossRef]